一种定量检测血液中肌肉肌醇的方法

本发明一种定量检测血液中肌肉肌醇的方法。

背景技术：

1、肌肉肌醇(myo-inositol)又称六羟基环己烷，是一种葡萄糖衍生出的多元醇。肌肉肌醇在调节多种细胞功能中起着至关重要的作用，它是真核细胞次级信使的结构基础，特别是作为肌醇磷酸盐、磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇磷酸酯脂质的前体。因此，它有助于重要的功能和结构作用，包括细胞生长和存活，成骨，繁殖，神经系统的发展。肌肉肌醇代谢异常与几种疾病状态的发展有关，如神经管缺陷，唐氏综合征，阿尔茨海默病和糖尿病肾小球疾病等。先前的研究表明，肌肉肌醇在人类癌细胞和动物癌症模型中具有化学预防和化疗特性，包括前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌和肺癌。同时，肌肉肌醇已被测试为多种病症的药理学干预，包括抑郁症、惊恐障碍和强迫症等。因此，肌肉肌醇作为药理剂和代谢标志物的潜在应用，需要建立血清中肌肉肌醇的测定方法。

2、血液中的肌肉肌醇通过掺入细胞或排泄、再吸收和肾脏氧化而保持在一定浓度，正常的血清肌肉肌醇浓度在18–41umol/l。目前，已开发出各种分析方法来检测肌肉肌醇，包括气相色谱-质谱(gc/ms)、高效液相色谱(hplc)、液相色谱质谱(hplc/ms)、液相色谱脉冲安培检测和酶循环检测。在这些检测技术中，大多数通常比较复杂且耗时长，仪器价钱昂贵，体积庞大，对操作人员技术要求高。此外它们需要繁琐的样本预处理，因此应用受到限制。与这些仪器方法相比，电化学方法由于操作简便、样品用量少、灵敏高、易于微型化等特点在小分子化合物超灵敏检测方面显示出广阔的应用前景，成为方法学研究的新热点，但目前还没有将电化学运用到血液中肌肉肌醇的含量检测的报道。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种定量检测血液中肌肉肌醇的方法，它是采用电化学方法检测血液中的肌肉肌醇。

2、进一步地，它包括用差分脉冲伏安法(dpv法)测定肌肉肌醇溶液、空白血清溶液和待测血液样品溶液的响应电流值，根据肌肉肌醇溶液与空白血清溶液的浓度和相应电流值建立的肌肉肌醇标准曲线计算血液样品中肌肉肌醇含量。

3、更进一步地，它具体包括如下步骤：

4、(1)肌肉肌醇标准曲线的建立

5、a、系列浓度标准工作溶液的制备：取肌肉肌醇，加水溶解，稀释成系列浓度标准溶液，分别取系列浓度标准溶液，加空白血清混匀，再加乙腈混匀，离心，取上清液干燥，残渣溶于甘氨酸-naoh缓冲液，即得系列浓度标准工作溶液；

6、b、空白样品溶液的制备：取空白血清，加乙腈混匀，离心，取上清液干燥，残渣溶于甘氨酸-naoh缓冲液，即得空白样品溶液；

7、c、分别吸取空白样品溶液和系列浓度标准工作溶液，加氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液(nad+)和肌肉肌醇经肌醇脱氢酶溶液(idh)混匀，反应10～30min，取反应混合液，附着于丝网印刷碳电极上，再接入电化学工作站，采用差分脉冲伏安法(dpv法)测定响应电流值，以肌肉肌醇浓度为x轴，以系列浓度标准工作溶液与空白样品溶液的响应电流值的差值为y轴，绘制肌肉肌醇标准曲线；

8、(2)待测样品中肌肉肌醇含量测定：

9、d、待测样品溶液的制备

10、取血清样品，以步骤b相同的方法制备，得待测样品溶液；

11、e、待测样品中肌肉肌醇的含量测定

12、取待测样品溶液，以步骤c相同的方法测定响应电流值，根据步骤(1)的标准曲线计算待测样品中肌肉肌醇含量。

13、进一步地，步骤a所述系列浓度标准溶液、空白血清和乙腈的体积比为1：9：40。

14、进一步地，所述系列浓度标准溶液的浓度为50～5000.0μmmol/l，优选50.0μmmol/l，100.0μmmol/l，200.0μmmol/l，500.0μmmol/l，1000.0μmmol/l，2000.0μmmol/l，4000.0μmmol/l和/或5000.0μmmol/l。

15、进一步地，步骤b所述空白血清与乙腈的体积比为9～13：30～50，优选10：40。

16、进一步地，步骤a和步骤b所述混匀为涡旋混匀；所述离心温度2～8℃，转速10000～20000rpm/min，时间8～15min，优选离心温度4℃，转速13300rpm/min，时间12min。

17、进一步地，步骤a和步骤b所述干燥为氮气流干燥；所述氮气流干燥的温度为60～100℃，优选80℃。

18、进一步地，步骤a和步骤b所述甘氨酸-naoh缓冲液的加入量为乙腈体积的1/10～1/15，优选1/12。

19、进一步地，所述甘氨酸-naoh缓冲液的ph值为9～11，其中甘氨酸含量为500～600mmol/l，优选ph值为10.3，甘氨酸含量为550mmol/l。

20、进一步地，步骤c所述空白样品溶液或系列浓度标准工作溶液，与nad+溶液和idh溶液的体积比为25～45：3～7：3～7，优选40：5：5。

21、更进一步地，所述nad+溶液的浓度为100～200mmol/l，idh溶液的浓度为4000～5000u/l，优选nad+溶液的浓度为160mmol/l，idh溶液的浓度为4500u/l。

22、进一步地，步骤c所述反应温度为20～30℃，时间20min。

23、进一步地，步骤c所述丝网印刷碳电极上附着的反应混合液体积为20～60μl，优选40μl。

24、进一步地，步骤c所述dpv法的参数为电压0.1～0.73v、增量0.005v、振幅0.10v、脉宽0.05s和脉冲周期0.2s。

25、本发明一种定量检测血液中肌肉肌醇的方法，与现行的肌肉肌醇的分析检测方法相比，本发明具有制备方法简单、快速、稳定性好、检测成本低、适用于现场检测等优点，可用于血清中肌肉肌醇的检测。

26、经验证，本发明方法灵敏度高，分析速度快，线性范围宽、重现性好、抗干扰能力强，检测限低至1.0μm(s/n＝3)，定量限为2.5μm(s/n＝10)，分析检测范围为5.0–500.0μmol/l。对不同浓度肌肉肌醇标准液配制低(10.0μmol/l)、中(100.0μmol/l)和高(200.0μmol/l)三种工作液，同一天连续五次测定，同时连续测定五天，日内精密度为3.2％–6.2％，日间精密度为7.1％–9.0％。日内回收率为96.6％–106％，日间回收率为90.3％–103％。

27、本发明方法在对未加入胆红素和血红蛋白的血清标本以及加入不同浓度胆红素(0.0–200.0)μmol/l和血红蛋白(0.0–16.0)mg/ml的血清标本的肌肉肌醇浓度进行测定，结果表明，血清中血红蛋白和胆红素分别在(0.0–8.0)mg/ml和(0.0–160.0)μmol/l时对血清肌肉肌醇的测定无明显干扰，结果准确可靠，可用于临床血液检测。

28、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

29、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。