一种布洛芬人工抗原检测探针的制备及其应用

1.本发明涉及免疫分析领域，具体而言，涉及一种布洛芬人工抗原检测探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.布洛芬一种重要的非甾体抗炎药，监测生物样品中的布洛芬含量，在对公共健康具有重要的作用。但目前的检测方法需要昂贵的仪器，复杂的样品前处理步骤、费时、高的检测限、特异性低或者需要毒性试剂。用于布洛芬检测的传统间接elisa法需要其相应的抗体和二抗，因而其需要高昂的费用，同时需要冗长、费时的操作程序。


技术实现要素：

3.本发明的第一目的在于提供一种布洛芬人工抗原检测探针，这种检测探针兼具免疫原和酶催化的双重性质，而且结构稳定、容易保藏。这种布洛芬人工抗原检测探针，检测布洛芬时操作简单、检测迅速且灵敏度高，能够对样品中很微量的布洛芬行有效检测。
4.本发明的第二目的在于提供一种布洛芬人工抗原检测探针的制备方法，制备方法步骤简单、反应条件不苛刻，容易实现，且该法所用到的溶剂对环境友好，适合工业大生产，能够对样品中布洛芬进行有效检测。
5.本发明的第三目的在于提供一种布洛芬人工抗原检测探针的应用，即用探针来检测待测样品中布洛芬的含量。检测布洛芬时，利用布洛芬人工抗原结合直接竞争elisa法完成对样品中布洛芬中的定性分析，操作简单、检测迅速且灵敏度高。
6.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
7.一种布洛芬人工抗原检测探针的制备方法，其包括：
8.步骤ⅰ：将布洛芬与n,n'
‑
二环己基碳酰亚胺(dcc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)混合，搅拌过夜。
9.步骤ⅱ：将步骤ⅰ反应液于离心后，冰浴环境下将上清液缓慢加入到与dmf体积比2：5hrp溶液中，室温搅拌12h。随后将反应液离心，透析，即得到布洛芬人工抗原，放于4℃下保存备用，随后进行布洛芬人工抗原偶联比测定。
10.一种布洛芬人工抗原检测探针的应用，其包括：
11.步骤a：用辣根过氧化物酶为载体蛋白，通过布洛芬与hrp偶联物的质谱图，计算出偶联比；布洛芬人工抗原保留与hrp一样的催化活性，即成功制备同时具有免疫原性和酶催化活性的布洛芬人工抗原；
12.步骤b：利用布洛芬人工抗原结合直接竞争elisa法完成对样品中布洛芬中的定性分析。先将布洛芬抗体包被于酶标板上，过夜，洗涤后加入封闭液，洗涤备用；
13.步骤c：人工抗原可以和尿液样品中布洛芬竞争地与酶标板上的抗体结合，将样品和布洛芬人工抗原检测探针和中加入四甲基联苯胺溶液，静置12
‑
18min进行显色，随后加入h2so4终止显色，于445
‑
455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出所述待测样品中布洛芬
的含量。与现有技术相比，本发明的有益效果为：
14.布洛芬人工抗原检测探针的制备方法中，采用用辣根过氧化物酶为载体蛋白；随后利用n,n'
‑
二环己基碳酰亚胺(dcc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)进行活化；再然后将hrp溶液与之室温搅拌12h得到兼具免疫原和酶催化的双重性质的布洛芬人工抗原。这种制备方法简单、反应条件温和，容易实现，适合工业大生产。
15.用布洛芬人工抗原检测探针来检测样品中的布洛芬的原理是：
16.在布洛芬抗体包被的酶标板上，加入待测样品后，当样品中含有一定量的布洛芬时，酶标板上包被的抗体只能部分被布洛芬人工抗原结合，另一部分的布洛芬人工抗原游离在待测样品液中，经洗涤后弃去，人工抗原与抗体结合部分在tmb作用下，tmb为hrp的底物，之作用后形成的产物呈蓝色，随后用h2so4终止反应后，tmb的产物由蓝色变为黄色。采用比色法测反应液在445
‑
455nm处的吸光度，将其数值带入由系列标准布洛芬溶液采用同样检测方法所得的标准曲线中，即可得出待测样品中布洛芬的含量。
17.上述标准曲线为反比例曲线，即当待测样品中的布洛芬浓度越少，游离的布洛芬人工抗原的量就越少，用比色法所测得的吸光度值也就越高，由此可见，该吸光度值与待测样品中的布洛芬浓度呈反比。
18.布洛芬人工抗原直接应用于直接竞争elisa法完成对样品中布洛芬的定性分析。当尿液样品中不含有布洛芬时，酶标板上包被的抗体则会被布洛芬人工抗原完全结合，因此，经底物显色后，其颜色最深，od450 nm值最大；当样品中含有一定量的布洛芬时，酶标板上包被的抗体只能部分被布洛芬人工抗原结合，因此，经底物显色后，其颜色变浅od450 nm值逐渐变小。三者对应的颜色变化是黄色依次变浅，当不同样品中布洛芬含量相差较大时，可以做初步的定性分析。
19.该检测方法利用了抗原与抗体的特异性结合反应，特异性强，同时利用hrp来标记抗原，实现特异性的可视化检测，特异性强，灵敏度高。由于布洛芬人工抗原检测探针为无色的，在一定的范围内，对待测样品中是否含有布洛芬能够实现快速的肉眼可见的可视化分析。
20.该布洛芬人工抗原检测探针的稳定性强、催化效果好，使用方便。在利用该布洛芬人工抗原检测探针检测待测样品中的布洛芬时，操作过程简单、迅速，所需要的仪器设备仅为酶标仪，检测成本低，简单易行。该方法的适用广泛、使用性强，可快速检测尿液等生物样品中布洛芬的含量。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
22.图1为布洛芬人工抗原检测探针的合成路线图；
23.图2为利用布洛芬人工抗原探针检测待测样品的布洛芬的步骤图；
24.图3为hrp和布洛芬人工抗原的质谱图(a图为hrp；b图为 hrp与布洛芬偶联物，即布洛芬人工抗原)；
25.图4为布洛芬人工抗原催化活性的比较图；
26.图5为实验例1中的线性拟合标准曲线。
具体实施方式
27.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
28.本实施方式提供一种布洛芬人工抗原检测探针的制备方法，如图1 所示，其包括：
29.步骤ⅰ：用dmf将布洛芬溶解后，在冰浴环境下加入与布洛芬摩尔比1：1.1的dcc并搅拌约15min，随后向中加入与dcc摩尔比 1：1的nhs，于冰浴下搅拌过夜。dcc和nhs均为羧基活化试剂，将布洛芬与dcc和nhs混合，使布洛芬中的羧基活化。
30.步骤ⅱ：将步骤ⅰ反应液于4000rpm下离心5min，冰浴环境下将上清液逐滴加入到与布洛芬质量比2.1：1的hrp溶液中，室温搅拌12h，进一步使布洛芬中活化的羧基与hrp中的氨基发生缩合反应，得到hrp
‑
布洛芬抗原复合物，即为布洛芬人工抗原检测探针。随后将反应液离心，上清液用pbs于4℃下透析24h，即得到布洛芬人工抗原，放于4℃下保存备用，进行布洛芬人工抗原偶联比测定。
31.为了使布洛芬中的羧基完全活化，提高布洛芬与hrp的合成速率，在本发明较佳的实施例中，上述布洛芬与hrp的质量比为2.1：1。优选为，nhs与hrp的质量比为2.2：1。上述nhs与布洛芬的质量比为2.2：1。
32.实验例1
33.本实验例提供了一种布洛芬人工抗原检测探针的制备方法，及其在检测尿液中布洛芬含量中的应用。
34.一、布洛芬人工抗原检测探针的制备：
35.(1)取42mg(0.2mm)布洛芬于25ml圆底烧瓶中，加入8mldmf，在冰浴下搅拌使之溶解。(2)取46mg dcc(0.22mm)加入上述溶液中，混匀并搅拌15min。
36.(3)取44mg nhs(0.22mm)，加入上述溶液，于冰浴下搅拌过夜。
37.(4)将上述溶液于4000rpm下离心5min。随后冰浴环境下将上清液逐滴加入到20ml 1mg/ml的hrp溶液中，室温搅拌12h。
38.(5)将上述反应液离心，上清液用pbs(10mm，ph 7.4)于4℃下透析24h，即得到布洛芬人工抗原，放于4℃下保存备用。
39.将上述制得的布洛芬人工抗原与hrp分别与基质sa混合，点到样品靶上，放入质谱仪中进行激光扫描：
40.a.布洛芬人工抗原偶联比的测定
41.如图3所示，其中，a图为hrp的质谱图；b图为布洛芬与hrp 偶联物的质谱图。对比a图和b图可以看出，hrp的分子离子峰为 43291.9805；布洛芬与hrp偶联物的分子离子峰为44340.2597，其较 hrp的分子离子峰增大了1048.2792，说明布洛芬小分子成功偶联到 hrp上，其偶联比为(44340.2597
‑
43291.9805)/206.28＝5.08，即 hrp上偶联了5个布洛芬半抗原。样品测定几秒钟即可完成，操作简单。其与紫外吸收相比，该方法更加简便准确，且无复杂的多种溶液配制，标准曲线的绘制及复杂公式套入等步骤，无近似处理、检测信号稳定可靠。
42.b.布洛芬人工抗原催化活性的比较
43.如图4所示，其中图中两条线分hrp和布洛芬人工抗原催化活性的比较。该图中，在hrp催化反应的初期，tmb
+
的产量随时间线性增加，因此a值也随时间线性增加，所以可以通过a值的增加速率来分析hrp及布洛芬人工抗原的催化活性。如图3所示，hrp和布洛芬人工抗原a值的增加速率几乎相同，所以布洛芬人工抗原保留与 hrp一样的催化活性。
44.二、检测尿液中的布洛芬的含量：
45.(1)首先用包被液将布洛芬抗体稀释至100ng/ml，于96酶标板加入100μl/孔抗体溶液，4oc下放置20h后，洗涤液洗涤3次。
46.(2)然后在酶标板上每孔加入200μl封闭液，于37oc放置2h 后洗涤液洗涤3次。
47.(3)随后每微孔依次加入50μl样品溶液(空白尿液、30ng/ml 布洛芬尿液、100ng/ml布洛芬尿液)和50μl布洛芬人工抗原溶液，经在37oc下反应40min后，洗涤液洗涤3次，并在吸水纸上拍干。
48.(4)最后每微孔中加入底物溶液100μl，在经避光显色15min 后，向每微孔加入50μl终止液终止反应，观察各孔颜色的深浅，并用酶标仪测量其在450nm处的吸光度。
49.(5)由布洛芬的标准溶液(5、10、20、35、50、70ng/ml)测得的吸光度值与其布洛芬浓度做线性模拟，得到标准曲线；再将由尿液样品所测得的吸光度值代入标准曲线，即可得出尿液样品中布洛芬的含量。
50.结果分析：
51.由布洛芬的标准溶液测得的吸光度值与其布洛芬浓度做线性模拟，得到标准曲线：y＝
‑
0.013x+0.988(r2＝0.998)，如图5所示。
52.将四个尿液样本的实验组在450nm处测得的吸光度值代入标准曲线的方程式：y＝
‑
0.013x+0.988(r2＝0.998)中，即可测出尿液样本的含量，结果如表1所示。
53.表1.尿液样本中布洛芬含量的检测
[0054][0055]
由表1可知，这四个尿液样本中的布洛芬的浓度均在线性检测范围为5
‑
70ng/ml内。说明该方法能够快速有效的对尿液样本中的布洛芬的含量进行检测。
[0056]
实验例2
[0057]
本实验例采用加样回收法，来测试采用本发明提供的布洛芬人工抗原检测探针来检测布洛芬的这种检测方法的准确度。
[0058]
本实验例中采用的布洛芬人工抗原检测探针及其检测方法与实验例1一致。首先将样品4重复测定六次，其检测结果为30.00
±
0.34 ng/ml，向样品4中加入该浓度80％、100％及120％的布洛芬标准溶液，即24ng/ml、30ng/ml及36ng/ml，然后按照建立的方法进行测定。其检测结果如表3
‑
2所示:其回收率在92.31％
‑
96.70％之间，因此该方法具有较好的准确度，可以用于尿液中布洛芬的检测，同时也暗示该方法在对其他生物样品的检测具有很大的潜力。然后按实验例1 中的步骤进行分析，结果如表2所示：
[0059]
表2加样回收法检测结果
[0060][0061]
表2中，尿样中原有的布洛芬，为采用实验例1的方法重复检测三次的结果。
[0062]
添加回收率＝(实际检测到的浓度
‑
尿液中原有的浓度)/添加的标准品浓度
×
100％
[0063]
由表2可以看出，采用该方法检测布洛芬的回收率均大于92.3％，说明该检测方法的准确度高，能够对样品中的布洛芬进行准确的测定。
[0064]
综上所述，布洛芬人工抗原检测探针的制备方法中，采用辣根过氧化物酶(hrp)作为载体蛋白，利用n,n'
‑
二环己基碳酰亚胺(dcc)和n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化布洛芬，从而制备了布洛芬与hrp偶联物，即布洛芬的人工抗原，利用maldi
‑
tof
‑
ms快速测定了其偶联比。这种制备方法简单、反应条件温和，容易实现，适合工业大生产。
[0065]
用布洛芬人工抗原检测探针检测待测样品中布洛芬的含量的方法，利用了抗原与抗体的特异性结合反应，特异性强，同时利用hrp来标记抗原使其保留与hrp一样的催化活性，实现特异性的可视化检测，特异性强，灵敏度高。由于布洛芬人工抗原检测探针为无色的，在一定的范围内，对样品中是否含有布洛芬能够实现快速的肉眼可见的可视化分析。
[0066]
该布洛芬人工抗原检测探针的稳定性强，在溶液中的分散性好。在利用该布洛芬人工抗原检测探针检测待测样品中的布洛芬时，操作过程简单、迅速，所需要的仪器设备仅为酶标仪，检测成本低，简单易行。
[0067]
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。