基于双链特异性核酸酶辅助的可控释放电化学DNA水凝胶复合材料的制备方法

基于双链特异性核酸酶辅助的可控释放电化学dna水凝胶复合材料的制备方法
技术领域
1.本发明涉及基于双链特异性核酸酶（dsn）辅助的可控释放电化学dna水凝胶复合材料的制备方法及其应用于沙眼衣原体16s rrna的电化学检测，属于生物传感领域。


背景技术：

2.可控释放系统可以响应特定刺激，例如核酸，光，分子等，来改变其理化性质。基于水凝胶构建的大量控释系统已被设计并由于其出色的负载能力和刺激响应能力而广泛用于智能药物输送和靶向癌症治疗。近来，可控释放系统已经与多种检测技术相结合，以开发针对不同目标的生物分析传感器。电化学检测技术是一种基于物质电化学性质的定性定量检测技术，只需要简单的设备即可具有高灵敏度。据我们所知，开发结合了控制释放系统和电化学检测优势的生物传感器的研究很少，尽管这些传感器可能具有结构简单，信号探针负载能力，灵敏度和选择性高的优点。将两者进行结合可以整合水凝胶与电化学系统的优势，构建新型生物传感器用于生物分析。
3.沙眼衣原体 (ct) 是性传播疾病最常见的病原体之一。 ct感染的一个显着特征是无症状，尤其是在女性感染者中。 更重要的是，虽然没有明显症状，但会引起盆腔炎、输卵管不孕等严重的后遗症。 因此，他们需要快速的护理点检测和广泛的筛查，以促进无症状感染的识别并使早期治疗成为可能，这需要快速灵敏的生物传感器作为支持。基于dsn辅助的可控释放电化学dna水凝胶复合材料由于其sa的碱基序列的与ct 16s rrna完全配对，从而能够响应16s rrna的刺激。利用这种响应，对ct 16s rrna进行方便快速的检测对于其无症状感染的识别和早期治疗具有重要意义。
4.本发明的目的在于提供一种可控释放的电化学dna水凝胶复合材料的制备方法，通过精心设计其dna探针序列，并将辣根过氧化物酶 (hrp) 均匀包埋在水凝胶中，使其能在dsn辅助下，为生物传感技术领域提供了一种用于ct 16s rrna电化学检测的复合材料。


技术实现要素：

5.(一)本发明的目的是提供一种基于dsn辅助的可控释放电化学dna水凝胶复合材料，该材料的化学组分为丙烯酰胺、过硫酸铵(aps)、四甲基二乙胺(temed)、部分互补的丙烯酰胺基修饰dna探针a和b（sa和sb），hrp填充在水凝胶中充当电化学信号分子。
6.(二) 本发明的目的是提供一种基于dsn辅助的可控释放电化学dna水凝胶复合材料的制备方法。本发明的目的是这样实现的，包括以下步骤：（1）将sa或sb与丙烯酰胺溶液混合，真空干燥以除去氧气。然后加入的新鲜制备的过硫酸铵(aps)和四甲基二乙胺(temed)，加热以形成聚合物a (p
‑
sa)或聚合物b(p
‑
sb)。
7.（2）将步骤（1）中的p
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sa，p
‑
sb和 辣根过氧化物酶 (hrp)以特定比例混合，并在充分摇动下加热以形成dsn辅助的可控释放电化学水凝胶。
8.（3） 所述步骤（1）中dna链sa、sb浓度均为100μm，丙烯酰胺溶液质量体积比为25%，aps质量体积比为10%，temed质量体积比为10％。聚合物合成过程中，加入sa或sb、丙烯酰胺溶液、aps和temed体积比为80μl：16μl：1μl：1μl。p
‑
sa 或p
‑
sb合成加热温度为37℃ 60分钟。
9.（4）所述步骤（2）的p
‑
sa，p
‑
sb用量均为2.5μl，hrp酶浓度为100 mu, 用量为1 μl，成胶混合温度为65℃,时间为10分钟。
10.（5）所述步骤(1)的dna链的序列: 链a(sa): acrydite
‑
aaaaacttaggggccga c taaccc，链b (sb): acrydite
‑
aaaagggtta c tcggcc。
11.(三)本发明基于dsn辅助的可控释放电化学dna水凝胶复合材料的应用以该可控释放的电化学水凝胶复合材料作为电化学传感器用于ct 16s rrna的检测，包括以下步骤：（1）将不同浓度的ct 16s rrna分别和dsn一起加入到上述dna水凝胶复合材料内，对sa
‑
sb链进行竞争结合，形成sa
‑
rrna结构。后者被dsn识别，其中sa被酶解，rrna游离去结合新的sa，形成循环放大效应。最终，水凝胶裂解，包埋的hrp得到释放。分别收集水凝胶上清液，将其吸附于金电极之上，以tmb和h
202
混合溶液为底物，使用由chi660e电化学工作站测量各混合体系的电化学信号。
12.（2）根据收集的各混合体系的电化学信号，绘制标准曲线；（3）将待测样品和dsn一起加入制备完成的电化学水凝胶复合材料上，收集反应后所得的上清液，将其吸附于金电极之上，以tmb和h202混合溶液为底物，使用由chi660e电化学工作站测量各混合体系的电化学信号。将该电化学信号结合标准曲线，得出待测样品中ct浓度。
13.所述步骤（1）和（3）的标准样品及待测样品体积、dsn体积、收集上清液体积、tmb和h
202
混合溶液的用量比为20
µ
l ：1
µ
l ：10
µ
l ：2 ml。
14.本发明的有益效果：在一般的可控释放dna水凝胶中，dna探针的每次分离都需要一条目标链与之杂交，当靶rna的数量较少时，其不能对dna水凝胶产生有效的刺激。本发明的dna水凝胶复合材料，其中dna探针a (sa)与b (sb)的碱基序列经过特殊设计，其能在双链特异性核酸酶(dsn)的辅助下，被少量靶rna反复刺激，形成循环酶解，产生更加明显的响应，释放更多的电化学信号分子。因此，相较于一般的可控释放dna水凝胶材料，具有更优异的反应速率和灵敏度。
附图说明
15.图1为本发明的dna水凝胶复合材料的制备方法示意图；图2为本发明的基于dsn辅助的可控释放电化学dna水凝胶复合材料对16s rrna标准样品进行分析检测的工作曲线，图中：a）空白缓冲液； b）没有靶rrna的dna水凝胶上清液； c）具有10pm靶标反应的dna水凝胶上清液。
具体实施方式
16.以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
17.如图1所示，丙烯酸酯修饰的dna链a（sa）和dna链b（sb）与丙烯酰胺单体共聚，分别获得相对应的dna
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聚丙烯酰胺复合物，即聚合物链a（p
‑
sa）和聚合物链b（p
‑
sb）。将二者混合，p
‑
sa和p
‑
sb杂交形成16s
‑
rrna响应水凝胶，其中封装了hrp。由于sa
‑
sb杂交双链（dsdna）具有一组错配的碱基对，因此如果没有目标rrna，dsn将无法对其进行切割。但是，其中的sa与靶序列完全互补，因此当存在靶序列时，sa
‑
sb dsdna将被b靶rrna置换以形成sa
‑
rrna杂交双链体。然后，dna
‑
rrna杂交双链体被dsn特异性识别。sa被dsn酶解，释放靶rrna并回收用于另一轮杂交和酶解。因此，在该策略中，由于目标rrna被dsn回收，因此水凝胶的塌陷和hrp的释放仅仅需要极少量的靶rrna。然后，释放的hrp吸附于工作电极，置于含有底物tmb和 h2o2的测定溶液中，tmb即可在传感器表面通过多个辣根过氧化物酶的催化放大氧化还原反应，在固定电位下测定tmb催化氧化产物的还原电流信号，则该电流信号得到放大，且信号大小与目标dna的浓度相关。
18.最终，可以检测到显著增强的电化学信号。该电化学信号与目标浓度呈正相关，从而实现对沙眼衣原体的定量检测。
19.实施例1：基于dsn辅助的可控释放电化学dna水凝胶复合材料的制备方法，步骤如下：（1）将sa或sb与质量分数比25％的丙烯酰胺溶液混合，真空干燥15分钟以除去氧气。然后加入质量分数10％的新鲜制备的aps和质量分数10％的temed，并在37℃下干燥60分钟以形成p
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sa或p
‑
sb。然后，将p
‑
sa，p
‑
sb，ne缓冲液和hrp混合，并在充分摇动下在65℃加热10分钟以形成dna水凝胶。
20.（2）步骤（1）中dna序列sa: acrydite
‑
aaaaacttaggggccga c taaccc，sb: acrydite
‑
aaaagggtta c tcggcc。聚合物p
‑
sa或p
‑
sb合成过程中，加入sa或sb、丙烯酰胺溶液、aps和temed的体积比为80μl ：16μl ：1μl ：1μl。dna水凝胶复合材料加热成胶过程中，p
‑
sa，p
‑
sb，ne缓冲液和hrp的体积比2.5μl ：2.5μl ：1μl：1μl。hrp酶活力单位为100 m u。
21.实施例2：基于实施例1制得的dsn辅助的可控释放电化学dna水凝胶复合材料对靶rna的检测步骤如下：（1）将20μl靶rrna序列或 20μl空白缓冲液分别与1μl dsn混合，然后分别添加到实施例1步骤（1）制备好的dna水凝胶中，形成混合物。将此混合物在35
°
c孵育60分钟后，轻轻摇动，取出10μl上清液，分别将其滴加到活化完毕的金电极上，静置待干。并且取10μl空白缓冲液也滴加到活化完毕的金电极上，静置待干，作为空白对照。
22.（2）步骤（1）中，靶rrna序列为ggguuagucggccccuaagu，浓度为10pm，dsn酶活力单位为10 m u。空白缓冲液为1
×
pbs缓冲液。
23.（3）将步骤（1）制得的金电极分别浸入到1 ml tmb底物溶液（k
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blue，neogen corporation，含h2o2)中，以铂丝电极为对电极，ag/agcl 为参比电极，记录电流
‑
时间曲线（初始电位：0伏；采样间隔：0.1秒；采样时间：100秒）。测定结果见图2。
24.图2中的各曲线显示了不同条件下，时间
‑
电流曲线的响应。将空白缓冲液滴在用捕获探针修饰的金电极上，得到了较低的电流信号（曲线a），这可能是由于tmb在没有hrp催化作用下，和h2o2之间的弱相互作用。当将未被靶rrna反应的dna水凝胶上清液滴加到金电极上时，观察到曲线信号有非常轻微的增加（曲线b），这可能是由于dna水凝胶包埋的hrp有
很小的一部分非特意泄漏。而当将具有靶rrna反应的dna水凝胶上清液滴加到用捕获探针修饰的金电极上时，出现了十分明显的i
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t曲线信号增强（曲线c）。结果表明，利用于dsn辅助的可控释放电化学dna水凝胶复合材料所构建的电化学传感器可用于识别靶rna序列。