一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法

1.本发明具体涉及一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，属于食品安全检测技术领域。


背景技术：

2.根据世界卫生组织公告，食源性致病菌是引发食品卫生问题的重要原因之一。食品中常见的食源性致病菌包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单增李食堂菌等，其传统的检测方法有微生物检验法、分子生物学法和酶联免疫吸附法(elisa)等，仪器设备昂贵、检测成本高、步骤繁琐，不能满足致病菌的实时快速检测要求。本发明提出了一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，克服传统方法的不足，提高食品中食源性致病菌检测的速度和准确性。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有检测技术中存在的技术缺陷，如：检测成本高、检测时间长、检测步骤繁琐等，本发明提供了一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，通过纳米可控自组装制备基于非酶杂交的上转换纳米荧光探针和超结构氮化碳比色探针，结合标准曲线法构建高灵敏特异性致病菌检测体系，实现食品中食源性致病菌的低成本、高灵敏和特异性检测。
4.具体的，本发明采取的技术方案是：一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，包括以下步骤：
5.步骤一，油酸涂层化铒基上转换纳米颗粒制备(oa
‑
ucnps
(er)
)：将一定质量的ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o和ercl3·
6h2o分散在甲醇溶液中，然后将均匀的混合液转移至三口烧瓶中，接着加入c
18
h
34
o2和c
18
h
36
，上述混合液在氮气环境下进行持续搅拌，接着，将温度升至100℃以上保持一定时间后降温至室温，然后逐滴加入nh4f和naoh混合甲醇分散液；接着在梯度升温直到甲醇挥发掉；然后继续在氮气环境下加热搅拌，最终得到oa
‑
ucnps
(er)
。
6.步骤二，羧基修饰的上转换纳米颗粒制备(ucnps
‑
cooh)：采用配体交换法利用氯仿和甲苯混合聚丙烯酸，加入到oa
‑
ucnps
(er)
溶液中搅拌过夜后离心得到ucnps
‑
cooh；
7.步骤三，ucnps
‑
cooh的表面发夹结构探针修饰(ucnps
‑
h1和ucnps
‑
h2)：将氨基修饰的两个发夹探针h1和h2通过酰胺缩合反应进行连接，具体为将ucnps
‑
cooh和nhs以及edc在冰水浴中混合搅拌，然后进行离心清洗，接着加入h1溶液进行反应，最后离心得到ucnps
‑
h1；ucnps
‑
h2的制备步骤同上。
8.步骤四，荧光比色传感体系的构建：首先将致病菌的特异性适配体和其对应的半互补链进行杂交反应得到半双链结构，然后加入c3n4、ucnps
‑
h1和ucnps
‑
h2，即为最终建成体系；
9.步骤五，食源性致病检测方法建立：在检测体系中分别加入不同浓度的致病菌溶液，体系混合后，接着加入tmb和h2o2进行催化显色反应，然后进行荧光信号采集，利用标准
曲线法建立定量模型；
10.进一步，步骤五中还包括，将二维纳米材料c3n4的催化比色性能、dna自组装特性以及上转换纳米荧光稳定的发光特点进行了结合，能够提高检测的灵敏度。
11.进一步，所述ucnps
‑
h1和ucnps
‑
h2既能够作为荧光信号探针，也作为能够影响c3n4催化比色性能的触发元件，提高检测体系的比色功效，方便初步的裸眼定性判别。
12.进一步，步骤一中，所述ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o和ercl3·
6h2o的质量比例范围为：(2
‑
20)∶(1
‑
4)∶(0.1
‑
0.4)；c
18
h
34
o2和c
18
h
36
的用量范围为：(1
‑
5)∶(3
‑
8)；nh4f和naoh的用量范围为(2
‑
6)∶(4
‑
8)。
13.进一步，步骤二中，加入氯仿和甲苯体积范围为(2∶3)，聚丙烯酸质量范围为1
‑
100mg。
14.进一步，步骤三中，ucnps
‑
cooh和nhs以及edc的用量比例范围为(1
‑
2)∶(1
‑
3)∶(0.1
‑
2)；h1和h2的用量范围为1
‑
500μl。
15.进一步，步骤四中，所加入的c3n4、ucnps
‑
h1和ucnps
‑
h2比例范围为(1
‑
6)∶(1
‑
2)∶(1
‑
2)。
16.进一步，步骤五中，所加入的tmb和h2o2的比例为(1
‑
10)∶(0.1
‑
2)。
17.与现有检测技术相比，本发明的有益效果如下：
18.1.本发明公开一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，通过纳米可控自组装制备基于非酶杂交的上转换纳米荧光探针和超结构氮化碳比色探针，结合标准曲线法构建高灵敏特异性致病菌检测体系，实现食品中食源性致病菌的低成本、高灵敏和特异性检测。
19.2.本发明构建的光学传感检测体系，将二维纳米材料c3n4的催化比色性能、dna自组装特性以及上转换纳米荧光稳定的发光特点进行了结合，能够提高检测的灵敏度。
20.3.本发明构建的光学传感检测体系，ucnps
‑
h1和ucnps
‑
h2既能够作为荧光信号探针，也作为能够影响c3n4催化比色性能的触发元件，提高检测体系的比色功效，方便初步的裸眼定性判别。
21.本发明建立的一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法对金黄色葡萄球菌的检测范围为27
‑
27
×
106cfu/ml，检测限位2cfu/ml，整个检测流程可以在1h内完成，比传统平板计数法速度更快，具有在线应用的潜力。
附图说明
22.图1本发明制备的oa
‑
ucnps
(er)
和ucnps
‑
cooh的透射电镜图；a为oa
‑
ucnps
(er)
的透射电镜图；b为ucnps
‑
cooh的透射电镜图；
23.图2本发明基于检测体系的原理验证图；
24.图3本发明基于荧光探针的对金黄色葡萄球菌的检测标准曲线；
具体实施方式
25.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所
获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
27.实施例1：
28.本发明公开一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法，具体步骤为：
29.步骤一，油酸涂层化铒基上转换纳米颗粒制备(oa
‑
ucnps
(er)
)：将0.2366g的ycl3·
6h2o、0.0775g的ybcl3·
6h2o和0.0076g的ercl3·
6h2o分散在甲醇溶液中，然后将均匀的混合液转移至三口烧瓶中，接着加入6ml的c
18
h
34
o2和15ml的c
18
h
36
，上述混合液在氮气环境下进行持续搅拌，接着，将温度升至100℃以上保持30min后降温至室温，然后逐滴加入0.1482g的nh4f和0.1g的naoh混合甲醇分散液；接着在梯度升温直到甲醇挥发掉；然后继续在氮气环境下加热搅拌，最终得到oa
‑
ucnps
(er)
。
30.步骤二，羧基修饰的上转换纳米颗粒制备(ucnps
‑
cooh)：采用配体交换法利用氯仿和甲苯(共5ml)混合聚丙烯酸200mg，加入到30mg的oa
‑
ucnps
(er)
溶液中搅拌过夜后离心得到ucnps
‑
cooh；
31.步骤三，ucnps
‑
cooh的表面发夹结构探针修饰(ucnps
‑
h1和ucnps
‑
h2)：将氨基修饰的两个发夹探针h1和h2通过酰胺缩合反应进行连接，具体为将2mg的ucnps
‑
cooh和4mg的nhs以及2mg的edc在冰水浴中混合搅拌，然后进行离心清洗，接着加入20μl的h1溶液进行反应，最后离心得到ucnps
‑
h1；ucnps
‑
h2的制备步骤同上。
32.步骤四，荧光比色传感体系的构建：首先将致病菌的特异性适配体和其对应的半互补链进行杂交反应得到半双链结构，然后加入10μl c3n4、50μl ucnps
‑
h1和50μl ucnps
‑
h2，即为最终建成体系；
33.步骤五，金黄色葡萄球菌检测方法建立：在检测体系中分别加入不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液，体系混合后，接着加入10μl tmb和10μl h2o2进行催化显色反应，然后进行荧光信号采集，建立菌浓度和荧光强度之间的线性关系标准曲线，结果显示菌落总数和荧光强度的线性关系为y＝958.92x+230.59，r2＝0.9901。
34.实施例2：对牛奶样品，采用本发明实施例1所述方法和步骤，对牛奶中金葡菌含量进行测定，测定结果表1所示，可以看出本发明的方法与标准方法具有较高的符合度，表明本发明的方法可高精度检测牛奶中致病菌含量。
35.表1本发明方法与标准方法检测牛奶中金葡菌含量
[0036][0037]
综上，本发明通过通过纳米可控自组装制备基于非酶杂交的上转换纳米荧光探针和超结构氮化碳(c3n4)比色探针，结合标准曲线法构建高灵敏特异性致病菌检测体系，合成荧光上转换纳米材料，并在其表面修饰发夹结构探针，作为出发氮化碳催化比色的元件，将致病菌的特异性适配体和其对应的半互补链进行杂交反应得到半双链结构，然后加入c3n4、
ucnps
‑
h1和ucnps
‑
h2，制备成牛奶中致病菌检测体系。所构建的牛奶中致病菌检测体系既可以通过比色反应初步进行定性判别，也可以通过荧光探针完成对各种致病菌的定量分析。
[0038]
虽然结合附图描述了本发明的实施方式，但是本领域技术人员可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下做出各种修改和变型，这样的修改和变型均落入由所附权利要求所限定的范围之内。