一种醋酸加尼瑞克高分子聚合物的检测方法与流程

1.本发明属于大分子检测技术领域，具体涉及一种醋酸加尼瑞克高分子聚合物的检测方法。


背景技术：

2.醋酸加尼瑞克分子之间的聚合会导致形成二聚体、多聚体等高分子聚合物；这些高分子聚合物会降低分子状态加尼瑞克的占比，从而不仅会降低药效还会增大药物的副作用，给患者带来安全隐患。因此对醋酸加尼瑞克高分子聚合物的检测及控制成为药物制备过程不可忽视的方面。现有技术中并没有针对醋酸加尼瑞克高分子聚合物的检测方法。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了解决现有技术中并没有针对醋酸加尼瑞克高分子聚合物的检测方法，通常的有关物质检测方法，测定的均是一些与加尼瑞克分子量相近的杂质或小分子物质，并不适用于高分子聚合物的检测，因此需要开发更准确、更便捷的检测方法，以测定醋酸加尼瑞克高分子聚合物的含量。
4.本发明提供了一种醋酸加尼瑞克高分子聚合物的检测方法，所述检测方法是以水、乙腈和三氟乙酸为流动相，然后利用流动相溶解醋酸加尼瑞克，利用磷酸盐缓冲液溶解胸腺法新，分别获得醋酸加尼瑞克的色谱图和胸腺法新的色谱图，根据色谱图得到醋酸加尼瑞克高分子聚合物和醋酸加尼瑞克单分子的分离度，计算醋酸加尼瑞克高分子聚合物的峰面积，得出高分子聚合物的含量。
5.进一步地限定，所述流动相的成分为：水、乙腈和三氟乙酸的体积比＝(74
‑
76):(24
‑
26):0.1。
6.进一步地限定，所述流动相的成分为：水、乙腈和三氟乙酸的体积比＝75:25:0.1。
7.进一步地限定，所述流动相与醋酸加尼瑞克的溶解比例为每1ml流动相含0.25mg的醋酸加尼瑞克。
8.进一步地限定，所述磷酸盐缓冲液与胸腺法新的溶解比例为每1ml中含0.05mg的胸腺法新。
9.进一步地限定，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/l。
10.进一步地限定，所述色谱条件为：利用tosoh tsk
‑
gel g2000swxl为色谱柱，检测波长208
‑
212nm，柱温23
‑
27℃，流速0.4
‑
0.6ml/min，进样后等度洗脱。
11.进一步地限定，所述等度洗脱的时间为30
‑
40分钟。
12.进一步地限定，所述色谱柱的规格为7.8mm
×
300mm
×
5μm
13.进一步地限定，所述分离度为≥1.5。
14.有益效果：
15.(1)本发明能准确检测出醋酸加尼瑞克高分子聚合物的含量，可以有效控制产品中高分子聚合物的含量，填补了现有检测方法对高分子聚合物类杂质无法检测的不足。
16.(2)本发明高效液相色谱检测过程中色谱柱的选择、流动相的选择，以及洗脱方式等的限定，共同保证了高分子聚合物含量检测结果的准确性；醋酸加尼瑞克聚合物杂质中分子量最小的为二聚物(分子量：3140)，由于无法获得二聚物对照品，根据凝胶法的原理，分子量越小的后出峰，所以，试验中以分子量略小于醋酸加尼瑞克二聚物的胸腺法新(分子量：3108)作为对照品，计算保留时间小于胸腺法新的杂质，确保分子量不小于醋酸加尼瑞克二聚物的杂质均可以检出。醋酸加尼瑞克在276nm和210nm均有紫外吸收，故采用不同流动相体系进行高效方法色谱条件筛选，将醋酸加尼瑞克与其二聚体以及多聚体进行有效分离，从而保证了检测结果的准确性。
17.(3)本发明仅需按要求配制对照品溶液、供试样品溶液，然后分别过同一个色谱柱，即能通过出峰时间、峰面积等计算得出高分子聚合物的含量，方法简单、操作性强。
附图说明
18.图1为哈尔滨吉象隆生物技术有限公司的醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200401)高分子聚合物系统适用性溶液hplc图谱；
19.图2为哈尔滨吉象隆生物技术有限公司的醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200401)高分子聚合物对照溶液hplc图谱；
20.图3为哈尔滨吉象隆生物技术有限公司的醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200401)高分子聚合物供试品溶液hplc图谱；
21.图4为哈尔滨吉象隆生物技术有限公司的醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200402)高分子聚合物系统适用性溶液hplc图谱；
22.图5为哈尔滨吉象隆生物技术有限公司的醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200402)高分子聚合物对照溶液hplc图谱；
23.图6为哈尔滨吉象隆生物技术有限公司的醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200402)高分子聚合物供试品溶液hplc图谱；
24.图7为vetter pharma
‑
fertigung gmbh&co.kg醋酸加尼瑞克注射液(批号：r005998)高分子聚合物系统适用性溶液hplc图谱如图7所示；
25.图8为vetter pharma
‑
fertigung gmbh&co.kg醋酸加尼瑞克注射液(批号：r005998)高分子聚合物对照溶液hplc图谱；
26.图9为vetter pharma
‑
fertigung gmbh&co.kg醋醋酸加尼瑞克注射液(批号：r005998)高分子聚合物供试品溶液hplc图谱；
27.图10为含有聚合物杂质的加尼瑞克粗肽色谱图；
28.图11为纯化后去除高聚物杂质的加尼瑞克色谱图；
29.图12为对比例1中筛选方式1高分子聚合物系统适用性溶液hplc图谱；
30.图13为对比例1中筛选方式2高分子聚合物系统适用性溶液hplc图谱。
具体实施例
31.实施例1.
32.一种加尼瑞克高分子聚合物的检测方法，该检测方法为利用高效液相色谱法，该高效液相色谱法的色谱条件如下：
33.1.供试品溶液：取醋酸加尼瑞克(哈尔滨吉象隆生物技术有限公司，批号：cp
‑
011
‑
20200401)适量，加流动相溶解制成每1ml约含0.25mg的溶液。
34.2.对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，加流动相定容至100ml，摇匀。
35.3.系统适用性溶液：取胸腺法新对照品和醋酸加尼瑞克对照品适量，胸腺法新用0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.0)溶解，醋酸加尼瑞克用流动相溶解并稀释制成每1ml中含胸腺法新约0.05mg，醋酸加尼瑞克约0.25mg的混合溶液。
36.4.色谱条件：用tosoh tsk
‑
gel g2000swxl为色谱柱(7.8mm
×
300mm
×
5μm )，以水
‑
乙腈
‑
三氟乙酸(75:25:0.1)为流动相，检测波长210nm，柱温25℃，流速0.5ml/min，进样体积20μl，等度洗脱30min。
37.5.测定法：精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，胸腺法新峰与醋酸加尼瑞克峰之间的分离度≥1.5。计算高分子聚合物的峰面积，进而计算得出高分子聚合物的含量；所述供试品溶液色谱图中保留时间小于胸腺法新的各杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5％)。
38.结果：醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200401)高分子聚合物系统适用性溶液hplc图谱如图1所示，系统适用性结果如表1所示，分离度为2.836大于1.5，说明胸腺法新和加尼瑞克的单分子成功分离。醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200401)高分子聚合物对照溶液hplc图谱如图2所示，供试品溶液稀释100后的峰面积作为聚合物杂质计算的分母；
39.醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200401)高分子聚合物供试品溶液hplc图谱如图3所示，图3表明没检出聚合物杂质。
40.表1系统适用性结果
[0041][0042]
5.高分子聚合物计算公式：
[0043][0044]
得到高分子聚合物的含量为0。
[0045]
实施例2.
[0046]
一种加尼瑞克高分子聚合物的检测方法，该检测方法为利用高效液相色谱法，该高效液相色谱法的色谱条件如下方法和步骤与实施例1相同，唯一的区别是醋酸加尼瑞克的批号不同，该实施例的批号是cp
‑
011
‑
20200402。
[0047]
结果：醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200402)高分子聚合物系统适用性溶液hplc图谱如图4所示，系统适用性结果如表2所示，分离度为3.068大于1.5，说明胸腺法新和加尼瑞克的单分子成功分离。醋酸加尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200402)高分子聚合物对照溶液hplc图谱如图5所示，供试品溶液稀释100后的峰面积作为聚合物杂质计算的分母；醋酸加
尼瑞克(批号：cp
‑
011
‑
20200402)高分子聚合物供试品溶液hplc图谱如图6所示，图6表明没检出聚合物杂质。
[0048]
表2系统适用性结果
[0049][0050][0051]
得到高分子聚合物的含量为0。
[0052]
实施例3.
[0053]
一种加尼瑞克高分子聚合物的检测方法，该检测方法为利用高效液相色谱法，该高效液相色谱法的色谱条件如下方法和步骤与实施例1相同，唯一的区别是醋酸加尼瑞克的品牌不同，该实施例检测的是德国vetter pharma
‑
fertigung gmbh&co.kg，批号r005998。
[0054]
结果：醋酸加尼瑞克注射液(批号：r005998)高分子聚合物对照溶液hplc图谱如图7所示，系统适用性结果如表3所示，分离度为2.854大于1.5，说明胸腺法新和加尼瑞克的单分子成功分离。醋酸加尼瑞克注射液(批号：r005998)高分子聚合物对照溶液hplc图谱如图8所示，供试品溶液稀释100后的峰面积作为聚合物杂质计算的分母；醋醋酸加尼瑞克注射液(批号：r005998)高分子聚合物供试品溶液hplc图谱如图9所示，图9表明没检出聚合物杂质。
[0055]
图3系统适用性结果
[0056][0057]
醋酸加尼瑞克高分子聚合物的检测结果如表4，含量为0.012％。
[0058]
表4醋酸加尼瑞克高分子聚合物检测结果
[0059][0060]
实施例4.
[0061]
1.重复性：配制6份醋酸加尼瑞0.5mg/ml、胸腺法新0.05mg/ml的混合溶液，分别稀释100倍为对照溶液，按自身对照法计算胸腺法新含量，结果如表5。
[0062]
表5重复性检测结果
[0063][0064][0065]
2.耐用性：选取实施例1的醋酸加尼瑞克，在实施例1方法的基础上改变色谱变化检测条件如表6所示，耐用性测定高分子聚合物结果如表7所示，结果表明，以下色谱条件均可以成功分离出醋酸加尼瑞克的高分子聚合物和醋酸加尼瑞克单分子。
[0066]
表6耐用性检测结果
[0067][0068]
表7耐用性测定高分子聚合物结果
[0069]
[0070][0071]
实施例5.
[0072]
1.检测醋酸加尼瑞克合成工艺过程中聚合物杂质的含量：
[0073]
(1)合成：采用目前主流的合成工艺固相合成法合成加尼瑞克。以ra树脂为固相载体，选用带fmoc保护的氨基酸为连接单元(最后一个氨基酸直接选用n端乙酰基保护的氨基酸ac
‑
d
‑
ala(2
‑
naphthyl)
‑
oh)，以hobt/dic为缩合试剂，脱fmoc保护基溶剂采用体积比为25％的哌啶/dmf溶液，按肽序从c端至n端的顺序依次连接氨基酸合成侧链全保护加尼瑞克肽树脂。
[0074]
(2)裂解：侧链全保护加尼瑞克肽树脂以三氟乙酸/三异丙基硅烷/茴香硫醚/纯化水为裂解液，其裂解液配比为tfa：tis：ta：水＝90:3:3:4(v/v)。采用上述裂解液进行加尼瑞克肽树脂裂解，使肽链与树脂及侧链保护基分离。得到的反应液使用甲基叔丁基醚进行多肽析出，然后将析出后粗肽混浊液采用g3砂芯漏斗进行抽滤，得到滤饼经干燥处理后加尼瑞克粗品。
[0075]
经裂解后得到加尼瑞克粗品，即得到无保护的肽链，包含有活性较高的
‑
nh2、
‑
cooh基团，在裂解工序处理过程中，多肽分子间存在发生酰胺键脱水缩合反应，进而形成聚合物杂质。因此将裂解后得到的加尼瑞克粗肽溶液进行高分子聚合物的检测，以确定聚合物杂质的含量。
[0076]
2.检测纯化后的醋酸加尼瑞克聚合物杂质的含量：
[0077]
(1)第一步纯化
[0078]
本工序采用dac150制备高效液相色谱系统对醋酸加尼瑞克粗肽溶液进行粗纯，去除非肽类和与目的肽极性相差较大的高分子聚合物等杂质。
[0079]
色谱条件：
[0080]
流动相a：乙腈/三氟乙酸(tfa)＝1000/1(v/v)；
[0081]
流动相b：纯化水/三氟乙酸(tfa)＝1000/1(v/v)；
[0082]
流速：400ml/min；
[0083]
检测器的采集波长：210nm。
[0084]
(2)第二步纯化
[0085]
本步工序采用dac150制备高效液相色谱系统对第一步纯化液进行提纯，该步能有针对性地去除在三氟乙酸体系下无法去除或分离效果不明显的一些工艺杂质，进一步提高产品质量。
[0086]
色谱条件：
[0087]
流动相a：乙腈；
[0088]
流动相b：冰乙酸/纯化水＝0.8/1000(v/v)，使用氨水调其ph至4.50
±
0.10；
[0089]
流速：400ml/min；
[0090]
检测器的采集波长：210nm。
[0091]
(3)第三步纯化
[0092]
本工序采用dac150制备高效液相色谱系统进行产品转盐，控制产品中的醋酸含量。该步除转盐作用外具有除杂能力，进一步提高产品质量。
[0093]
色谱条件：
[0094]
流动相a：乙腈；
[0095]
流动相b：冰乙酸/纯化水＝3/1000(v/v)；
[0096]
流动相c：0.1mol/l乙酸铵溶液
[0097]
流速：400ml/min；
[0098]
检测器的采集波长：210nm。
[0099]
检测经过三步纯化的醋酸加尼瑞克第三步纯化液，未检出高分子聚合物杂质，说明制备纯化工艺可以除去高分子聚合物类杂质。
[0100]
结果：含有聚合物杂质的加尼瑞克粗肽色谱图10所示，纯化后去除高聚物杂质的加尼瑞克色谱图11所示，醋酸加尼瑞克可以有效检测工艺过程个中间体的工作聚合物杂质含量，分别对含有聚合物杂质的醋酸加尼瑞克粗品和纯化后的醋酸加尼瑞克进行检测，粗品中明确的检测到高分子聚合物，而纯化后的醋酸加尼瑞克中不含有高分子聚合物杂质。
[0101]
对比例1.
[0102]
选取实施例1的醋酸加尼瑞克，采用其他的流动相处理，步骤和结果如表8、图12和图13所示，下述方法是分不开醋酸加尼瑞克的聚合物和醋酸加尼瑞克单分子的。
[0103]
表8分离醋酸加尼瑞克聚合物的方法
[0104][0105][0106]
以下实验验证实验效果：验证过敏反应
[0107]
通过高分子聚合物的检出，可以有效地指导纯化工艺对醋酸加尼瑞克产品中高分子聚合物类杂质去除，提高产品纯度，降低不良反应，保障产品安全性。
[0108]
依据《中国药典》2020版四部1147过敏反应检查法进行检测。本法系将一定量的供
试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品溶液进行激发，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。
[0109]
含聚合物杂质的供试品溶液的制备：取含有0.5％高聚物杂质的醋酸加尼瑞克以生理盐水配制成0.25mg/ml的溶液。
[0110]
不含聚合物杂质的供试品溶液的制备：取不含有高聚物杂质的醋酸加尼瑞克以生理盐水配制成0.25mg/ml的溶液。
[0111]
检查方法：取健康豚鼠6只，体重250～350g，隔日每只每次腹腔注射供试品溶液0.5ml，共3次，进行致敏。每日观察每只动物的行为和体征，首次致敏和激发前称量并记录每只动物的体重。然后将其均分为2组，每组3只，分别在首次注射后第14日和第21日，由静脉注射供试品溶液1ml进行激发。观察激发后30分钟内动物有无过敏反应症状，过敏反应症状包括竖毛、发抖、干呕、喷嗖、咳嗽、紫癫、呼吸困难、二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克、死亡。
[0112]
检查结果如表9所示，含高分子聚合物杂质的醋酸加尼瑞克产品较不含高分子聚合物杂质的醋酸加尼瑞克产品的过敏反应更严重，去除高分子聚合物杂质可以降低醋酸你就认可产品的致敏性。
[0113]
表9过敏反应结果
[0114][0115]