1.本发明属于分析化学的检测领域，涉及乳腺癌生物标志物的稳定同位素（metalstableisotope）传感领域，特别设计一种基于简单溶剂热法合成的三种镧系纳米粒子（naeuf4nps、natbf4nps和nahof4nps）所产生的稳定同位素通过电感耦合等离子体质谱仪同时对三种乳腺癌生物标志物（cea、ca125和ca153）进行检测的分析方法。
背景技术：
：：2.乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤，与肺癌、结肠癌并列全球三大癌症。同时，乳腺癌也是继肺癌之后造成女性死亡的第二大原因。为了降低乳腺癌的死亡率，早期诊断和综合治疗很重要。并且有远处器官转移的晚期乳腺癌被认为是无法治愈的，其仍是造成死亡的主要原因。现阶段用于确认转移发生的主要方法是影像学和病理学，但这些方法并不适用于转移性乳腺癌筛查，且存在造成病情恶化及患者痛苦的副作用。因此，开发一种能提供有关肿瘤诊断和治疗监测的准确信息，同时满足患者的友好性和医护人员的实用性的新型诊断工具是十分必要的。3.肿瘤标志物在许多恶性肿瘤的诊断、监测和预后方面起着关键作用。但由于肿瘤的组成复杂，单一的生物标志物不能反映疾病的确切症状。因此，同时测定一份血清样本中的多种生物标志物对于提高诊断准确性和节省检测时间有很大帮助。蛋白质检测的金标准工具是酶联免疫吸附试验(elisa)，但elisa不可能在单次分析中同时检测多个生物标志物。近年来，在荧光光谱分析、化学发光分析、电化学分析、和表面增强拉曼散射分析中，针对生物标志物的多重检测方面已经有了出色的探索，但由于探针特性、光谱重叠和多重标记的可用性的限制等原因，开发简单、灵敏且高通量的多重分析工具仍然是一个挑战。4.电感耦合等离子体质谱仪（icp-ms）作为一种强大的元素检测方法，具有同时检测多种元素、灵敏度高、基质干扰小且线性范围宽的优点。icp-ms对蛋白质分析的灵敏度主要依赖于元素标记，而镧系元素作为蛋白质分析的元素标记具有体内空白低、电离效率高和灵敏度高等巨大优势。此外，由于其相似的化学性质，镧系元素适合于多元素标记的多组分分析。值得一提的是因为icp-ms信号与标记上的金属原子数量成正比，故纳米粒子被认为是提高icp-ms生物分析灵敏度的潜在标记。5.本发明结合icp-ms与镧系纳米粒子的优势，通过免疫反应，将纳米探针与目标生物标志物特异性结合，将标记好的三种镧系纳米粒子消解后进行稳定同位素检测，在保持优秀的检出限性能的同时，大幅度提高了检测稳定性，为乳腺癌生物标志物的多重检测提出了一种更可靠的分析方法。技术实现要素：6.本发明提供一种基于镧系纳米粒子检测的免疫分析方法，以及其在乳腺癌生物标志物多重检测方面的应用。7.本发明的原理是：通过抗原与抗体之间的特异性识别和磁珠的磁分离性能，将目标物从基质中提取出来，修饰有特定抗体的镧系纳米粒子与目标物准确结合，并再次利用磁分离去除多余的探针。标记好的镧系纳米探针通过消解形成镧系金属离子（eu3+、tb3+和ho3+），可用icp-ms进行定量分析。通过对不同乳腺癌生物标志物的浓度所产生的不同镧系元素的强度变化进行线性回归分析，就能实现对多种乳腺癌生物标志物的同时检测。8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明制备镧系纳米粒子的原理是：利用溶剂热合成法，通过替换中心镧系元素，在聚丙烯酸（paa）存在的条件下，一步合成paa修饰的不同镧系纳米粒子。利用paa上的羧基与抗体上的氨基之间的缩合反应，成功将检测抗体连接到镧系纳米粒子上，合成出检测所需的纳米探针。9.检测乳腺癌标志物的原理是：将修饰有捕获抗体的磁珠与样品混合，通过抗原与捕获抗体之间的特异性识别和磁珠的磁分离能力，将目标物从样品基质中精准提取出来，再通过加入修饰有检测抗体的纳米粒子与目标抗原结合，来对乳腺癌生物标志物进行定量标记。10.对标记好的镧系纳米粒子进行消解和稳定同位素检测的方法为：磁性分离后，利用一定浓度的β-nta对镧系纳米探针进行消解，将纳米粒子中的镧系金属元素螯合到溶液中。然后，通过icp-ms对镧系元素进行高灵敏检测，选取153eu、159tb和165ho作为检测对象进行高灵敏定量分析。通过对不同浓度的乳腺癌生物标志物引起的镧系元素强度值变化进行线性回归分析，即可对待测的乳腺癌生物标志物进行定量分析。11.其中，磁珠与抗原反应时，所用的溶液为pbs缓冲液（10mm,ph=7.4），时间为60min，温度为37℃；镧系纳米探针与抗原反应时，所用的溶液为tbs缓冲液（25mm,ph=7.4），时间为90min，温度为37℃。12.本发明有如下有益效果：本发明提供了一种可以对乳腺癌生物标志物进行多重检测的分析方法，通过简单的溶剂热合成方法可以合成多种镧系纳米颗粒作为探针，从而增加可分析的生物标志物数量，提高分析方法的灵敏度。同时，利用抗原与抗体之间的特异性识别和磁珠的磁选性能，可减少检测过程中的干扰，保证分析结果的准确性。在血清分析中也获得了令人满意的结果，证明该平台在生物样品的多组分分析中具有巨大的潜力。该方法不仅适用于乳腺癌生物标志物，还可以通过修饰不同抗体，用于多种癌症的多组分分析。附图说明13.图1为本发明的实验机理示意图和必要条件对比图。14.图2为本发明分析方法对目标物的选择性结果图。15.图3为本发明分析方法对目标物检测的分析性能示意图。16.图4为本发明分析方法对人血清样品中目标物回收率的结果。17.图5为本发明分析方法对人血清样品中目标物检测结果与实际临床检测结果的对比表。具体实施方式18.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用到的水均为超纯水，经milli-q超纯水净化系统处理而成。下述实例中所有样品在使用前均未进行纯化。19.本发明按以下具体步骤进行：a.paa修饰的镧系纳米粒子的合成a1称取1mmol氯化镧系盐和1.8gpaa溶于乙二醇中，超声波震荡至溶液变为澄清为止。a2称取0.42gnaf溶于超纯水中。将含有naf的水溶液滴加到先前含有氯化镧系盐和paa的混合溶液中，溶液变混浊。室温搅拌1h后，将溶液倒入反应釜中，200℃反应4h，反应完成后自然冷却至室温。通过离心分离，得到了paa功能化的镧系纳米粒子。用乙醇和超纯水对纳米颗粒进行洗涤。最后，这些纳米粒子可以在超纯水中室温保存一个月。20.b．镧系纳米粒子标记检测抗体b1称取20mgsulfo-nhs和20mgedc•hcl溶于500μlmes缓冲液中备用。另外，取62.5μl的纳米颗粒悬液加入500μlmes缓冲液中，超声振荡8min；b2将sulfo-nhs/edc•hcl溶液与纳米颗粒溶液混合，混合物在室温下轻微摇晃1h，以激活纳米颗粒表面的羧基；b3纳米颗粒活化后，用超纯水清洗一次。将纳米颗粒重悬于1mlhepes缓冲液中，超声2min使纳米颗粒完全分散；b4将10μg检测抗体加入到纳米颗粒溶液中。室温下轻微摇晃12h，偶联抗体后hepes缓冲液洗涤1次；b5将沉淀重悬于1mltbs缓冲液中进行封闭，溶液于室温下轻晃1h。封闭后用tbs缓冲液洗涤一次。将偶联检测抗体的纳米颗粒重悬于含1%脱脂奶粉的tbs缓冲液中，4℃保存至使用。21.c．磁珠标记捕获抗体c1取37.5μl的磁珠悬浮液用pbs缓冲液洗涤3次，经磁分离去除洗涤液；c2磁珠与18.75μl的捕获抗体溶液(1mg/ml)室温孵育1h，通过生物素-链霉亲和素反应标记捕获抗体；c3通过磁分离去除多余抗体，将磁珠分散于含1%(w/v)脱脂奶粉的pbs缓冲液进行封闭。封闭步骤在室温条件下孵化40min完成。pbs洗涤四次后，将捕获抗体标记的磁珠重溶到pbs缓冲液中，4℃保存至使用。22.d．乳腺癌生物标志物的免疫分析检测d1将30μl之前制备的磁珠混合物作为捕获单元，与不同浓度的乳腺癌生物标志物在37℃下孵育1h；d2分别用tbst缓冲液和tbs缓冲液洗涤一次磁珠；d3磁珠-抗体-抗原偶联物与纳米探针混合物，在37℃反应1.5h，然后用tbst缓冲液冲洗2次，tbs缓冲液冲洗1次；d4磁分离后，去除上清液，室温下用200μlβ-nta消解磁珠表面的镧系纳米粒子。23.e．icp-ms检测e1将消解后的溶液取50μl稀释至8ml,并转移至ep管中；e2在icp-ms中对153eu、159tb和165ho进行检测，srd模式；e3分别以153eu、159tb和165ho为标准，对所测得的强度带入线性方程计算浓度。24.下面结合说明书附图做进一步的说明，但本发明分析方法并不限于下述实施例。25.实施例1、是否形成三明治免疫夹心结构的对比实验。26.为了准确的检测样品中的生物标志物浓度，三明治免疫夹心结构的形成是至关重要的。针对三种乳腺癌生物标志物，对比在不同条件下，三明治免疫夹心结构的必要性以及本发明分析方法的可行性。27.实验中，cea浓度为2ng/ml，ca153浓度为50u/ml和ca125浓度为100u/ml。缺少抗原组（空白组）所加入的样品溶液为pbs缓冲溶液，其他对照组则为三种乳腺癌生物标志物的混合溶液；缺少纳米探针组所加入的探针溶液为pbs缓冲溶液，其他对照组则为三种纳米粒子的混合溶液；缺少捕获抗体组由所加入的为裸磁珠溶液，其他对照组则为三种修饰有捕获抗体的磁珠的混合溶液。保持其他条件完全相同，检测目标物与30μl磁珠混合液在37℃下反应60min，tbst和tbs缓冲液各洗涤一次，去除上清液后，后加入180μl纳米探针混合液在37℃下反应90min，tbst缓冲液洗涤两次，tbs缓冲液洗涤一次，磁分离后，加入200μlβ-nta消解，利用icp-ms对镧系元素153eu、159tb和165ho信号进行检测。28.图1可见，无论是缺少抗原、纳米探针或者磁珠上未连有捕获抗体的条件下，都无法检测到有效的镧系元素的强度信号。只有当抗原、纳米探针以及连有捕获抗体的磁珠，这三者兼备时，才能检测到明显的镧系元素信号，可以用于乳腺癌生物标志物的检测中。因此，本实施例也证明了三明治免疫夹心结构形成所需要的条件以及本发明分析方法的可行性。29.实施例2、探究本发明分析方法对三种乳腺癌生物标志物的特异性检测。30.本实施例以三种乳腺癌生物标志物为例，利用基于镧系纳米粒子检测的免疫分析方法对几种常见的蛋白质进行检测，探究该方法的特异性。31.利用上述步骤，以三种镧系纳米粒子为探针分别对cea（0.5ng/ml）、ca153（10u/ml）、ca125（10u/ml）、10%牛奶、igg（1000ng/ml）、afp（1000ng/ml）、ca199（1000u/ml）和10%bsa进行检测，保持其他条件完全相同，检测蛋白质与30μl磁珠混合液在37℃下反应60min，tbst和tbs缓冲液各洗涤一次，去除上清液后，后加入180μl纳米探针混合液在37℃下反应90min，tbst缓冲液洗涤两次，tbs缓冲液洗涤一次，磁分离后，加入200μlβ-nta消解，利用icp-ms对镧系元素153eu、159tb和165ho信号进行检测。32.结果如图2所示，除了cea、ca153和ca125能够引发镧系元素的信号增强，其他常见蛋白质干扰物均不能引起信号的明显改变，证明本发明利用抗原与抗体之间的特异性识别，可以对乳腺癌生物标志物进行高选择性检测。33.实施例3、探究本发明分析方法对三种乳腺癌生物标志物的灵敏性检测。34.本实施例探究了基于镧系纳米粒子检测的免疫分析方法，对三种乳腺癌生物标志物同时检测的灵敏度和线性。35.实验中，将30μl磁珠混合液加入到150μl不同浓度的三种乳腺癌生物标志物混合溶液，在37℃下反应60min，tbst和tbs缓冲液各洗涤一次，去除上清液后，后加入180μl纳米探针混合液在37℃下反应90min，tbst缓冲液洗涤两次，tbs缓冲液洗涤一次，磁分离后，加入200μlβ-nta消解，利用icp-ms对镧系元素153eu、159tb和165ho信号进行检测。36.由图3可见，根据浓度与响应信号成正比的关系，同时得到了cea浓度与159tb响应信号的线性关系、ca153浓度与165ho响应信号的线性关系和ca125浓度与153eu响应信号的线性关系。当cea浓度在10-2000pg/ml内159tb响应信号呈线性关系，线性相关系数为0.995，计算出的检出限为9.2pg/ml(n=11,3σ)。当ca153浓度在1-50u/ml内165ho响应信号呈线性关系，线性相关系数为0.999，计算出的检出限为0.42u/ml(n=11,3σ)。当ca125浓度在2-100u/ml内153eu响应信号呈线性关系，线性相关系数为0.997，计算出的检出限为0.21u/ml(n=11,3σ)。证明本分析方法具有良好的灵敏度。37.实施例4、探究本发明分析方法对人血清样中三种乳腺癌生物标志物的检测。38.样品采集与样品前处理：人血清样本采自成都市第七人民医院。采用电化学发光法检测血清中三种乳腺癌生物标志物的浓度。鉴于血清样品的组成复杂和黏度，采用含1%牛血清白蛋白(bsa的)pbs缓冲液稀释血清样品。39.基于镧系纳米粒子检测的免疫分析方法对人血清样品进行检测：将30μl磁珠混合液加入到150μl的人血清样品中，在37℃下反应60min，tbst缓冲液洗涤两次，tbs缓冲液洗涤一次，去除上清液后，后加入180μl纳米探针混合液在37℃下反应90min，tbst缓冲液洗涤两次，tbs缓冲液洗涤一次，磁分离后，加入200μlβ-nta消解，利用icp-ms对镧系元素153eu、159tb和165ho信号进行检测。40.检测结果：结果见图4，血清样品中三个目标物的回收率均集中在95.7-109.4%的范围内，显示出良好的回收率。表明本分析方法能够适应实际样品的复杂环境，保证准确度。为进一步验证本方法测定结果的准确性，将血清样品稀释，目标物浓度控制在线性范围内，把icp-ms测定的结果与已在实际应用中使用的ecl测定结果进行比较。图5显示了比较结果，两者所测得的结果保持高度一致，表明本分析方法的可靠性。当前第1页12当前第1页12