用于诊断脑白质病患者患脑梗死的生物标志物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于诊断脑白质病患者患脑梗死的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.随着社会的老龄化，脑卒中的发病率急剧增高，且脑卒中致死是全球第二大死亡原因。 国际间比较研究显示， 我国人群的脑卒中发病率高于国际平均水平，其中缺血性卒中（脑梗死）是由于脑动脉的狭窄或闭塞造成脑组织的缺血坏死，占所有脑卒中的70％以上。脑白质病变（white matter lesion, wml）是一种常见的神经退行性疾病，最典型的病理表现为脑白质完整性破坏或脱髓鞘变化，该病常见于脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、精神分裂症等多种疾病中。而脑白质对各种有害刺激的典型反应是脱髓鞘变化，它可以是神经系统疾病如感染、中毒、退行性变、外伤后、脑梗塞等的继发表现。脑白质病变主要引起患者认知障碍、言语障碍、精神行为异常、步态障碍、排尿障碍等症状。脑梗死合并脑白质病变，往往会严重增加患者的家庭负担，降低患者的生活质量，给个人以及整个社会带来沉重的负担，目前已成为医药卫生领域研究的重点和难点。
3.脑梗死的诊断主要依赖病史及查体，辅以影像学检查，不同的影像学检查具有耗时时间长、成本较高等缺陷，因此有必要开发有价值的生物标志物以预测风险，快速准确地诊断，在不同类型脑卒中之间及与其他疾病鉴别。一般情况下，多数脑白质病变的患者的病情是可逆的，所以对于脑白质病患者采取适当的预防措施，其症状可明显改善，其中早期筛查是至关重要的手段。目前，尚无种准确性高、特异性强的外周血生物标志物。脑梗死合并脑白质病变的发病机制尚不清楚，临床上缺乏明确有效的治疗靶点，不利于患者的治疗和恢复。目前ct和mri等影像学方法被广泛用于脑梗死和脑白质病变的诊断，但其有操作复杂、需搬动患者、花费大等弊端，寻找对脑梗死诊断和病情演变具有指示作用的血液生物学标记物，对指导脑卒中的治疗并改善患者预后具有重要的临床价值。作为寻找脑梗死合并脑白质病变的新型生物标志物颇具前景的工具，代谢组学可通过分析内源性代谢物的变化来反映机体的状态，并进而识别特异性生物标志物或标志物群。
4.如何寻找一种易于检测的生物标志物，用来预测和诊断脑梗死合并脑白质病变是亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供葡糖神经酰胺结合β
‑
羟乙基乙醇胺、番茄碱、磷酯酰丝氨酸或癸酰肉碱在制备诊断脑白质病患者患脑梗死的检测试剂中的应用。
6.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：生物标志物葡糖神经酰胺结合β
‑
羟乙基乙醇胺、番茄碱、磷酯酰丝氨酸或癸酰肉碱在制备诊断脑白质病患者患脑梗死的检测试剂中的应用。
7.如上所述的应用，优选地，其是将葡糖神经酰胺结合β
‑
羟乙基乙醇胺、番茄碱、磷
酯酰丝氨酸或癸酰肉碱来判断是否存在脑白质病变患脑梗死的风险。
8.如上所述的应用，优选地，葡糖神经酰胺的含量记为f2，β
‑
羟乙基乙醇胺的含量记为f3，根据tc=
‑
0.4782+0.8007
×
f2
‑
0.4380
×
f3计算tc值，若tc≥0.615，则判定为脑白质病变合并脑梗死；若tc＜0.615。
9.如上所述的应用，优选地，葡糖神经酰胺的含量记为f2，番茄碱的含量记为f4，根据tc=
‑
5.4480+1.4507
×
f2+2.7045
×
f4计算tc值，若tc≥0.507，则判定为脑白质病变合并脑梗死；若tc＜0.507，则为脑白质病变。
10.如上所述的应用，优选地，葡糖神经酰胺的含量记为f2，磷酯酰丝氨酸的含量记为f5，根据tc=
‑
1.1960+1.1011
×
f2
‑
0.0837
×
f5计算tc值，若tc≥0.541，则判定为脑白质病变合并脑梗死；若tc＜0.541，则为脑白质病变。
11.如上所述的应用，优选地，葡糖神经酰胺的含量记为f2，癸酰肉碱的含量记为f6，根据tc=
‑
1.49895+1.24498
×
f2+0.02589
×
f6计算tc值，若tc≥0.523，则判定为脑白质病变合并脑梗死；若tc＜0.523，则为脑白质病变。
12.如上所述的应用，优选地，所述检测试剂适用于脑白质病患者。
13.本发明的有益效果在于：本发明提供了利用新型分子标志物，判别脑梗死合并脑白质病变的模型，可用于早期发现、诊断和预测脑梗死合并脑白质病变的检测试剂盒应用。
14.本发明提供的用于诊断脑白质病患者患脑梗死的生物标志物为包括葡糖神经酰胺和β
‑
羟乙基乙醇胺、番茄碱、磷酯酰丝氨酸或癸酰肉碱中的任意两种结合，根据检测葡糖神经酰胺的含量，结合β
‑
羟乙基乙醇胺、番茄碱、磷酯酰丝氨酸或癸酰肉碱中的任两在血液中的含量，根据tc值预测脑白质病变患者患脑梗死的风险，有助于诊断是否存在脑白质病变患者患脑梗死的倾向，可用于提前预防。
附图说明
15.图1为正离子模式下vip＞1的样本；图2为负离子模式下vip＞1的样本；图3为正离子模式下(o)pls
‑
da的得分图；图4为负离子模式下(o)pls
‑
da的得分图；图5为正离子模式下s
‑
plot图；图6为负离子模式下s
‑
plot图；图7为基于逻辑回归模型的roc曲线（变量为f2+f3）；图8为基于逻辑回归模型的roc曲线（变量为f2+f4）；图9为基于逻辑回归模型的roc曲线（变量为f2+f5）；图10为基于逻辑回归模型的roc曲线（变量为f2+f6）。
具体实施方式
16.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
17.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，
本发明中所用试剂均为分析纯或以上规格，其中所用的超高效液相色谱：uplc；型号：acquity uplc i
‑
class系统，厂家：waters, manchester, uk；分析鉴定软件：progenesis qi，厂家：waters。
18.实施例11.样品前处理选择患者人群：为mri核磁检测显示脑白质出现高信号，因急性脑梗死送医的48人，男女比例：1：1，年龄范围：45以上。
19.对照人群：为mri核磁检测脑白质出现高信号，无脑梗死病史，共54人，男女比例：1：1，年龄范围：45以上。
20.收集的上述人群的血清样本在冰上解冻，200μl的血清用600μl的预冷异丙醇萃取，用漩涡振荡器（型号mx
‑
s，scilogex公司，美国）涡流1min，室温孵育10min，然后将萃取混合物在
‑
20
◦
c下储存过夜，在冷冻离心机（型号d3024r，scilogex公司，美国）4000r离心20min后，将上清液转移到新的离心管，用异丙醇/乙腈/水(2：1：1，v：v：v)稀释至1：10。样品在lc
‑
ms分析前保存在
‑
80
◦
c。此外，还将每个萃取混合物的10μl组合在一起制备混合血清样品。
21.其中本发明中所用的试剂：异丙醇、乙腈，甲酸，甲酸氨，亮氨酸脑啡肽，甲酸钠，厂家均为fisher。
22.2. 脂质组学的超高效液相色谱
‑
质谱联用方法样品用acquity uplc(waters，美国)连接到带有esi的xevo
‑
g2xs高分辨飞行时间 (qtof)质谱仪(esi
‑
qtof/ms；型号：xevo g2
‑
s q
‑
tof；厂家：waters, manchester, uk)进行分析。采用cquity uplc beh c18色谱柱(2.1
×
10 0 mm，1.7μm，waters)，流动相为10 mm甲酸铵
‑
0.1%甲酸
‑
乙腈(a，6 0：40，v/v)和10 mm甲酸铵
‑
0.1%甲酸
‑
异丙醇
‑
乙腈(b，90：10，v/v)。在大规模研究之前，进行了包括10分钟、15分钟和20分钟洗脱期的中试实验，以评估流动相组成和流速对脂质保留时间的潜在影响。在pim中，丰富的脂质前体离子和碎片以相同的顺序分离，具有相似的峰形和离子强度。此外，具有10分钟洗脱期的混合qc样品也表现出与测试样品相似的前体和碎片的基峰强度。流动相流速为0.4ml/min。该柱最初用40%b洗脱，然后在2分钟内线性梯度到43%b，然后在0.1min内将b的百分比增加到50%。在接下来的3.9分钟内，梯度进一步增加到54%b，然后b的量0.1分钟内增加到70%。在梯度的最后部分，b的量在1.9分钟内增加到99%。最后，溶液b在0.1分钟内返回到40%，并且在下一次进样之前将色谱柱平衡1.9分钟。每次进样量为5μl，用xevo
‑
g2xs型qtof质谱仪检测正负两种模式下的脂质，采集范围为 m/z50~1200年，采集时间为0.2s/次。离子源温度为120℃，去溶温度为600℃，气体流量为1000l/h，以氮气为流动气体。毛细管电压为2.0kv(+)/锥体电压为1.5kv(
‑
)，锥体电压为30v。以亮氨酸脑啡肽进行标准质量测定，用甲酸钠溶液进行校正。样品被随机排序。每10个样本注入一个qc样本并进行分析，以调查数据的重复性。
23.采用数据采集软件（masslynx4.1; 厂家：waters）进行数据采集，结果分析：3. 利用多元统计学寻找血清差异物质使用progenesis qi将质谱数据转化为可供统计的数据形式，正交偏最小二乘判别分析（opls
‑
da）结合了正交信号矫正（osc）和 pls
‑
da（偏最小而成判别分析） 方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。如图1 、图2vip值为pls
‑
da第一主成分的变量重要性
投影，通常以vip>1为代谢组学常用评判标准，作为差异代谢物筛选的标准之一；图3、图4为脑白质病变组（wml表示）和脑白质病变合并脑梗死组（ws表示）两个分组中的第一主成分和第二主成分通过降维的方式所得的得分图，横坐标表示组间差异，纵坐标表示组内差异，且两组结果分离较好。图5、图6为s
‑
plot图，横坐标表示主成分与代谢物的协相关系数，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，同时满足p<0.05,vip>1的条件下，正离子模式有171个差异物，负离子模式有47个差异物。
24.4. 约登指数分析为了进一步缩小范围，将vip阈值提高到2，同时体现正常和患者之间的倍数差异在0.83倍以下，或者增加1.2倍以上，p值小于0.01，最终得到以下6个化合物，化合物具体见表1。
25.然后对他们进行youden 约登指数计算，用来反映单个指标对整体的诊断和预测效果，单个代谢物预测脑白质病变的曲线下面积（auc）、特异性和敏感度结果如表1。
26.表1脑白质病合并脑梗死相关脂质的约登指数分析编号化合物中文名称auc值敏感性特异性f1磷脂酰肌醇(22:0/19:0)0.8500.80.8f2葡糖神经酰胺(d18:0/24:1(15z))0.7270.60.8f3β
‑
羟乙基乙醇胺0.7190.660.7f4番茄碱0.6690.880.46f5磷酯酰丝氨酸(22:6/20:1)0.6630.980.32f6癸酰肉碱0.6510.680.585. 内部人群十折交叉验证结果为提高种变量化合物的生物诊断效果，需要根据上述生物标志物找出适合的模型进行行下一步的分析。
27.将内部人群随机分为10份，选择1份为验证集，其他为训练集，如此反复十次，考察最佳的变量组合。将其次的结果，包括auc，敏感度，特异性都取平均值，并进行统计学显著性计算，结果如下表2：表2组合逻辑回归auc敏感性特异性f2+f30.811f2+f40.84911f2+f50.81311f2+f60.80911组合之间，auc值并没有显著性p<0.05差异。
28.基于上述建立逻辑回归模型a、b、c、d如下："模型a" 变量为f2+f3，根据公式tc=
ꢀ‑
0.4782 + 0.8007
×
f2
ꢀ‑
0.4380
×
f3计算tc值，公式中f2为葡糖神经酰胺(d18:0/24:1(15z))，f3为β
‑
羟乙基乙醇胺，根据tc值预测脑白质病变患者患脑梗死的风险：若tc≥0.615，则判定为脑白质病变合并脑梗死；若tc＜0.615，则为脑白质病变。
29."模型b" 变量为f2+f4，根据公式tc=
‑
5.4480 + 1.4507
×
f2+ 2.7045
×
f4，计算
tc值，公式中f2为葡糖神经酰胺(d18:0/24:1(15z))，f4为番茄碱，根据tc值预测脑白质病变患者患脑梗死的风险：若tc≥0.507，则判定为脑白质病变合并脑梗死；若tc＜0.507，则为脑白质病变。
30."模型c"变量为f2+f5，根据公式tc=
ꢀ‑
1.1960 + 1.1011
×
f2
ꢀ‑
0.0837
×
f5计算tc值，公式中f2为葡糖神经酰胺(d18:0/24:1(15z))，f5为磷酯酰丝氨酸(22:6/20:1)，根据tc值预测脑白质病变患者患脑梗死的风险：若tc≥0.541，则判定为脑白质病变合并脑梗死；若tc＜0.541，则为脑白质病变。
31."模型d"变量为f2+ f6 ，根据公式tc=
ꢀ‑
1.49895+1.24498
×
f2+0.02589
×
f6计算tc值，公式中f2为葡糖神经酰胺(d18:0/24:1(15z))，f6癸酰肉碱，根据tc值预测脑白质病变患者患脑梗死的风险：若tc≥0.523，则判定为脑白质病变合并脑梗死；若tc＜0.523，则为脑白质病变。
32.实施例2模型验证样本群体168人（外部人群）进行逻辑回归模型验证，其中患mri核磁检测脑白质出现高信号，无脑梗死病史74人；脑白质出现高信号且因急性脑梗死送医的94人，按实施例1中的方法测得f2、f3、f4、f5、f6的含量，以验证实施例1中模型结果的准确性，并绘制相应的roc曲线图，结果如下："模型a" 变量为f2+f3，roc曲线图结果如图7，sensitivity （敏感性）=1，specificity （特异性）=1，accuracy （准确度）=1。
33."模型b" 变量为f2+f4，roc曲线图结果如图8所示，sensitivity （敏感性）=1，specificity （特异性）=1，accuracy（准确度） =1。
34."模型c"变量为f2+f5，roc曲线图结果如图9所示，sensitivity （敏感性）=1，specificity （特异性）=1，accuracy（准确度） =1。
35."模型d"变量为f2+ f6 ，roc曲线图结果如图10所示，sensitivity （敏感性）=1，specificity （特异性）=1，accuracy（准确度） =1。
36.数据显示：f2为葡糖神经酰胺(d18:0/24:1(15z))自身，以及结合其他四种生物标记物β
‑
羟乙基乙醇胺、番茄碱、磷酯酰丝氨酸(22:6/20:1)和癸酰肉碱中的任一种都表现出非常高的诊断能力，未来都能进行临床试剂盒的应用。
37.由此可见，采用上述方法处理患者血清样本并进行检测，所测得数据代入上述模型中，利用逻辑回归模型判断脑白质患者是否存在患脑梗死的风险。