1-环己基哌嗪中的醋酸的检测方法与流程

1.本发明属于药物分析技术领域，具体而言，涉及1-环己基哌嗪中的醋酸的检测方法。


背景技术：

2.化合物v是一种口服生物可利用的小分子血小板生成素受体激动剂,用于预接受手术的慢性肝病患者血小板减少症。
[0003][0004]
化合物v的制备过程中，用到了起始原料1-环己基哌嗪即化合物x，专利申请wo2010051374a1公开的合成路线如下：
[0005][0006]
根据该合成路线，醋酸作为化合物x的起始原料之一，在中间体化合物iii的合成步骤中使用，其同样也是需要监控的杂质之一。因此，亟需一种能够监测醋酸在化合物x中的含量的检测方法。


技术实现要素：

[0007]
一方面，本发明提供了一种化合物x中醋酸的检测方法，其特征在于：所述方法是高效液相色谱法，该方法采用反相色谱柱，以磷酸水溶液和甲醇的混合溶液作为洗脱液，按等度或梯度洗脱，其中，化合物x的结构式为
[0008][0009]
在一些典型的实施方案中，以流动相a和/或流动相b作为洗脱液，其中流动相a为磷酸水溶液；流动相b为甲醇；在一些实施方案中，所述磷酸水溶液浓度为0.045％～0.055％；优选地，所述磷酸水溶液浓度为0.05％。
[0010]
在一些实施方案中，所述磷酸水溶液需用强碱调节ph值至3.0，所述强碱选自碳酸钠，碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾和三乙胺中的一种，优选地，所述强碱
为氢氧化钠。
[0011]
在一些实施方案中，所述反相色谱柱采用非极性固定相作为填料；优选地，所述反相色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料；更为优选地，所述反相色谱柱为waterst3，其规格为4.6mm
×
100mm，5μm。
[0012]
在一些实施方案中，所述柱温为25℃～35℃；优选地，所述柱温为30℃。
[0013]
在一些典型的实施方案中，所述流动相a和流动相b梯度洗脱的流动相初始比例为100～98：0～2，优选100：0，流动相a比例与流动相b比例总和为100％；其中流动相a比例是指流动相a体积占洗脱液总体积的百分比，流动相b比例是指流动相b占洗脱液总体积的百分比。
[0014]
在一些更为典型的实施方案中，所述流动相a和流动相b按以下程序梯度洗脱：
[0015][0016]
且在梯度洗脱过程中，流动相a比例与流动相b比例总和为100％；其中流动相a比例是指流动相a体积占洗脱液总体积的百分比，流动相b比例是指流动相b占洗脱液总体积的百分比。
[0017]
在一些实施方案中，所述洗脱液的流速为0.9～1.1ml/min；优选地，所述洗脱液的流速为1ml/min。
[0018]
在一些实施方案中，所述检测方法在高效液相色谱仪上进行，采用二极管阵列检测器或紫外检测器；在一些典型的实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外检测器，且其检测波长为200nm～220m；优选为210nm。
[0019]
另一方面，本发明提供了一种化合物x中醋酸的检测方法，其特征在于：所述方法是高效液相色谱法，该方法采用反相色谱柱，检测器是紫外吸收检测器，检测波长是210nm；
[0020]
柱温为30℃；
[0021]
流动相a为0.05％磷酸水溶液(用氢氧化钠调节ph值至3.0)；
[0022]
流速为1.0ml/min；
[0023]
流动相b为甲醇；按下表进行梯度洗脱；
[0024]
[0025]
其中，化合物x的结构式为
[0026][0027]
在一些典型的实施方案中，本发明提供了一种化合物x中醋酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0028]
(1)供试品溶液配制：取化合物x供试品适量，精密称定，加甲醇-水(10:90)适量超声使之溶解并稀释制成合适浓度的溶液；
[0029]
(2)对照品溶液配制：取醋酸适量，精密称定，加甲醇-水(10:90)稀释并制成合适浓度的溶液；
[0030]
(3)供试品测定：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(waterst3，4.6mm
×
250mm，5μm或效能相当的色谱柱)；以0.05％磷酸溶液为流动相a(用2mol/l氢氧化钠调节ph值至3.0)，以甲醇为流动相b，按下表进行洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为210nm；
[0031][0032]
取供试品溶液和/或对照品溶液适量，注入液相色谱仪，记录色谱图；
[0033]
(4)通过外标法测定供试品中醋酸的含量；其中，化合物x的结构式为
[0034][0035]
本领域技术人员容易理解，本技术中所述的分析方法的部分操作步骤可以调换而不影响，例如供试品溶液的配制和对照品溶液的配制步骤可以任意调换。
[0036]
本技术中，除非另有说明，用以“供试品配置”的化合物x包括但不限于新制备或经储存的化合物x原料药、包含化合物x的药物组合物。
[0037]
本技术中，磷酸水溶液浓度表示为体积比，即磷酸和水体积的比值；例如0.05％磷酸水溶液表示1000ml水中含有0.5ml磷酸。
[0038]
本技术中，适量是指在根据实验目的，各化合物的量均在其高效液相色谱仪的检测限或定量限范围内。
[0039]
本技术中，合适浓度是指在根据实验目的，各化合物的浓度均在其高效液相色谱
仪的检测限或定量限范围内。
[0040]
除非另有特定说明，本技术中缩写具有如下含义：
[0041]
min:分钟；
[0042]
ml:毫升；
[0043]
μl:微升；
[0044]
loq：定量限
[0045]
本发明提供的醋酸的检测方法，可以改善醋酸的峰形，检测灵敏度高、专属性好和准确度高。
附图说明
[0046]
图1实施例1空白溶剂色谱图
[0047]
图2实施例1对照品溶液色谱图
[0048]
图3实施例1供试品溶液色谱图
[0049]
图4实施例1加标供试品溶液色谱图
[0050]
图5实施例2加标供试品溶液色谱图
[0051]
图6实施例3加标供试品溶液色谱图
[0052]
图7实施例3供试品溶液色谱图
具体实施方式
[0053]
除特别提到的外，本发明申请以下实施例中所用的试剂、原料均商业购买可得。
[0054]
实施例中所采用的化合物x供试品为参照专利申请wo2010051374a1说明书第84-85页中的a0023制备实施例的步骤a)和步骤b)制备得到。
[0055]
实施例1
[0056]
空白溶剂：甲醇－水(10:90)
[0057]
色谱柱：kromasil 100-5c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；
[0058]
流动相；以0.07％磷酸水溶液(用2mol/l氢氧化钠调节ph值至3.0)为流动相a，以甲醇为流动相b；
[0059]
流速：1.0ml/min；
[0060]
柱温：30℃；
[0061]
检测波长：210nm；
[0062]
进样体积：50μl；
[0063]
梯度洗脱程序见下表
[0064][0065]
溶液的配制：
[0066]
对照品溶液：取醋酸适量，精密称定，用甲醇－水(10:90)稀释制成每1ml中约含25μg的溶液。
[0067]
供试品溶液：取化合物x适量，精密称定，加甲醇-水(10:90)溶解并稀释制成每1ml中约含5.0mg的溶液。
[0068]
加标供试品溶液：取化合物x适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(10:90)适量使溶解，再加入对照品溶液适量，用甲醇-水(10:90)稀释制成每1ml含化合物x 5mg、醋酸25μg的溶液，作为加标供试品溶液。
[0069]
取上述空白溶剂、加标供试品溶液、对照品溶液与供试品溶液各适量，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液与加标供试品溶液的图谱分别如图1～4所示。如图3和图4所示，醋酸检测峰峰形较差。
[0070]
实施例2
[0071]
空白溶剂：甲醇-水(10:90)
[0072]
色谱柱：t3 c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；
[0073]
流动相；以0.05％磷酸水溶液(用2mol/l氢氧化钠调节ph值至3.0)为流动相a，以甲醇为流动相b；
[0074]
流速：1.0ml/min；
[0075]
柱温：30℃；
[0076]
检测波长：210nm；
[0077]
进样体积：50μl；
[0078]
梯度洗脱程序见下表
[0079][0080]
溶液的配制：
[0081]
对照品溶液：取醋酸适量，精密称定，用甲醇-水(10:90)稀释制成每1ml中约含25μg的溶液。
[0082]
供试品溶液：取化合物x适量，精密称定，加甲醇-水(10:90)溶解并稀释制成每1ml中约含5.0mg的溶液。
[0083]
加标供试品溶液：加标供试品溶液：取化合物x适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(10:90)适量使溶解，再加入对照品溶液适量，用甲醇-水(10:90)稀释制成每1ml含化合物x 5mg、醋酸25μg的溶液，作为加标供试品溶液。
[0084]
取上述空白溶剂、加标供试品溶液与供试品溶液各适量，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中，试验结果见表1，加标供试品溶液图谱如图5所示。
[0085]
表1分离度试验结果汇总
[0086][0087]
结果显示，加标供试品溶液的色谱图中，醋酸峰的峰形得到改善，醋酸峰的保留时间为5.566min，其与相邻色谱峰之间的分离度为1.492＜1.5，分离度较小的色谱峰为供试品溶液中的未知色谱峰，发明人在此基础上进一步优化该色谱条件。
[0088]
实施例3.
[0089]
空白溶剂：甲醇-水(10:90)
[0090]
色谱柱：t3 c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；
[0091]
流动相；以0.05％磷酸水溶液(用2mol/l氢氧化钠调节ph值至3.0)为流动相a，以甲醇为流动相b；
[0092]
流速：1.0ml/min；
[0093]
柱温：30℃；
[0094]
检测波长：210nm；
[0095]
进样体积：50μl；
[0096]
梯度洗脱程序见下表
[0097][0098]
溶液的配制：
[0099]
对照品溶液：取醋酸适量，精密称定，用甲醇-水(10:90)稀释制成每1ml中约含25μg的溶液。
[0100]
供试品溶液：取化合物x适量，精密称定，加甲醇-水(10:90)溶解并稀释制成每1ml中约含5.0mg的溶液。
[0101]
加标供试品溶液：取化合物x适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(10:90)适量使溶解，再加入对照品溶液适量，用甲醇-水(10:90)稀释制成每1ml含化合物x 5mg、醋酸25μg的溶液，作为加标供试品溶液。
[0102]
取上述空白溶剂、加标供试品溶液与供试品溶液各适量，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，试验结果见表2，其中加标供试品溶液图谱见图6，供试品溶液图谱见图7。
[0103]
表2分离度试验结果汇总
[0104][0105]
注：“/”代表无相邻色谱峰，无法计算分离度
[0106]
从图6可以看出，空白溶剂对本品中醋酸的测定无干扰；醋酸峰的保留时间为6.864min，和图5相比，醋酸峰后面的2个杂质峰也都跑到10min后了，也即其他杂质峰均在5min之间或者10min之后，对供试品中醋酸的检查无干扰。
[0107]
实施例4.
[0108]
(1)空白溶剂：甲醇-水(10:90)
[0109]
(2)供试品溶液配制：取化合物x适量，精密称定，加溶剂[甲醇-水(10:90)]适量超声使之溶解并稀释制成每1ml中约10.0mg的溶液。
[0110]
(3)对照品溶液配制：取醋酸适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(10:90)稀释并制成每1ml中约含50μg的溶液。
[0111]
(4)加标供试品溶液：取化合物x适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(10:90)适量使溶解，再加入对照品溶液适量，用溶剂甲醇-水(10:90)稀释制成每1ml含化合物x 10mg、醋酸50μg的溶液，作为加标供试品溶液。
[0112]
(5)色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(waterst3，4.6mm
×
250mm，5μm的色谱柱)；以0.05％磷酸水溶液为流动相a(用2mol/l氢氧化钠调节ph值至3.0)，以甲醇为流动相b，按下表进行洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为210nm。
[0113][0114]
(6)进样：取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液及加标供试品溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0115]
(7)测定：用外标法计算醋酸含量；
[0116]
公式如下：c
x
＝c
r x a
x
/ar[0117]
其中：c
x
为供试品中醋酸浓度；
[0118]cr
为醋酸对照品浓度；
[0119]ax
为供试品中醋酸峰面积；
[0120]ar
为醋酸对照品峰面积。
[0121]
实施例5醋酸含量测定
[0122]
空白溶剂：甲醇-水(10:90)
[0123]
对照品贮备液：取醋酸适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(10:90)溶解并稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为对照品贮备液。
[0124]
对照品溶液：精密量取对照品贮备液适量，加溶剂甲醇-水(10:90)稀释制成每1ml中约含50μg的溶液，作为对照品溶液。
[0125]
供试品溶液：取化合物x适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(10:90)溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液，作为供试品溶液。
[0126]
取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表3。
[0127]
表3醋酸含量测定结果
[0128]
供试品批次12含量(％)0.050.17
[0129]
上述方法经过方法学验证，包括定量限与检测限、线性和范围试验、准确度实验以及专属性试验，见实施例6～10。经过这些验证，证明本发明提供的分析方法实用可靠，稳定性较好。
[0130]
实施例6专属性试验
[0131]
空白溶剂：甲醇-水(10:90)
[0132]
对照品贮备液：取醋酸适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(10:90)溶解并稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液，作为对照品贮备液。
[0133]
对照品溶液：精密量取对照品贮备液适量，加溶剂甲醇-水(10:90)稀释制成每1ml中约含50μg的溶液，作为对照品溶液。
[0134]
供试品溶液：取化合物x适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(10:90)溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液，作为供试品溶液。
[0135]
加标供试品溶液：取化合物x约适量，精密称定，加溶剂甲醇-水(10:90)适量使溶解，再加入对照品贮备液适量，用溶剂甲醇-水(10:90)稀释制成每1ml约含化合物x10mg、醋酸50μg的溶液，作为加标供试品溶液。
[0136]
取空白溶剂、对照品溶液及加标供试品溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表4。
[0137]
表4专属性试验结果
[0138][0139]
注：
“‑”
表示分离度无法计算
[0140]
结果表明：空白溶剂不干扰供试品溶液中醋酸的检测；加标供试品溶液色谱图中，醋酸峰前后均无杂质峰干扰，该方法的专属性良好。
[0141]
实施例7定量限、检测限
[0142]
根据醋酸对照品溶液的响应值，量取醋酸对照品溶液适量，逐级稀释，精密量取稀释溶液50μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按信噪比≥10:1作为定量限溶液；按信噪比≥3:1作为检测限溶液，并取定量限溶液，连续进样6次，计算峰面积与保留时间的rsd。试验结果见表5～表6。
[0143]
表5.定量限结果
[0144][0145]
表6.检测限结果
[0146]
[0147][0148]
由上述试验结果可知：醋酸的定量限浓度的信噪比、保留时间rsd值以及峰面积的rsd值满足验证要求；检测限溶液的信噪比的最小值为4.5＞3，检测限和定量限浓度均小于限度浓度的50％，满足验证要求，表明该方法能够满足醋酸检测灵敏度的要求。
[0149]
实施例8线性和范围
[0150]
对照品贮备液：照“专属性”项下配制对照品贮备液。
[0151]
取对照品贮备液适量，加溶剂甲醇-水(10:90)稀释制成含醋酸浓度为定量限、相当于限度浓度20％、50％、80％、100％、150％与200％的线性系列溶液，所述限度浓度是50μg/ml，精密量取上述线性溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度(μg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。试验结果见表7。
[0152]
表7.醋酸线性试验结果
[0153][0154]
注：
“‑”
引用实施例7的表5定量检测峰面积数据。
[0155]
结果表明，醋酸在浓度0.20μg/ml～101.03μg/ml范围内，峰面积与浓度间线性关系良好。
[0156]
实施例9准确度实验
[0157]
溶剂：甲醇-水(10:90)
[0158]
对照品贮备液：照“专属性”项下配制对照品贮备液。
[0159]
对照品溶液：照“专属性”项下配制对照品溶液。
[0160]
供试品溶液：照“专属性”项下配制供试品溶液。
[0161]
50％准确度溶液：取化合物x供试品约200mg，精密称定，置20ml量瓶中，加少量甲醇-水(10:90)溶解后，精密加入对照品贮备液1ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为50％准确度溶液，平行配制3份。
[0162]
100％准确度溶液：取化合物x供试品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加少量甲醇-水(10:90)溶解后，精密加入对照品贮备液1ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为100％准确度溶液，平行配制3份。
[0163]
150％准确度溶液：取化合物x供试品约200mg，精密称定，置20ml量瓶中，加少量溶剂溶解后，精密加入对照品贮备液3ml，用甲醇-水(10:90)稀释至刻度，摇匀，作为150％准确度溶液，平行配制3份。
[0164]
精密量取上述溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算回收率。试验结果见表8。
[0165]
表8.回收率试验结果
[0166][0167]
其中回收率的计算公式为：回收率(％)＝[(测得量-原有量)/(加入量)]
×
100％
[0168]
结果表明，醋酸在相当于限度浓度50％、100％、150％浓度水平下，回收率均在100.8％～102.5％之间，满足80％～120％的验证要求，且3个不同浓度水平共9份供试品溶液的回收率的rsd值为0.7％＜10.0％，该方法的准确度良好。
[0169]
实施例10耐用性
[0170]
对照品溶液：照“专属性”项下配制对照品溶液。
[0171]
加标供试品溶液：取化合物x供试品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加少量甲醇-水(10:90)溶解后，精密加入对照品溶液1ml，用甲醇-水(10:90)稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液(平行配制6份)。
[0172]
在不同耐用性试验条件(表9)下，取对照品溶液与加标供试品溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。考察对照品溶液中醋酸峰的理论板数与加标供试品溶液中醋酸检出量的变化情况。试验结果见表10。
[0173]
表9.耐用性色谱条件
[0174]
注：色谱条件1为实施例4的色谱条件；色谱柱1和2都是t3 c18(4.6mm
×
250mm，5μm)，属于同型号不同批次色谱柱。
[0175]
表10.耐用性结果
[0176][0177][0178]
注：“/”代表无数值。
[0179]
结果表明：将色谱条件中的参数微小变动，适当改变流速
±
0.1ml/min、柱温
±
5℃、流动相初始比例-2％、磷酸浓度
±
0.005％和更换不同批次的色谱柱，对照品溶液中醋酸的理论板数按醋酸峰计最小值为11500均大于2000；不同色谱条件下，加标供试品溶液中醋酸检出量与标准条件的差值最大为0.02％均小于0.05％，该方法耐用性良好。