一种等离子增强荧光的近红外荧光传感器及其制备方法和应用

1.本发明属于等离子增强荧光的技术领域，具体涉及一种等离子增强荧光的近红外荧光传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肝癌是最致命的恶性肿瘤之一，其发病率仍在逐年攀升。越来越多的证据表明脂多糖的水平的高低与肝癌的发展阶段紧密相关。脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的结构成分，微量的脂多糖进入机体会引发目标器官毒性甚至导致感染休克。因此准确检测脂多糖对于疾病预防、治疗、诊断有重要意义。临床上脂多糖的检测主要依赖与鲎试剂，然而该试剂受温度、ph等环境因素影响大。此外，葡萄糖的存在还会导致结果假阳性，极大的限制了其在生物医学领域的应用。更重要的是鲎试剂的广泛使用导致马蹄蟹(鲎)的数量急剧减少。2019年，世界自然保护联盟的《红色名录》将鲎列为濒危动物。发展高效、灵敏的方法取代鲎试剂用于脂多糖的临床检测十分迫切。
3.荧光传感技术的发展使开发不依赖于鲎试剂的传感器成为可能。但是荧光染料有很多固有缺点，比如易受背景荧光干扰、激发光谱窄、光稳定性差等。近红外染料因其深的组织穿透力、低的背景荧光干扰和对生物样品最小的光损伤引起了广泛关注。然而近红外染料光致发光低、生物相容性差和光稳定性使其在实现脂多糖活体成像上仍面临重大挑战。目前有文献报道使用四甲基罗丹明b标记脂多糖识别肽用于脂多糖的荧光定量检测，其使用的荧光染料四甲基罗丹明存在荧光稳定性较差以及波长较短等缺点限制了其进一步的应用和发展。所以，设计制备特定的近红外荧光传感器实现脂多糖的准确定量以及体内成像对于肝癌的早期预防、诊断和治疗具有重要意义。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种等离子增强荧光的近红外荧光传感器的制备方法，通过等离子增强荧光技术提高近红外染料的光致发光强度，利用亲水性聚合物刷修饰增加传感器的生物相容性和光稳定性。制备得到的近红外荧光传感器具有良好的生物相容性和光稳定性，具有脂多糖浓度依赖性“关
‑
开”特性，可以作为特异性脂多糖浓度指示剂，并且其制备过程简单，且表面多肽kc13修饰使其能够特异性靶向脂多糖并在革兰氏阴性菌表面成像。
5.本发明还提供该近红外荧光传感器的制备方法所制备的近红外荧光传感器以及该近红外荧光传感器在脂多糖定量检测和活菌荧光成像中的应用。
6.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种等离子增强荧光的近红外荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)将十六烷基三甲基溴化铵、氯金酸、硼氢化钠混合反应制成种子液；
8.(2)将十六烷基三甲基溴化铵、5
‑
溴水杨酸或者水杨酸钠、硝酸银、氯金酸、抗坏血
酸混合反应得到生长液；
9.(3)将种子液加入到生长液中反应得到金纳米棒溶液；
10.(4)将聚乙二醇、多肽kc13加入到中金纳米棒溶液中反应得到聚乙二醇和多肽kc13修饰的金纳米棒溶液；
11.(5)将染料cy7、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐、n
‑
羟基琥珀酰亚胺加入聚乙二醇和多肽kc13修饰的金纳米棒反应得到等离子增强荧光的近红外荧光传感器。
12.其中，步骤(1)中将氯金酸水溶液加入到十六烷基三甲基溴化铵水溶液中混匀，在剧烈搅拌下加入冰冷硼氢化钠溶液持续搅拌2
‑
3分钟，观察到溶液由明黄色变成茶棕色。
13.进一步地，步骤(1)制备的种子液在下一步使用前需在室温下静置老化30
‑
60分钟得到老化种子液。
14.其中，步骤(1)中十六烷基三甲基溴化铵、氯金酸、硼氢化钠的摩尔比为1000：2
‑
3：5
‑
8。
15.作为优选，步骤(1)中十六烷基三甲基溴化铵、氯金酸、硼氢化钠的摩尔比为1000：2.5：6，质量比为364.5：8.5：0.2。
16.其中，步骤(2)中将硝酸银溶液加入十六烷基三甲基溴化铵和5
‑
溴水杨酸或者水杨酸钠的混合溶液中，在28
‑
30℃下静置15
‑
20分钟。随后加入氯金酸溶液轻搅15
‑
20分钟，在剧烈搅拌下加入抗坏血酸溶液，持续搅拌溶液由明黄色变为无色得到生长液体。
17.进一步地，上述生长液应在制备成功时立即使用。
18.其中，步骤(2)中十六烷基三甲基溴化铵、5
‑
溴水杨酸或者水杨酸钠、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸的摩尔比为1976：500：1
‑
2：5
‑
6。
19.作为优选，骤(2)中十六烷基三甲基溴化铵、5
‑
溴水杨酸或者水杨酸钠、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸的摩尔比为1976：500：1.92：5.12，质量比为720：88：0.33：67.96：0.91。
20.其中，步骤(3)中种子液在剧烈搅拌下快速加入步骤(2)中得到的生长液持续搅拌30
‑
40秒，在28
‑
30℃下静置生成10
‑
12小时得到金纳米棒溶液。
21.进一步地，将得到的金纳米棒溶液在8500rpm下离心15分钟，用纯水洗涤重复两次，用纯水重新分散得到纯净的金纳米棒溶液。
22.作为优选，步骤(4)中将摩尔比1：1的聚乙二醇溶液、多肽kc13溶液加入步骤(3)得到的金纳米棒溶液混合搅拌10
‑
15分钟，接着通入惰性气体，在室温下搅拌反应1小时得到聚乙二醇和多肽kc13双功能化的金纳米棒溶液。
23.进一步地，将得到的聚乙二醇和多肽kc13双功能化的金纳米棒溶液在13000rpm下离心15分钟，用纯水洗涤重复两次，用纯水重新分散得到纯净的聚乙二醇和多肽kc13双功能化的金纳米棒溶液(aunrs
‑
peg/kc13)。
24.其中，步骤(5)中将染料cy7、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐、n
‑
羟基琥珀酰亚胺混合，加入纯水超声溶解，在室温下搅拌反应30
‑
40分钟得到活化的羧基反应性cy7
‑
nhs酯溶液，将其加入聚乙二醇和多肽kc13修饰的金纳米棒溶液在室温下反应3
‑
4小时,进一步地，将得到的聚乙二醇、多肽kc13和cy7功能化的金纳米棒溶液在13000rpm下离心15分钟，用纯水洗涤重复两次，用纯水重新分散得到纯净的聚乙二醇、多肽kc13和cy7功能化的金纳米棒溶液(aunrs
‑
peg/kc13
‑
cy7)即得到等离子增强的近红外荧光传感器。
25.作为优选，cy
‑
7、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐、n
‑
羟基琥珀酰亚胺三
者的摩尔比为2900：1：2.5。
26.本发明所述的制备方法所制备的等离子增强荧光的近红外荧光传感器。
27.本发明所述的制备方法所制备的近红外荧光传感器在制备脂多糖的浓度指示剂和活菌成像试剂中的应用。
28.作为优选，本发明制备的等离子增强荧光的近红外荧光传感器可用于革兰氏阴性菌如大肠杆菌的活体成像，实现革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的区分。
29.本发明以纯水为溶剂，在常温常压下制备了具有良好水溶性的金纳米棒。金纳米棒具有独特的表面等离子特性，当荧光染料与金纳米棒维持适当的距离时，金纳米棒能起到增强荧光染料荧光的作用。利用聚乙二醇来控制金纳米棒和荧光染料的距离可以提高其稳定性同时增强其生物相容性。在其表面接上脂多糖结合肽，使其能与脂多糖特异性结合并引起荧光信号的变化从而实现脂多糖的准确定量，有效解决脂多糖选择性差。
30.本发明选用的近红外荧光染料cy7具有深的组织穿透特性、低的背景荧光干扰和最小的光损伤，有望实现脂多糖的活体成像。本发明首次开发了等离子增强荧光近红外荧光传感器并用于脂多糖的准确检测和活菌的荧光成像，不仅具有深的组织穿透特性、低的背景荧光干扰和最小的光损伤，同时还解决了现有近红外荧光染料光致发光强度低、生物相容性差以及脂多糖检测存在选择性差等技术问题。
31.本发明制备的一种等离子增强荧光的近红外荧光传感器，其可用于脂多糖的定量检测和活菌荧光成像。该等离子增强荧光的近红外荧光传感器，采用的金纳米棒的等离子增强作用可以有效的实现cy7荧光强度的增强，实现荧光信号的放大和cy7荧光染料荧光稳定性的增强，从而可以有效提高检测的灵敏度。其次采用cy7这一近红外发射的荧光染料可以避免生物体的自体干扰，从而提高识别的准确性。再次，利用识别肽的特异性识别作用，可以实现革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的有效区分。最后该荧光传感器制备工艺简单易行，易于规模化生产。本发明的等离子增强荧光的近红外荧光传感器制备方法为：在常温常压下制备了具有良好水溶性的金纳米棒，巯基和氨基双功能化的聚乙二醇通过金硫键和酰胺键分别与金纳米棒和cy7染料连接用于控制金纳米棒与染料之间的距离，实现荧光增强。脂多糖结合肽kc13通过金硫键与金纳米棒键合从而用于脂多糖的特异性识别。本发明中使用的肽kc13能与脂多糖特异性结合，探针能通过kc13与革兰氏阴性菌细胞壁中的脂多糖结合从而吸附在革兰氏阴性菌的表面，由于脂多糖的存在会增强探针的荧光，所以探针吸附在革兰氏阴性菌的表面时荧光会增强从而实现对革兰氏阴性菌的成像。同时随着脂多糖浓度的增加，探针的荧光会逐渐增强形成“有脂多糖浓度依赖性“关
‑
开”特性。
32.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
33.1、本发明制备的等离子增强荧光近红外荧光传感器选用近红外荧光染料cy7作为荧光来源，具有组织穿透力深、背景荧光干扰低和光损伤低的优点。
34.2、本发明制备的等离子增强荧光近红外荧光传感器选用金纳米棒作为等离子基元，金纳米棒具有从可见光区到近红外光区可调谐的等离子共振波长，能通过筛选不同的等离子共振波长的金纳米棒来实现最大的等离子增强荧光效果进而探究等离子增强荧光的机制。
35.3、本发明制备的等离子增强荧光近红外荧光传感器选用亲水性聚合物材料聚乙二醇来控制等离子基元与染料之间的距离，实现了染料的荧光增强，同时聚乙二醇的修饰
提高了近红外传感器的生物相容性和稳定性，使该荧光传感器能实现活菌中的脂多糖成像。
36.4、本发明制备的等离子增强荧光近红外荧光传感器表面修饰了脂多糖结合肽kc13使其能在复杂的生物介质中特异性捕获脂多糖并产生荧光信号的变化，该近红外荧光传感器对50
‑
6000ng/ml的脂多糖有线性响应，检出限为3.85ng/ml。
37.5、本发明的等离子增强荧光近红外荧光传感器制备工艺简单易行，并且制备的等传感器稳定性好，排除细胞自体荧光干扰功能，其可用于脂多糖的体外检测和革兰氏阴性菌的活体成像，同时制备工艺简单易行，易于规模化生产。
38.6、本发明的等离子增强荧光近红外荧光传感器对脂多糖的浓度响应为荧光“开启式”响应，即随着脂多糖的浓度升高，近红外荧光传感器的荧光强度逐渐增强这对于实现体内微量脂多糖成像是有益的。
39.7、本发明利用近红外荧光染料cy7用于荧光成像时可以有效地避免自体荧光的干扰。但是cy7存在荧光稳定性差的缺点，采用金纳米棒的等离子增强荧光方式可以有效提高其荧光稳定性，为期进一步应用提供了可能，并通过kc13特异性识别肽的修饰可以有效提高传感器的特异性，该荧光传感器可以有效地区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
附图说明
40.图1为本发明制备的不同等离子共振波长的金纳米棒的紫外光谱图。
41.图2为本发明制备的不同等离子共振波长的金纳米棒修饰的近红外荧光传感器的荧光发射光谱图。
42.图3为本发明制备的不同分子量的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器的荧光发射光谱图。
43.图4为等离子共振波长为766nm的金纳米棒和分子量为5000的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器与不同浓度的脂多糖响应的荧光发射光谱图。
44.图5为等离子共振波长为766nm的金纳米棒和分子量为5000的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器与活菌响应的荧光成像图。
45.图6为等离子共振波长为766nm的金纳米棒和分子量为5000的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器与活菌响应的sem成像图。
46.图7为不修饰kc13的等离子共振波长为766nm的金纳米棒和分子量为5000的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器与不同浓度的脂多糖响应的荧光发射光谱图。
47.图8为不同干扰物存在的情况下近红外荧光传感器的荧光响应图。
48.图9为近红外荧光传感器的活菌成像示意图。
49.图10为近红外荧光传感器与细菌结合后的sem成像图。
具体实施方式
50.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
51.实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特
殊说明，均可从商业途径获得。
52.其中，实施例使用的聚乙二醇均为nh2‑
(ch2)2‑
(och2ch2)
n
‑
sh，分子量1000，5000，10000，购于广州碳水科技有限公司。
53.多肽kc13购于上海普淘生物技术有限公司，序列为kknysssissihc。
54.cy7购于大连美仑生物技术有限公司，型号sulfo
‑
cyanine7 carboxylic acid(cy7)。
55.实施例1
56.制备等离子增强荧光的近红外荧光传感器
57.1、种子液的制备
58.将5ml十六烷基三甲基溴化铵水溶液(0.2m)与5ml氯金酸水溶液(0.5mm)混匀，在剧烈搅拌下加入600ul冰冷硼氢化钠水溶液(0.01m)持续搅拌2分钟观察到反应液由明黄色变成茶棕色，停止搅拌得到种子液。种子液在使用前需在室温下静置老化30分钟。
59.2、生长液的制备
60.将720mg的十六烷基三甲基溴化铵加入圆底烧瓶中，随后加入88mg水杨酸钠，再加入20ml的纯水，加热至70℃使其完全溶解于纯水中，冷却至室温，加入480ul硝酸银溶液(4mm)在30℃下静置15分钟，随后加入20ml氯金酸水溶液(0.1mm)在30℃下轻搅15分钟，在剧烈搅拌下加入80ul抗坏血酸水溶液(0.64mm)持续搅拌至溶液由明黄色变为无色透明溶液，得到生长液。生长液必须现配现用。
61.3、金纳米棒的制备
62.将步骤(1)得到的种子液取128μl加入步骤(2)制备的全部生长液中剧烈搅拌30秒，在30℃静置反应12小时得到等离子共振波长为665nm的金纳米棒溶液。将得到的金纳米棒溶液在8500rpm下离心15分钟，用纯水洗涤重复两次，沉淀用4ml纯水重新分散得到纯净的金纳米棒溶液(au nrs 665)。
63.如需合成等离子共振波长为766nm的金纳米棒溶液(au nrs 766)只需将步骤(2)中的水杨酸钠更换为等质量5
‑
溴水杨酸，将硝酸银溶液的加入量更换为960ul，抗坏血酸的加入量更换为160ul，重复步骤(2)(3)即可。
64.如需合成等离子共振波长为835nm的金纳米棒溶液(au nrs 835)只需将步骤(2)中的水杨酸钠更换为等质量5
‑
溴水杨酸，将硝酸银溶液的加入量更换为1.92ml，抗坏血酸的加入量更换为160ul，重复步骤(2)(3)即可。
65.4、聚乙二醇和多肽kc13双功能化的金纳米棒(aunrs665
‑
peg/kc13)的制备
66.将72ul聚乙二醇(5000，nh2‑
(ch2)2‑
(och2ch2)
n
‑
sh(20um)水溶液和72ul多肽kc13(20um)水溶液混合均匀分别加入1ml金纳米棒溶液(au nrs 665)中，在室温下摇晃反应1小时。将得到的聚乙二醇和多肽kc13双功能化的金纳米棒溶液在13000rpm/min下离心15分钟，用纯水洗涤重复两次，沉淀用10ml纯水重新分散得到纯净的聚乙二醇和多肽kc13双功能化的金纳米棒溶液。
67.5、等离子增强荧光的近红外荧光传感器(aunrs665
‑
peg5000/kc13
‑
cy7)的制备
68.将2.5ml 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐(200nmol)和2.5ml n
‑
羟基琥珀酰亚胺(200nmol)混合加入到5ml的染料cy7溶液(0.029mmol/l)中，在室温下搅拌反应30分钟得到活化的羧基反应性cy7
‑
nhs酯溶液，加入到上述制备的全部聚乙二醇和多肽kc13
双功能化的金纳米棒溶液在室温下反应4小时，将得到的聚乙二醇、多肽kc13和cy7功能化的金纳米棒溶液在13000rpm下离心15分钟，用纯水洗涤两次，沉淀用20ml纯水重新分散得到纯净的金纳米棒溶液，即得到等离子增强的近红外荧光传感器。
69.同时步骤4和5中采用等离子共振波长为766nm的金纳米棒溶液或者等离子共振波长为835nm的金纳米棒溶液，得到不同的等离子增强的近红外荧光传感器(aunrs766
‑
peg5000/kc13
‑
cy7)、(aunrs835
‑
peg5000/kc13
‑
cy7)。
70.实施例2
71.实施例1制得不同等离子共振波长的金纳米棒的紫外
‑
可见光谱图。
72.称取3ml实施例1中制得的纯净的不同等离子共振波长的金纳米棒溶液。
73.紫外
‑
可见光谱测试：测试上述溶液的紫外
‑
可见光谱图。紫外
‑
可见光谱图以纯水作为参比液，扫描400nm
–
1000nm波长范围内的光谱图。所得紫外
‑
可见光谱图见图1，说明成功合成的金纳米棒具有横向等离子共振峰和纵向等离子共振峰。不同的金纳米棒的纵向等离子共振峰在可见光区至近红外光区可调谐，表明金纳米棒均成功合成。
74.实施例3
75.实施例1制得的不同等离子共振波长的金纳米棒修饰的近红外荧光传感器的荧光发射光谱图。
76.取1ml实施例1中制得的纯净的不同等离子共振波长的金纳米棒修饰的近红外荧光传感器与9ml纯水混合均匀，将2.5ml 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐(200nmol)和2.5ml n
‑
羟基琥珀酰亚胺(200nmol)混合加入到5ml的染料cy7溶液(0.029mmol/l)反应得到cy7参比溶液。分别测试10ml传感器与10ml的cy7参比溶液等体积混合后的溶液的荧光发射光谱，以及10ml纯水与10mlcy7参比溶液等体积混合后的荧光发射光谱图。
77.荧光光谱测试：取上述溶液分别测荧光发射光谱图。荧光发射光谱测定以680nm激发，激发与发射的狭缝宽度为10nm/10nm。所得荧光发射光谱图见图2，图2显示近红外荧光传感器的荧光强度均高于原始的荧光染料cy7。不同等离子共振波长的金纳米棒修饰的近红外荧光传感器具有不同的荧光增强效果，其中等离子共振波长为766nm的金纳米棒修饰的近红外荧光传感器具有最好的荧光增强效果(约3.8倍)，665nm的是1.96倍,835nm的是2.05倍。这是由于等离子共振波长为766nm的金纳米棒的等离子共振波长与cy7和紫外
‑
可见吸收波长和荧光发射波长有最大重叠引起的。该实验结果表明，制备的传感器能起到对荧光染料cy7荧光的增强作用。
78.实施例4
79.实施例1中制得等离子共振波长为766nm的的金纳米棒与不同分子量的聚乙二醇(1000、5000、10000)修饰的近红外荧光传感器的荧光发射光谱图。称取0.1mg荧光染料cy7加入40ml纯水完全溶解配成3.66um水溶液，取1ml实施例1中制得的纯净的不同分子量的聚乙二醇的金纳米棒修饰的近红外荧光传感器与9ml纯水混合均匀，分别检测传感器和cy7的荧光发射光谱图，比较增强效果，同时采用实施例1的方法不加聚乙二醇作为对照。通过三种不同分子量的peg，控制金纳米棒与染料cy7之间的距离。
80.荧光光谱测试：取上述溶液分别测荧光发射光谱图。荧光发射光谱测定以680nm激发，激发与发射的狭缝宽度为10nm/10nm。所得荧光发射光谱图见图3，图3显示近红外荧光
传感器的荧光强度均高于原始的荧光染料cy7。不同分子量的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器具有不同的荧光增强效果，其中聚乙二醇分子量为5000的近红外荧光传感器具有最好的荧光增强效果(约3.8倍)，分子量10000的是2.58倍，分子量1000的是2.36倍，而不加聚乙二醇的是猝灭57％。该实验结果表明，金纳米棒与染料cy7之间的距离会影响荧光增强效果，当聚乙二醇的分子量为5000时金纳米棒与cy7处于最适距离此时荧光增强效果最好。综上所述，当金纳米棒的等离子共振波长为766nm聚乙二醇的分子量为5000时制备得到的近红外荧光传感器具有最好的荧光增强效果，故后续的研究选用该近红外荧光传感器。
81.实施例5
82.实施例1中制得等离子共振波长为766nm的金纳米棒和分子量为5000的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器与不同浓度的脂多糖响应的荧光发射光谱图。
83.称取0.1mg脂多糖加10ml纯水配成浓度为10ug/ml的母液，用该母液配置浓度分别为5，50，500，1000，2000，4000，6000，8000，10000，12500，15000，25000ng/ml的脂多糖水溶液，取实施例1中制备的等离子共振波长为766nm的金纳米棒和分子量为5000的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器与不同浓度的脂多糖按照体积比为1：1，在室温下孵化5分钟测试荧光发射光谱图。荧光发射光谱测定以680nm激发，激发与发射的狭缝宽度为10nm/10nm。所得荧光发射光谱图见图4，图4显示随着脂多糖浓度的升高近红外荧光传感器的荧光强度逐渐升高，在脂多糖浓度在50
‑
6000ng/ml时与近红外荧光传感器的荧光强度呈线性相关，拟合曲线见图5，拟合曲线为y＝3.373
×
10
‑4x+0.1181(r2＝0.9798),检出限为3.85ng/ml。表明本发明制备的近红外荧光传感器具有荧光“开启式”检测脂多糖的能力。
84.实施例6
85.配置cy7浓度为1.46nmol/l，实施例1中制备的等离子共振波长为766nm的金纳米棒和分子量为5000的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器溶液离心后重新分散制成浓度为4.4mg/ml的溶液。考察两者在室温下的荧光强度，结果如图6所示，表明随着时间变化，cy7荧光强度逐渐猝灭到零(图中线条1)，而近红外荧光传感器的荧光强度基本不变(图中线条2)。说明该荧光传感器具有很好的荧光稳定性。
86.实施例7
87.在实施例1中不加入kc13识别肽，其他步骤完全一样，从而制备得到不修饰kc
‑
13的荧光传感器。
88.进一步称取0.1mg脂多糖加10ml纯水配成浓度为10ug/ml的母液，用该母液配置浓度分别为500，1000，2000，4000，6000，8000，10000，12500ng/ml的脂多糖水溶液，取不修饰kc
‑
13，等离子共振波长为766nm的金纳米棒和分子量为5000的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器与不同浓度的脂多糖按照体积比为1：1在室温下孵化5分钟测试荧光发射光谱图。荧光发射光谱测定以680nm激发，激发与发射的狭缝宽度为10nm/10nm。所得荧光发射光谱图见图7，图7显示随着脂多糖浓度的升高近红外荧光传感器的荧光强度增强非常小，与实施例5相比，荧光强度的增加大大减少，表明多肽的修饰能够提高近红外荧光传感器的特异性结合。
89.实施例8
90.分别配置脂多糖浓度为1μg/ml，干扰物质(interfarence)na
+
浓度为0.9mg/ml,其他干扰物质ca
2+
,h2po4‑
，hpo
42
‑
，牛血清白蛋白(bsa)，葡萄糖(gluocose)，维生素c(vc)，谷胱
甘肽(gsh)，乙二胺四乙酸(edta)，柠檬酸(citrate)都为50μg/ml。另外配置脂多糖与干扰物质的两两混合溶液，混合溶液中脂多糖浓度为1μg/ml，干扰物质(interfarence)na
+
浓度为0.9mg/ml,其他干扰物质ca
2+
,h2po4‑
，hpo
42
‑
，牛血清白蛋白(bsa)，葡萄糖(gluocose)，维生素c(vc)，谷胱甘肽(gsh)，乙二胺四乙酸(edta)，柠檬酸(citrate)都为50μg/ml。取实施例1中制备的等离子共振波长为766nm的金纳米棒和分子量为5000的聚乙二醇修饰的近红外荧光传感器与脂多糖，干扰物质以及两者两两混合溶液分别按照体积比为1：1在室温下孵化5分钟测试荧光发射光谱图。荧光发射光谱测定以680nm激发，激发与发射的狭缝宽度为10nm/10nm。所得荧光响应情况见图8，图8该荧光传感器脂多糖有较强的荧光增强作用，另外在50倍干扰物存在的情况下，该荧光传感器依然可以不受干扰物的干扰实现较好的荧光响应。表明本发明制备的近红外荧光传感器具有良好的特异性。
91.实施例9
92.将培养到对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液按照体积比千分之一的接种量分别接种在普通液体lb培养基上，在30℃的恒温培养箱中培养12小时。将上述菌液在12000rpm下离心1分钟用无菌水洗涤重复两次得到纯净的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。在od值相等(od
600nm
＝0.6)的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌泥中加入1ml实施例1中制备得到的等离子共振波长为766nm聚乙二醇分子量为5000的近红外荧光传感器在室温下孵化30分钟，通过小动物活体成像仪成像。小动物活体成像仪的激发波长为cy5.5，结果如图9所示，结果表明大肠杆菌的存在会使近红外荧光传感器荧光增强，金黄色葡萄球菌的存在会使近红外荧光传感器荧光猝灭。证明本发明制备的近红外荧光传感器能特异性捕获革兰氏阴性菌细胞壁中的脂多糖从而实现对革兰氏阴性菌的活菌成像。
93.实施例10
94.将培养到对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌按照体积比千分之一的接种量分别接种在普通液体lb培养基上，在30℃的恒温培养箱中培养12小时。将上述菌液在12000rpm下离心1分钟用无菌水洗涤重复两次得到纯净的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。分别取1mg766大肠杆菌和1mg金黄色葡萄球菌的菌泥用5％甲醛
‑
戊二醛固定液在4℃下固定2小时随后用30％，50％，70％，90％，100％的乙醇分别进行梯度洗脱，每个浓度的乙醇洗脱2次，离心去除多余的乙醇，将离心沉淀置于冻干机中冻干得到固体粉末状的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，进行sem成像。
95.取上述得到的纯净的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌泥各0.1mg分别加入1ml实施例1中制备得到的等离子共振波长为766nm聚乙二醇分子量为5000的近红外荧光传感器在室温下孵化30分钟，将反应液置于冻干机中冻干得到固体粉末状样品，进行sem成像，结果如图10所示，近红外荧光传感器会与大肠杆菌结合但不会与金黄色葡萄球菌结合表明本发明制备的近红外荧光传感器能通过捕获脂多糖与革兰氏阴性菌特异性结合，实现革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的区分。同时大肠杆菌和金黄色葡萄球菌依然保持原来的形貌，未有塌陷，也表明该近红外荧光传感器具有很好的生物相容性。
96.实施例11
97.实施例11与实施例1制备方法相同，不同之处在于：步骤(1)中十六烷基三甲基溴化铵、氯金酸、硼氢化钠的摩尔比例为1000：2：5。
98.步骤(2)中在28℃下静置20分钟。随后加入氯金酸溶液轻搅20分钟，在剧烈搅拌下
加入抗坏血酸溶液；步骤(2)中十六烷基三甲基溴化铵、5
‑
溴水杨酸或者水杨酸钠、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸的摩尔比为1976：500：1：5。
99.步骤(3)中种子液在剧烈搅拌下快速加入步骤(2)中得到的生长液持续搅拌40秒，在28℃下静置生成10小时得到金纳米棒溶液。
100.步骤(4)得到的金纳米棒溶液混合搅拌1.5h,离心重悬得到纯净的聚乙二醇和多肽kc13修饰的金纳米棒溶液。
101.步骤(5)中将染料cy7、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐(edc)、n
‑
羟基琥珀酰亚胺混合(nhs)，加入纯水超声溶解，在室温下搅拌反应40分钟得到活化的羧基反应性cy7
‑
nhs酯溶液，将其加入聚乙二醇和多肽kc13修饰的金纳米棒溶液在室温下反应3小时得到等离子增强的近红外荧光传感器。
102.实施例12
103.实施例12与实施例1制备方法相同，不同之处在于：步骤(1)中十六烷基三甲基溴化铵、氯金酸、硼氢化钠的摩尔比例为1000：3：8。
104.步骤(2)中十六烷基三甲基溴化铵、5
‑
溴水杨酸或者水杨酸钠、硝酸银、氯金酸、抗坏血酸的摩尔比为1976：500：2：6。