一种干式免疫荧光定量法人和肽素（CPP）检测试剂盒的制作方法

一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及体外诊断免疫学测定分析领域，具体的说，涉及一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒。


背景技术：

2.和肽素（copeptin，cpp）于1972年由holwerda首次发现，是一种富含亮氨酸的糖肽，来源于avp原的c末端，由 39 个氨基酸组成 ，相对分子质量 5000 d。avp 原由l64 个氨基酸组成 ，包括信号肽和 3 个活性片段 ，即血管加压素（avp）、神经垂体激素运载蛋白ⅱ、和肽素（cpp）。早期的研究表明和肽素可能起着催乳素释放因子的作用，近年来的研究则提示和肽素在 avp 前体的结构形成过程中起着校正的作用，很可能是和肽素与钙连接蛋白/钙网织系统相互作用，使错误折叠的单体发生重新折叠，从而保证 avp 生物学效应的稳定。研究者首先发现的是体内avp 水平的上升与心绞痛，心肌梗死等心血管疾病预后呈显著相关，但由于avp 的血浆半衰期不足30min，体外测定相当困难。和肽素和avp有共同的前体，而和肽素数量与其正相关，且和肽素的检测所需标本量少、检测方法简便快捷、稳定性高，室温下和肽素在血浆或血清的稳定性可以达7天以上，在4℃时则可维持14天。故和肽素可作为直接测定 avp 浓度的替代物用于临床研究，有望成为这些疾病的临床预测标志因子。
3.和肽素检测的临床应用主要有以下几个方面：1、脑血管疾病方面；2、心血管疾病方面（如心力衰竭、急性心肌梗死、心肌缺血等）；3、在其它临床方面：（1）下呼吸道感染（包括社区获得性肺炎、慢性阻塞性肺炎急性加重期、急性支气管炎、哮喘急性发作等）；（2）严重创伤合并感染（如脓毒症、全身炎症反应综合征、心脏手术后入院患者等）；（3）用于尿崩症的诊断。
4.到目前为止，仅有四种技术被用于确定和肽素浓度：微管化学发光、放射免疫分析（ria）、电化学分析和酶联免疫分析（elisa）。虽然它们的灵敏度可以满足要求，但是检测时间太长，因此它仅用于科学研究，不用于临床。截至目前为止，和肽素的即时检验（poct）仍尚未报道，因此它在很大程度上限制了和肽素的临床价值。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是填补国内市场人和肽素（cpp）即时检验的空白，提供一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒，该试剂盒采用荧光微球进行标记，并且将荧光抗体固相在独立的结合垫上，降低了液相抗体缓冲液的储存温度要求；同时增加了检测样本类型，涵盖了血清、血浆和全血；本发明选用鸡igy和羊抗鸡igy配对抗体作为独立质控线抗体，与鼠源抗体交叉少，特异性好，质控线信号值稳定，有利于提高产品的准确性、重复性；处理样品垫中添加封闭剂，以最大程度降低干扰抗体对于免疫检测的影响，避免检测的假阳性或假阴性结果。
6.为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种干式免疫荧光定量法
人和肽素（cpp）检测试剂盒，包括盒体、上盖和试剂条，盒体和上盖相互卡扣连接，盒体和上盖之间形成容纳腔，试剂条位于容纳腔内，所述试剂条包括样品垫、全血过滤垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述吸水纸位于硝酸纤维素膜的一端，所述结合垫位于硝酸纤维素膜的另一端，所述全血过滤垫位于结合垫的远离硝酸纤维素膜的一端，所述样品垫位于全血过滤垫的远离结合垫的一端，所述硝酸纤维素膜上依次包被有质控c线、检测t线，质控c线设置在靠近吸水纸的一侧，检测t线设置在靠近结合垫的一侧；所述上盖上设置有加样孔和检测窗口，加样孔处于样品垫的上方，所述检测窗口处于检测t线和质控c线的上方；所述质控c线通过抗体包被液包被有羊抗鸡igy抗体，浓度为0.2
‑
4mg/ml，所述质控c线的抗体包被液为10mm pbs 中含有 0.5
‑
5wt %海藻糖进行配制；所述检测t线通过抗体包被液包被有鼠抗人cpp单克隆抗体，浓度为0.5
‑
3mg/ml，所述检测t线的抗体包被液为10mm pbs 中含有0.5
‑
5wt %蔗糖进行配制。
7.作为上述技术方案的进一步改进，所述结合垫固相有荧光抗体，荧光抗体包括荧光微球固相液和荧光微球标记的0.1
‑
1mg/ml的鼠抗人cpp单克隆抗体和0.1
‑
1mg/ml的鸡igy，所述荧光微球固相液按照20mm、ph 8.0 tris中含有0.01
‑
0.2wt % 酪蛋白、2
‑
5wt % 海藻糖、2
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10wt % 蔗糖、0.01
‑
10wt % pvp 和0.01
‑
5wt % 吐温进行配制。
8.作为上述技术方案的进一步改进，所述结合垫需经处理液预处理，所述处理液中含有便于荧光微球快速释放的大分子聚合物和非离子表面活性剂、保护荧光微球抗体活性的蛋白和增加标记抗体活性的糖类。
9.作为上述技术方案的进一步改进，所述处理液为10mm pbs，所述大分子聚合物为0.1wt %
‑
10wt % pvp、0.01wt %
‑
5wt %pva，所述非离子表面活性剂为0.01
‑
5wt %吐温，所述保护荧光微球抗体活性的蛋白为0.01
‑
10wt % bsa，所述增加标记抗体活性的糖类为1
‑
10wt % 海藻糖。
10.作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光微球标记的方法包括以下步骤：微球用两步法edc/sulfo
‑
nhs偶联抗体，微球在edc和sulfo
‑
nhs活化前用活化缓冲液（50 mm mes缓冲液ph 6.0）洗涤1次，离心，活化缓冲液复溶；按微球：edc：sulfo
‑
nhs质量比为1:0.1
‑
1:0.1
‑
3进行活化20
‑
60min，离心，活化缓冲液复溶，洗涤1次，离心，偶联缓冲液（50 mm mes缓冲液ph 6.5）复溶，每mg微球偶联0.1
‑
1mg抗体，超声，用转盘式混合器混合孵育2
‑
3h；用终浓度100 mm甘氨酸猝灭，转盘式混合器混合孵育20
‑
30 min；离心，微球封闭缓冲液洗涤微球2次，离心，用微球封闭缓冲液复溶，转盘式混合器封闭2
‑
4h；离心，微球保存液复溶，超声确保微球呈单分散状态，置于4℃保存。
11.作为上述技术方案的进一步改进，所述所述微球封闭缓冲液按照20mm、ph 8.0 tris中含有0.2
‑
5wt % 酪蛋白进行配制；所述微球保存液按照20mm、ph 8.0 tris中含有0.2
‑
5wt % 酪蛋白、1
‑
10wt % 海藻糖、0.01
‑
5wt % 吐温和0.05
‑
0.5wt % 叠氮钠进行配制。
12.作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光抗体固相的方法为：将标记好的荧光微球用荧光微球固相液稀释到3
‑
20倍，按照2
‑
10ul/cm的量喷于预处理后的结合垫，37℃烘箱中烘干。
13.作为上述技术方案的进一步改进，所述样品垫需经处理液预处理，所述处理液所
选的配方为10mm pbs中含有0.01
‑
2mg/ml封闭剂，样品垫预处理方法为将整张玻纤放于预处理液中，完全浸泡30min，然后放置于37℃烘箱中烘干，存放备用。
14.作为上述技术方案的进一步改进，所述干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒的检测方法为：将待测样本100 μl加入到加样孔，室温平置15 min，待测样本中的cpp和结合垫上荧光微球标记的鼠抗人cpp单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，在层析作用下沿硝酸纤维素膜向前移动，迁移至检测t线时被鼠抗人cpp单克隆包被抗体所捕获形成复合物，复合物的荧光抗体信号与cpp浓度成正比；结合垫上荧光微球标记的鸡igy抗体继续迁移至质控c线时与羊抗鸡igy抗体结合形成复合物；经荧光免疫定量分析仪分析后可计算出样本中cpp的浓度。
15.作为上述技术方案的进一步改进，所述待测样本的制作方法为：取100 μl血清或血浆或全血样本加入到单人份检测缓冲液中，充分混匀，所述样本检测缓冲液为20mm、ph 8.0 tris中含有0.01
‑
3wt % pvp、0.1
‑
5wt % s9、0.1
‑
5wt % bsa、和0.1
‑
0.5 v/v % pc300进行配制。
16.本发明采取以上技术方案，具有以下优点：1、本发明提供了一种快速、准确、干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒，采用了新式荧光微球标记工艺，通过优化微球活化系统和抗体偶联系统缓冲液的ph值，解决了标记过程中荧光微球不稳定易聚集的现象，更利于后期生产工艺控制；通过调整edc和nhs的活化比例，解决了抗体偶联效率低等问题，提高产品检测灵敏度；同时将荧光抗体固相于结合垫上，拓宽了试剂盒储存条件的基础上，保证产品的精密度。
17.2、选用鸡igy和羊抗鸡igy配对抗体作为独立质控线抗体，与鼠源抗体交叉少，特异性好，质控线信号值稳定，有利于提高产品的准确性、重复性。
18.3、本发明提供了一种荧光微球固相液，并把荧光微球固相在结合垫，解决了荧光标记物和试剂盒储存条件不一致的问题，同时简化了试剂盒组装工艺，降低了生产成本及时间。
19.下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
附图说明
20.图1为本发明一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒的结构示意图。
21.图2为图1的俯视图。
22.图3为本发明中试剂条的结构示意图。
23.图中，1
‑
盒体，2
‑
上盖，3
‑
样品垫，4
‑
全血过滤垫，5
‑
结合垫，6
‑
硝酸纤维素膜，7
‑
吸水纸，8
‑
检测t线，9
‑
质控c线，10
‑
加样孔，11
‑
检测窗口，12
‑
试剂条。
具体实施方式
24.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1：如图1、图2和图3所示，一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒，包括盒体1、上盖2和试剂条12，盒体1和上盖2相互卡扣连接，盒体1和上盖2之间形成容纳腔，试剂条12位于容纳腔内，上盖2上设置有加样孔10和检测窗口11，所述试剂条12包括样品垫3、全血过滤垫4、结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸水纸7，所述吸水纸7位于硝酸纤维素膜6的一端，所述结合垫5位于硝酸纤维素膜6的另一端，所述全血过滤垫4位于结合垫5的远离硝酸纤维素膜6的一端，所述样品垫3位于全血过滤垫4的远离结合垫5的一端，将硝酸纤维素膜6、结合垫5、全血过滤垫4、样品垫3、吸水纸7依次粘贴于pvc板上，组装成试剂条12。
26.所述硝酸纤维素膜6上依次包被有质控c线9、检测t线8，质控c线9设置在靠近吸水纸7的一侧，检测t线8设置在靠近结合垫5的一侧，加样孔10处于样品垫3的上方，所述检测窗口11处于检测t线8和质控c线9的上方。
27.所述质控c线9通过抗体包被液包被有羊抗鸡igy抗体，浓度为1mg/ml，所述质控c线9的抗体包被液为10mm pbs 中含有2wt %海藻糖进行配制；所述检测t线8通过抗体包被液包被有鼠抗人cpp单克隆抗体，浓度为1.5mg/ml，所述检测t线8的抗体包被液为10mm pbs 中含有3 wt %蔗糖进行配制。
28.所述结合垫5固相有荧光抗体，荧光抗体包括荧光微球固相液和荧光微球标记的0.5mg/ml的鼠抗人cpp单克隆抗体和0.3mg/ml的鸡igy，所述荧光微球固相液按照20mm、ph 8.0 tris中含有0.1wt % 酪蛋白、5wt % 海藻糖、5wt % 蔗糖、0.05wt % pvp 和0.02wt % 吐温进行配制，所述结合垫5位于全血过滤垫4和硝酸纤维素膜6之间且与二者均交叉重叠1
‑
2mm。
29.所述结合垫5需经处理液预处理，所述处理液中含有便于荧光微球快速释放的大分子聚合物和非离子表面活性剂、保护荧光微球抗体活性的蛋白和增加标记抗体活性的糖类。所述处理液为10mm pbs，大分子聚合物为0.1wt % pvp、0.05wt % pva，非离子表面活性剂0.05wt % 吐温，保护荧光微球抗体活性1wt % bsa，增加标记抗体活性3wt % 海藻糖。
30.所述荧光微球标记的方法包括以下步骤：微球用两步法edc/sulfo
‑
nhs偶联抗体。微球在edc和sulfo
‑
nhs活化前用活化缓冲液（50 mm mes缓冲液ph 6.0）洗涤1次，离心，活化缓冲液复溶。按微球：edc：sulfo
‑
nhs质量比为1:0.2:0.6进行活化30min，离心，活化缓冲液复溶，洗涤1次，离心，偶联缓冲液（50 mm mes缓冲液ph 6.5）复溶，每mg微球偶联0.1mg抗体，超声，用转盘式混合器混合孵育2h。用终浓度100 mm甘氨酸猝灭，转盘式混合器混合孵育30min。离心，微球封闭缓冲液洗涤微球2次，离心，用微球封闭缓冲液复溶，转盘式混合器封闭2h。离心，微球保存液复溶，超声确保微球呈单分散状态，置于4℃保存。
31.所述微球封闭缓冲液按照20mm、ph 8.0 tris中含有2wt % 酪蛋白进行配制。
32.所述微球保存液按照20mm、ph 8.0 tris中含有0.5wt % 酪蛋白、3wt % 海藻糖、0.02wt % 吐温和0.1wt % 叠氮钠进行配制。
33.所述荧光抗体固相的方法为：将标记好的荧光微球用固相液稀释到8倍，按照5ul/cm的量喷于预处理后的结合垫5，37℃烘箱中烘干。
34.所述全血过滤垫4，优选各方面性能优化良好，短时间内快速实现血样分离，大程度抑制溶血，有较高稳定性和均一性，且无需处理，可直接使用的全血过滤垫。
35.所述样品垫3需经处理液预处理，所述处理液所选的配方为10mm pbs中含有0.5mg/ml封闭剂，该封闭剂能主动中和干扰抗体（人抗动物种属抗体、人抗小鼠抗体、rf和异嗜性抗体等），样品垫3预处理方法为将整张玻纤放于处理液中，完全浸泡30min，然后放置于37℃烘箱中烘干，存放备用。
36.所述封闭剂终浓度的选择包括0.1mg/ml、0.3mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml，经过测试与临床结果不符的假阳性样本，0.5mg/ml、0.8mg/ml封闭效果均符合要求；经过质控品测试，0.1mg/ml、0.3mg/ml、0.5mg/ml可符合要求；综合以上2种测试结果，我们得出终浓度0.5mg/ml的封闭剂可满足产品要求。
37.在处理样本垫3中添加封闭剂，通过对多种主动阻断类封闭剂、被动吸附类封闭剂、封闭剂等原料严格筛选和反复验证，筛选出一款各方面性能优化良好的封闭剂，以最大程度降低干扰抗体对于免疫检测的影响，避免检测结果假阳性或假阴性。
38.一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒的检测方法为：将待测样本100 μl加入到加样孔10，室温平置15 min，待测样本中的cpp和结合垫5上荧光微球标记的鼠抗人cpp单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，在层析作用下沿硝酸纤维素膜6向前移动，迁移至检测t线8时被鼠抗人cpp单克隆包被抗体所捕获形成复合物，复合物的荧光抗体信号与cpp浓度成正比；结合垫5上荧光微球标记的鸡igy抗体继续迁移至质控c线9时与羊抗鸡igy抗体结合形成复合物，经荧光免疫定量分析仪分析后可计算出样本中cpp的浓度。
39.所述待测样本的制作方法为：取100 μl血清或血浆或全血样本加入到单人份检测缓冲液中，充分混匀，检测缓冲液为20mm、ph 8.0 tris溶液中含有0.5wt % pvp、0.2wt % s9、2wt % bsa、和0.5 v/v % pc300进行配制。
40.实施例2：如图1、图2和图3所示，一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒，包括盒体1、上盖2和试剂条12，盒体1和上盖2相互卡扣连接，盒体1和上盖2之间形成容纳腔，试剂条12位于容纳腔内，上盖2上设置有加样孔10和检测窗口11，所述试剂条12包括样品垫3、全血过滤垫4、结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸水纸7，所述吸水纸7位于硝酸纤维素膜6的一端，所述结合垫5位于硝酸纤维素膜6的另一端，所述全血过滤垫4位于结合垫5的远离硝酸纤维素膜6的一端，所述样品垫3位于全血过滤垫4的远离结合垫5的一端，将硝酸纤维素膜6、结合垫5、全血过滤垫4、样品垫3、吸水纸7依次粘贴于pvc板上，组装成试剂条12。所述硝酸纤维素膜6上依次包被有质控c线9、检测t线8，质控c线9设置在靠近吸水纸7的一侧，检测
t线8设置在靠近结合垫5的一侧，加样孔10处于样品垫3的上方，所述检测窗口11处于检测t线8和质控c线9的上方。
41.所述质控c线9通过抗体包被液包被有羊抗鸡igy抗体，浓度为0.2mg/ml，所述质控c线9的抗体包被液为10mmpbs 中含有0.5wt %海藻糖进行配制；所述检测t线8通过抗体包被液包被有鼠抗人cpp单克隆抗体，浓度为0.5mg/ml，所述检测t线8的抗体包被液为10mm pbs 中含有0.5 wt %蔗糖进行配制。
42.所述结合垫5固相有荧光抗体，荧光抗体包括荧光微球固相液以及荧光微球标记的0.1mg/ml的鼠抗人cpp单克隆抗体和0.1mg/ml的鸡igy。所述荧光微球固相液按照20mm、ph 8.0 tris中含有0.01wt % 酪蛋白、2wt % 海藻糖、2wt % 蔗糖、0.01wt % pvp 和0.01wt % 吐温进行配制。所述结合垫5位于全血过滤垫4和硝酸纤维素膜6之间且与二者均交叉重叠1
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2mm。
43.所述结合垫5需经处理液预处理，所述处理液中含有便于荧光微球快速释放的大分子聚合物和非离子表面活性剂、保护荧光微球抗体活性的蛋白和增加标记抗体活性的糖类。所述处理液为10mm pbs中含有0.1wt % pvp、0.01wt % pva， 0.01wt % 吐温，0.01wt % bsa，1wt % 海藻糖。
44.所述荧光微球标记的方法包括以下步骤：微球用两步法edc/sulfo
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nhs偶联抗体。微球在edc和sulfo
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nhs活化前用活化缓冲液（50 mm mes缓冲液ph 6.0）洗涤1次，离心，活化缓冲液复溶。按微球：edc：sulfo
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nhs质量比为1:0.1:0.1进行活化20min，离心，活化缓冲液复溶，洗涤1次，离心，偶联缓冲液（50 mm mes缓冲液ph 6.5）复溶，每mg微球偶联0.1mg抗体，超声，用转盘式混合器混合孵育2h。用终浓度100 mm甘氨酸猝灭，转盘式混合器混合孵育20 min。离心，微球封闭缓冲液洗涤微球2次，离心，用微球封闭缓冲液复溶，转盘式混合器封闭2h。离心，微球保存液复溶，超声确保微球呈单分散状态，置于4℃保存。
45.所述微球封闭缓冲液按照20mm、ph 8.0 tris中含有0.2wt % 酪蛋白进行配制。
46.所述微球保存液按照20mm、ph 8.0 tris中含有0.2wt % 酪蛋白、1wt % 海藻糖、0.01wt % 吐温和0.05wt % 叠氮钠进行配制。
47.所述荧光抗体固相的方法为：将标记好的荧光微球用固相液稀释到3倍，按照2ul/cm的量喷于预处理后的结合垫5，37℃烘箱中烘干。
48.所述全血过滤垫4，优选各方面性能优化良好，短时间内快速实现血样分离，大程度抑制溶血，有较高稳定性和均一性，且无需处理，可直接使用的全血过滤垫。
49.所述样品垫3需经处理液预处理，所述处理液所选的配方为10mm pbs中含有0.01mg/ml封闭剂，该封闭剂能主动中和干扰抗体（人抗动物种属抗体、人抗小鼠抗体、rf和异嗜性抗体等），样品垫3预处理方法为将整张玻纤放于处理液中，完全浸泡30min，然后放置于37℃烘箱中烘干，存放备用。
50.一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒的检测方法为：将待测样本100 μl加入到加样孔10，室温平置15 min，待测样本中的cpp和结合垫5上荧光微球标记的鼠抗人cpp单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，在层析作用下沿硝酸纤维素膜6向前移动，迁移至检测t线8时被鼠抗人cpp单克隆包被抗体所捕获形成复合物，复合物的荧光抗体信号与cpp浓度成正比；结合垫5上荧光微球标记的鸡igy抗体继续迁移至质控c线9时与羊
抗鸡igy抗体结合形成复合物，经荧光免疫定量分析仪分析后可计算出样本中cpp的浓度。
51.所述待测样本的制作方法为：取100 μl血清或血浆或全血样本加入到单人份检测缓冲液中，充分混匀，检测缓冲液为20mm、ph 8.0 tris溶液中含有0.01wt % pvp、0.1wt % s9、0.1wt % bsa、和0.1 v/v % pc300进行配制。
52.实施例3：如图1、图2和图3所示，一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒，包括盒体1、上盖2和试剂条12，盒体1和上盖2相互卡扣连接，盒体1和上盖2之间形成容纳腔，试剂条12位于容纳腔内，上盖2上设置有加样孔10和检测窗口11，所述试剂条12包括样品垫3、全血过滤垫4、结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸水纸7，所述吸水纸7位于硝酸纤维素膜6的一端，所述结合垫5位于硝酸纤维素膜6的另一端，所述全血过滤垫4位于结合垫5的远离硝酸纤维素膜6的一端，所述样品垫3位于全血过滤垫4的远离结合垫5的一端，将硝酸纤维素膜6、结合垫5、全血过滤垫4、样品垫3、吸水纸7依次粘贴于pvc板上，组装成试剂条12。所述硝酸纤维素膜6上依次包被有质控c线9、检测t线8，质控c线9设置在靠近吸水纸7的一侧，检测t线8设置在靠近结合垫5的一侧，加样孔10处于样品垫3的上方，所述检测窗口11处于检测t线8和质控c线9的上方。
53.所述质控c线9通过抗体包被液包被有羊抗鸡igy抗体，浓度为4mg/ml，所述质控c线9的抗体包被液为10mmpbs 中含有5wt %海藻糖进行配制；所述检测t线8通过抗体包被液包被有鼠抗人cpp单克隆抗体，浓度为3mg/ml，所述检测t线8的抗体包被液为10mm pbs 中含有5 wt %蔗糖进行配制。
54.所述结合垫5固相有荧光抗体，荧光抗体包括荧光微球固相液以及荧光微球标记的1mg/ml的鼠抗人cpp单克隆抗体和1mg/ml的鸡igy。所述荧光微球固相液按照20mm、ph 8.0 tris中含有0.2wt % 酪蛋白、5wt % 海藻糖、10wt % 蔗糖、10wt % pvp 和5wt % 吐温进行配制。所述结合垫5位于全血过滤垫4和硝酸纤维素膜6之间且与二者均交叉重叠1
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2mm。
55.所述结合垫5需经处理液预处理，所述处理液中含有便于荧光微球快速释放的大分子聚合物和非离子表面活性剂、保护荧光微球抗体活性的蛋白和增加标记抗体活性的糖类。所述处理液为10mm pbs中含有10wt % pvp、5wt % pva，5wt % 吐温，10wt % bsa，10wt % 海藻糖。
56.所述荧光微球标记的方法包括以下步骤：微球用两步法edc/sulfo
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nhs偶联抗体。微球在edc和sulfo
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nhs活化前用活化缓冲液（50 mm mes缓冲液ph 6.0）洗涤1次，离心，活化缓冲液复溶。按微球：edc：sulfo
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nhs质量比为1:1:3进行活化60min，离心，活化缓冲液复溶，洗涤1次，离心，偶联缓冲液（50 mm mes缓冲液ph 6.5）复溶，每mg微球偶联1mg抗体，超声，用转盘式混合器混合孵育3h。用终浓度100 mm甘氨酸猝灭，转盘式混合器混合孵育30 min。离心，微球封闭缓冲液洗涤微球2次，离心，用微球封闭缓冲液复溶，转盘式混合器封闭4h。离心，微球保存液复溶，超声确保微球呈单分散状态，置于4℃保存。
57.所述微球封闭缓冲液按照20mm、ph 8.0 tris中含有5wt % 酪蛋白进行配制。
58.所述微球保存液按照20mm、ph 8.0 tris中含有5wt % 酪蛋白、10wt % 海藻糖、5wt % 吐温和0.5wt % 叠氮钠进行配制。
59.所述荧光抗体固相的方法为：将标记好的荧光微球用固相液稀释到20倍，按照10ul/cm的量喷于预处理后的结合垫5，37℃烘箱中烘干。
60.所述全血过滤垫4，优选各方面性能优化良好，短时间内快速实现血样分离，大程度抑制溶血，有较高稳定性和均一性，且无需处理，可直接使用的全血过滤垫。
61.所述样品垫3需经处理液预处理，所述处理液所选的配方为10mm pbs中含有2mg/ml封闭剂，该封闭剂能主动中和干扰抗体（人抗动物种属抗体、人抗小鼠抗体、rf和异嗜性抗体等），样品垫3预处理方法为将整张玻纤放于处理液中，完全浸泡30min，然后放置于37℃烘箱中烘干，存放备用。
62.一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒的检测方法为：将待测样本100 μl加入到加样孔10，室温平置15 min，待测样本中的cpp和结合垫5上荧光微球标记的鼠抗人cpp单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，在层析作用下沿硝酸纤维素膜6向前移动，迁移至检测t线8时被鼠抗人cpp单克隆包被抗体所捕获形成复合物，复合物的荧光抗体信号与cpp浓度成正比；结合垫5上荧光微球标记的鸡igy抗体继续迁移至质控c线9时与羊抗鸡igy抗体结合形成复合物，经荧光免疫定量分析仪分析后可计算出样本中cpp的浓度。
63.所述待测样本的制作方法为：取100 μl血清或血浆或全血样本加入到单人份检测缓冲液中，充分混匀，检测缓冲液为20mm、ph 8.0 tris溶液中含有3wt % pvp、5wt % s9、5wt % bsa、和0.5 v/v % pc300进行配制。
64.实施例4：如图1、图2和图3所示，一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒，包括盒体1、上盖2和试剂条12，盒体1和上盖2相互卡扣连接，盒体1和上盖2之间形成容纳腔，试剂条12位于容纳腔内，上盖2上设置有加样孔10和检测窗口11，所述试剂条12包括样品垫3、全血过滤垫4、结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸水纸7，所述吸水纸7位于硝酸纤维素膜6的一端，所述结合垫5位于硝酸纤维素膜6的另一端，所述全血过滤垫4位于结合垫5的远离硝酸纤维素膜6的一端，所述样品垫3位于全血过滤垫4的远离结合垫5的一端，将硝酸纤维素膜6、结合垫5、全血过滤垫4、样品垫3、吸水纸7依次粘贴于pvc板上，组装成试剂条12。
65.所述硝酸纤维素膜6上依次包被有质控c线9、检测t线8，质控c线9设置在靠近吸水纸7的一侧，检测t线8设置在靠近结合垫5的一侧，加样孔10处于样品垫3的上方，所述检测窗口11处于检测t线8和质控c线9的上方。
66.所述质控c线9通过抗体包被液包被有羊抗鸡igy抗体，浓度为2mg/ml，所述质控c线9的抗体包被液为10mm pbs 中含有2.5wt %海藻糖进行配制；所述检测t线8通过抗体包被液包被有鼠抗人cpp单克隆抗体，浓度为1.5mg/ml，所述检测t线8的抗体包被液为10mm pbs 中含有2.5 wt %蔗糖进行配制。
67.所述结合垫5固相有荧光抗体，荧光抗体包括荧光微球固相液和荧光微球标记的0.5mg/ml的鼠抗人cpp单克隆抗体和0.5mg/ml的鸡igy，所述荧光微球固相液按照20mm、ph 8.0 tris中含有0.1wt % 酪蛋白、3.5wt % 海藻糖、6wt % 蔗糖、5wt % pvp 和2.5wt % 吐温进行配制，所述结合垫5位于全血过滤垫4和硝酸纤维素膜6之间且与二者均交叉重叠1
‑
2mm。
68.所述结合垫5需经处理液预处理，所述处理液中含有便于荧光微球快速释放的大分子聚合物和非离子表面活性剂、保护荧光微球抗体活性的蛋白和增加标记抗体活性的糖
类。所述处理液为10mm pbs，大分子聚合物为5wt % pvp、2.5wt % pva，非离子表面活性剂2.5wt % 吐温，保护荧光微球抗体活性5wt % bsa，增加标记抗体活性5.5wt % 海藻糖。
69.所述荧光微球标记的方法包括以下步骤：微球用两步法edc/sulfo
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nhs偶联抗体。微球在edc和sulfo
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nhs活化前用活化缓冲液（50 mm mes缓冲液ph 6.0）洗涤1次，离心，活化缓冲液复溶。按微球：edc：sulfo
‑
nhs质量比为1:0.5:1.5进行活化40min，离心，活化缓冲液复溶，洗涤1次，离心，偶联缓冲液（50 mm mes缓冲液ph 6.5）复溶，每mg微球偶联0.5mg抗体，超声，用转盘式混合器混合孵育2.5h。用终浓度100 mm甘氨酸猝灭，转盘式混合器混合孵育25min。离心，微球封闭缓冲液洗涤微球2次，离心，用微球封闭缓冲液复溶，转盘式混合器封闭3h。离心，微球保存液复溶，超声确保微球呈单分散状态，置于4℃保存。
70.所述微球封闭缓冲液按照20mm、ph 8.0 tris中含有2.5wt % 酪蛋白进行配制。
71.所述微球保存液按照20mm、ph 8.0 tris中含有2.5wt % 酪蛋白、5.5wt % 海藻糖、2.5wt % 吐温和0.25wt % 叠氮钠进行配制。
72.所述荧光抗体固相的方法为：将标记好的荧光微球用固相液稀释到11倍，按照6ul/cm的量喷于预处理后的结合垫5，37℃烘箱中烘干。
73.所述全血过滤垫4，优选各方面性能优化良好，短时间内快速实现血样分离，大程度抑制溶血，有较高稳定性和均一性，且无需处理，可直接使用的全血过滤垫。
74.所述样品垫3需经处理液预处理，所述处理液所选的配方为10mm pbs中含有1mg/ml封闭剂，该封闭剂能主动中和干扰抗体（人抗动物种属抗体、人抗小鼠抗体、rf和异嗜性抗体等），样品垫3预处理方法为将整张玻纤放于处理液中，完全浸泡30min，然后放置于37℃烘箱中烘干，存放备用。
75.在处理样本垫3中添加封闭剂，通过对多种主动阻断类封闭剂、被动吸附类封闭剂、封闭剂等原料严格筛选和反复验证，筛选出一款各方面性能优化良好的封闭剂，以最大程度降低干扰抗体对于免疫检测的影响，避免检测结果假阳性或假阴性。
76.一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒的检测方法为：将待测样本100 μl加入到加样孔10，室温平置15 min，待测样本中的cpp和结合垫5上荧光微球标记的鼠抗人cpp单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，在层析作用下沿硝酸纤维素膜6向前移动，迁移至检测t线8时被鼠抗人cpp单克隆包被抗体所捕获形成复合物，复合物的荧光抗体信号与cpp浓度成正比；结合垫5上荧光微球标记的鸡igy抗体继续迁移至质控c线9时与羊抗鸡igy抗体结合形成复合物，经荧光免疫定量分析仪分析后可计算出样本中cpp的浓度。
77.所述待测样本的制作方法为：取100 μl血清或血浆或全血样本加入到单人份检测缓冲液中，充分混匀，检测缓冲液为20mm、ph 8.0 tris溶液中含有1.5wt % pvp、2.5wt % s9、2.5wt % bsa、和0.3 v/v % pc300进行配制。
78.对比例1与实施例1相比较其余操作相同，不同在于检测缓冲液的配方不同，所述实施例1中检测缓冲液为20mm tris溶液中含有0.5wt % pvp、0.2wt % s9、2wt % bsa、和0.5 v/v % pc300进行配制；所述对比例1中检测缓冲液为50mm tris溶液中含有0.2wt % pvp、0.5wt % peg、5wt % bsa、0.05wt % 酪蛋白和0.5 v/v % pc300进行配制。
79.将本发明所述检测缓冲液置于37℃进行破坏性试验，考察其稳定性，检测标准如
下：检测缓冲液外观应无色透明，显色度均一无差别；检测缓冲液的准确度应满足要求。
80.检验结果如下：表1
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检测缓冲液物理状态稳定性结果表2
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检测缓冲液37℃加速破坏后质控品（1
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3）检测结果（单位：pmol/l）表3
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检测缓冲液37℃加速破坏后质控品（4
‑
6）检测结果（单位：pmol/l）
根据稳定性实验原理，阿伦尼乌斯公式：d(in k)/dt=ea/rt2 ea，常温保存24个月，相当于37度破坏180天。
81.试验表明，本实施例的检测缓冲液保存期较长，可稳定至少24个月，期间样本缓冲液的颜色、性状以及对于质控品的性能均优于对比例1的检测缓冲液，且与已上市试剂盒的结果较一致，因此本检测缓冲液可作为试剂盒的较优选择。
82.对比例2
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4与实施例1相比较其余操作相同，唯一的不同在于检测t线8 cpp单克隆抗体包被的配方不同，抗体包被液的配制方法分别如下：对比例2、10mm pbs抗体包被液制备方法：将2.901g磷酸氢二钠、0.2964g磷酸二氢钠、8.775g氯化钠置于容量瓶内，加入双蒸水，轻摇使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至1000ml混匀，用浓盐酸调节ph值为7.4。
83.实施例1、10mm pbs+ 3wt % 海藻糖抗体包被液制备方法：向干净的离心管中加入3g 海藻糖和100ml10mm pbs，100ml10mm pbs的制备方法同对比例2。
84.对比例3、10mm pbs+ 0.05wt % 酪蛋白抗体包被液制备方法：向干净的离心管中加入0.05g 酪蛋白和100ml10mm pbs，100ml10mm pbs的制备方法同对比例2。
85.对比例4、10mm pbs+ 3wt % bsa抗体包被液制备方法：向干净的离心管中加入3g bsa和100ml10mm pbs，100ml10mm pbs的制备方法同对比例2。
86.用企业内部质控品检测对比试验，结果如下表4：表4
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不同抗体包被液用质控品检测结果（单位：pmol/l）
注：所述检测缓冲液为实施例1中配方，20mm tris溶液中含有0.5wt % pvp、0.2wt % s9、2wt % bsa、和0.5 v/v % pc300进行配制。
87.表5
表6表7表8
上述结果表明，本实施例1与上市试剂盒结果相关系数为0.9985，对比例2的相关系数为0.865，对比例3的相关系数为0.8086，对比例4的相关系数为0.9285，本实施例1与上市试剂盒的相关性最佳。
88.实施例51、将组装好的干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒进行稳定性考察将本发明所述干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒置37℃进行破坏性试验，试剂盒稳定性考察结果如下：表9
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试剂盒 37℃加速破坏后质控品检测结果（单位：pmol/l）经试验本试剂盒在37℃可稳定至少180天，根据稳定性实验原理，阿伦尼乌斯公式：d(in k)/dt=ea/rt2 ea，常温保存24个月，相当于37度破坏180天，可满足医院诊所及卫生检疫部门的临床需求，也可用于大专院校和科研机构的疾病诊断研究。
89.2、样本测试：本试剂盒与上市试剂盒进行样本测试，结果如下表7：表10 cpp样本比对结果
表11
结果表明，本发明试剂盒测定结果与上市试剂盒结果相关系数为0.9886；相关性良好，可用于临床诊断使用。
90.通过上述实施例数据、临床实验数据、稳定性试验数据、对比例试验等检测数据可以证明，本发明的试剂盒用于临床血清标本中cpp的检测，与市售cpp检测elisa试剂盒检测结果具有较高的相关性，并具有较好的稳定性，能准确、快速的检测和肽素（cpp）含量，操作简单，使用方便。荧光免疫定量分析仪的应用大大缩短了测定时间（15分钟即可判读结果），而在其他方法中均需要超过60分钟。因此，我们的方法可以为临床样品中cpp的快速和准确检测提供有利工具。
91.本发明提供了一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒，该试剂盒采用荧光微球进行标记，并且将荧光抗体固相在独立的结合垫上，降低了液相抗体缓冲液的储存温度要求；同时增加了检测样本类型，涵盖了血清、血浆和全血；本发明选用鸡igy和羊抗鸡igy配对抗体作为独立质控线抗体，与鼠源抗体交叉少，特异性好，质控线信号值稳定，有利于提高产品的准确性、重复性；处理样本垫中添加封闭剂，以最大程度降低干扰抗体对于免疫检测的影响，避免检测的假阳性或假阴性结果。
92.以上所述仅为本发明的较佳实施例例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。