离子色谱法定量测定黄瓜中丙醇二酸含量的方法

1.本发明涉及离子色谱法定量测定黄瓜中丙醇二酸含量的方法。


背景技术：

2.丙醇二酸(propanedioic acid,2
‑
hydroxy)又名羟基丙二酸，是一种小分子有机酸，广泛存在于瓜类蔬菜中，能与人体唾液融合产生发涩的口感。丙醇二酸能有效地抑制体内糖类转化为脂肪，防止脂肪堆积，且不妨碍糖类物质向人们提供热量和能量，还能把多余的脂肪消耗掉，对防治高血压、动脉粥样硬化、减肥有良好的效果。由于人体自身不能合成丙醇二酸，一般是通过饮食获取。黄瓜果实是植物有机型丙醇二酸的重要来源之一。随着人们对健康和美好生活的追求，越来越看重黄瓜在保健、美容、减肥方面的作用，丙醇二酸含量高低也成为了衡量黄瓜及其加工品保健功能的重要指标之一。
3.目前国内外尚无标准化的丙醇二酸鉴定、检测方法，针对黄瓜中丙醇二酸的含量分析也鲜有报道，唯一采用的高效液相色谱法，存在前处理繁琐，分离度较低、检测耗时等问题。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了离子色谱法定量测定黄瓜中丙醇二酸含量的方法。本发明通过对样品前处理和仪器工作条件进行优化，建立了离子色谱法测定黄瓜中丙醇二酸含量的分析方法。该方法具有样品前处理简单，灵敏度高，稳定性好等优点，适合批量样品的检测，可为黄瓜育种以及生产栽培、品质调控等提供准确可靠的技术手段。
5.本发明提供离子色谱法测定黄瓜中丙醇二酸含量的方法，步骤如下：
6.s1、供试液的制备：将待检测黄瓜匀浆后高速冷冻离心，过滤取滤液；
7.s2、采用离子色谱仪分析步骤s1所述供试液的峰面积并与丙醇二酸标准曲线进行比较，得到供试液中丙醇二酸的浓度，进而得出待检测黄瓜中丙醇二酸的含量；
8.所述离子色谱仪的检测条件为：柱温：30℃；进样体积：10
‑
25μl；淋洗液：koh溶液，流速：1.0ml/min；阴离子分析柱：ionpac as11
‑
hc(250mm
×
4mm)；保护柱：ionpac ag11
‑
hc(50mm
×
4mm)。ionpac as11
‑
hc阴离子交换分离柱用koh做淋洗液，可用于有机酸阴离子的快速分离，用ionpac ag11作保护柱，做梯度淋洗时可除去来自淋洗液中污染的阴离子。
9.作为优选，步骤s1中，所述高速冷冻离心是在4℃的条件下，8000
‑
10000r/min离心12
‑
15min。离心机转速过低，液体、固体不能很好地分离；转速过高则有安全隐患。
10.作为优选，步骤s1中，所述离心后，还包括将上清液通过活化后的cnwbond lc
‑
c18固相萃取柱的步骤，目的是萃取、分离、浓缩样品，纯化并富集样品中的丙醇二酸。本发明利用固相萃取法降低了黄瓜丙醇二酸提取物中的复杂因素的干扰，提高了检测准确性，且纯化步骤简单和快捷。
11.作为优选，步骤s1中，所述过滤时，孔径大小为0.22μm。
12.作为优选，步骤s2中，离子色谱的洗脱方式分为等度洗脱和梯度洗脱，等度洗脱主要针对单个或少数化合物的分离，梯度洗脱主要针对不同种类多个化合物的分离。因本试验要分离的物质比较复杂，所以采用了梯度洗脱的方式。在0
‑
30min的各时间段，从6.0mmol/l
‑
70.0mmol/l，改变淋洗液浓度，以达到丙醇二酸最佳的分离条件，且保证连续进样时不受上一个样品的干扰。淋洗液梯度淋洗程序如下：
[0013][0014]
作为优选，步骤s2中，所述供试液中丙醇二酸的出峰时间为16.397
±
0.070min。
[0015]
作为优选，所述待检测黄瓜中丙醇二酸含量检测范围为0.1～10.0mg/ml。
[0016]
在黄瓜样品提取过程中，本发明采用了将样品匀浆后直接高速冷冻离心的提取方式，这是因为丙醇二酸含有两个羧基和一个羟基，同时具有酸和醇的性质，易溶于水。黄瓜中95％以上成分是水，采取此方法既简便快捷，又有效地保证了提取效率。在黄瓜样品提取过程中，对离心提取时间(5
‑
20min)、离心机转速(5000
‑
10000r/min)进行了优化，实验表明，离心提取时间为5
‑
11min时样品不能很好地分离，提取时间多于12min才能有效分离液体和固体，多于15分钟则降低了实验效率，故选择最佳离心提取时间为12
‑
15min。离心机转速5000r/min时，样品不能很好地分离，大于8000r/min才能有效分离液体和固体，大于10000r/min则使实验风险提高，故选择最佳离心机转速为8000
‑
10000r/min。
[0017]
丙醇二酸在高温条件下易分解，所以气相色谱等检测方法均不适合。基于对丙醇二酸理化性状、稳定性等方面的综合考虑，本发明选用离子色谱法分析黄瓜中丙醇二酸含量，对柱温分别25℃、30℃、35℃，进样体积分别为5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，淋洗液梯度洗脱进行了优化，实验表明，柱温25℃和35℃，样品的分离效果较差，故最佳柱温选择为30℃；进样体积为5μl时丙醇二酸峰面积较小，积分误差大，进样体积为10μl以上均能满足检测要求，故最佳进样体积选择为10
‑
25μl；淋洗液梯度在0
‑
30min的各时间段，从6.0mmol/l
‑
70.0mmol/l，改变不同淋洗液浓度，以达到丙醇二酸最佳的分离条件，且保证连续进样时不受上一个样品的干扰。淋洗液梯度淋洗程序为：0～5min，氢氧化钾浓度为6.0mmol/l；5～10min，氢氧化钾浓度为40.0mmol/l；10～20min，氢氧化钾浓度为70.0mmol/l；20～25min，氢氧化钾浓度为40.0mmol/l；20～30min，氢氧化钾浓度为6.0mmol/l。
[0018]
洗脱方式为梯度淋洗，通过试验，采用文中的洗脱梯度即可将黄瓜中不同种类多个化合物逐一分离，可准确地检测出不同黄瓜品种中丙醇二酸含量。
[0019]
本发明建立了离子色谱法测定黄瓜中丙醇二酸含量的分析方法：选用以氢氧化钾为淋洗液的阴离子高容量分析柱ionpac as11
‑
hc，抑制型电导检测，样品不用进行复杂的前处理和预浓缩，直接采用高速冷冻离心的提取方式然后进样测定，通过梯度淋洗的洗脱方式，将复杂样品中不同种类多个化合物的逐一分离。通过试验发现，丙醇二酸含量在0.1～10.0mg/ml范围内呈现良好的线性关系，相关系数为0.9982，检出限为0.3μg/ml，定量限为1μg/ml，回收率为98.15％～99.58％。与同类分析方法相比，该方法运行时间短、该方法
精密度高、准确度高、重现性好，不受其他杂质干扰，为黄瓜中丙醇二酸的定量检测提供了准确可靠的技术手段，可满足黄瓜育种、品质调控、生产栽培的需要。
附图说明
[0020]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0021]
图1为丙醇二酸标准溶液色谱图。
[0022]
图2为试样色谱图。
[0023]
图3为丙醇二酸标准工作曲线。
[0024]
图4为不同品种黄瓜样品的色谱图。
具体实施方式
[0025]
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
[0026]
实施例1
[0027]
1材料与方法
[0028]
1.1试验材料
[0029]
供试黄瓜由北京农学院植物科技学院园艺系提供。
[0030]
1.2仪器与试剂
[0031]
离子色谱仪(ics
‑
1100型)，配备淋洗液在线发生装置、电导检测器、asrs型抑制器、25μl定量环、chromeleon数据处理系统，美国thermo fisher公司产品；高速冷冻离心机(h1850r)，广州市深华生物技术有限公司生产；组织匀浆机(omni mixer)，美国omni公司；cnwbond lc
‑
c18(6.0ml)spe小柱，上海安谱实验科技股份有限公司；0.22μm水系聚醚砜pes滤膜，颇尔公司。
[0032]
丙醇二酸标准品，美国阿法埃莎(中国)化学有限公司，纯度98％；实验用水符合gb/t 6682－2008《分析实验室用水规格和试验方法》中一级水的规定。
[0033]
1.3试验方法
[0034]
1.3.1样品制备
[0035]
采用盛果期成熟黄瓜，用组织匀浆机加工成匀浆，将其倒入10ml离心管中，准确称取重量，4℃的条件下，10000r/min离心15min，取上清液通过活化后的cnwbond lc
‑
c18固相萃取柱(活化过程为：先加2～3ml甲醇，再加2～3ml 1:1的甲醇
‑
水溶液，之后加2～3ml水，2min后再加2～3ml水，静置活化35min)，弃去1ml，因前段溶液杂质较多，余下部分通过0.22μm水性滤膜针头滤器，取滤液进行检测。
[0036]
1.3.2色谱条件
[0037]
阴离子分析柱：ionpac as11
‑
hc(250mm
×
4mm)；
[0038]
保护柱：ionpac ag11
‑
hc(50mm
×
4mm)；
[0039]
柱温：30℃；
[0040]
抑制器电流：174ma；
[0041]
电导检测池温度：35℃；
[0042]
进样体积：25μl；
[0043]
淋洗液：koh溶液，由淋洗液发生器在线产生；
[0044]
流速：1.0ml/min；
[0045]
淋洗液梯度淋洗程序见表1。
[0046]
表1淋洗液梯度淋洗程序
[0047][0048]
1.3.3标准溶液的制备
[0049]
1.3.3.1丙醇二酸标准储备液(10mg/ml)：准确称取1.0000g丙醇二酸，用水溶解并转移至100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
[0050]
1.3.3.2丙醇二酸标准工作液：移取标准储备液，加水逐级稀释，制成系列标准工作液，浓度分别为0.1mg/ml、0.25mg/ml、1.0mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml、7.5mg/ml、10mg/ml。
[0051]
2结果与分析
[0052]
2.1检测谱图
[0053]
在1.3.2色谱条件下，丙醇二酸标准品溶液、试样溶液色谱图见图1～2。
[0054]
图1为丙醇二酸标准溶液色谱图。
[0055]
图2为试样色谱图。
[0056]
试验可知丙醇二酸标准溶液的保留时间16.397min，黄瓜样品中丙醇二酸的出峰时间为16.407min(如图2)。
[0057]
2.2线性关系、检出限和定量限
[0058]
将1.3.3配制好的标准溶液，按照1.3.2的色谱条件测定，以丙醇二酸的浓度(mg/l)为横坐标，色谱峰面积值为纵坐标作图(如图3)，计算标准曲线的回归方程为:y＝73.98x+3.205，r2＝0.9982，表明丙醇二酸在0.1～10.0mg/ml的范围内线性关系良好。将对照品溶液逐级稀释后,以信噪比s/n＝3时的质量浓度为检出限，s/n＝10时的质量浓度为定量下限。计算得出检出限为0.3μg/ml，定量限为1μg/ml。
[0059]
图3为丙醇二酸标准工作曲线。
[0060]
2.3精密度
[0061]
按照1.3.1方法对黄瓜样品进行处理，制备样品溶液,按照1.3.2项的色谱条件进行样品测定，重复测定6次，计算黄瓜样品中丙醇二酸的含量及rsd值(见表2)，以考察方法的精密度。结果表明，该黄瓜样品丙醇二酸含量平均值为1.62mg/g，rsd值为3.60％，方法精密度较高。
[0062]
表2精密度试验(n＝6)
[0063][0064]
2.4加标回收率
[0065]
取已知丙醇二酸含量的黄瓜匀浆于10ml离心管中，准确称取重量，分别加入精密称取的丙醇二酸10.00mg、20.00mg、50.00mg，按照1.3.1方法进行处理，制备样品溶液，按照1.3.2项的色谱条件进行样品测定，对每个添加水平做3次平行试验，计算丙醇二酸的平均回收率及rsd值(见表3)，以考察方法的准确性。结果表明，丙醇二酸的平均回收率在98.15％～99.58％，rsd值为1.44％～1.66％，方法准确度高，符合黄瓜中丙醇二酸含量的分析测定要求。
[0066]
表3加标回收试验结果
[0067][0068][0069]
2.5稳定性考察
[0070]
取黄瓜样品按照1.3.1方法对黄瓜样品进行处理，制备样品溶液，按照1.3.2项的色谱条件分别于0、4、8、12、16、20、24h进样，进行样品测定，计算rsd值为0.83％，表明供试溶液在24h内稳定，结果见表4。
[0071]
表4稳定性试验
[0072][0073]
2.6实际试样测定
[0074]
选取不同品种黄瓜样品10份，经1.3.1制备后按1.3.2色谱条件上机测定，结果见表5和图4。从表5中可知，本试验10个黄瓜品种中丙醇二酸的含量在1.62～6.92mg/g之间。
[0075]
图4为不同品种黄瓜样品的色谱图。图中a
‑
j按照前后顺序依次为黄瓜样品编号为s1
‑
s10的色谱图。
[0076]
表5黄瓜中丙醇二酸含量(n＝3)
[0077][0078][0079]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。