技术特征：
1.一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）制备固相萃取小柱。在固相萃取空柱中装入2ml能高效吸附和分离河豚毒素的吸附剂，在吸附剂上下各加一片滤板（300目）。（2）若待测样品为固体或生物组织器官，将待测样品捣碎、匀浆，加入少量的助滤剂（如硅藻土等）和提取溶剂，混和均匀后，转入上述（1）中制备好的固相萃取小柱上，用提取溶剂将匀浆器中残留的样品全部洗下，转入固相萃取小柱上。在样品顶部加一片滤板300目）。若待测样品为液体（如淡水或海水溶液），将待测样品溶液ph调至碱性（如ph 8.0
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9.0），直接缓慢加到固相萃取小柱上。（3）上述（2）中加入样品后的固相萃取小柱，用洗脱溶剂i洗脱其中的杂质，至可洗脱的杂质完全洗脱干净，弃洗脱液。（4）上述（3）中洗脱完杂质后的固相萃取小柱，用洗脱溶剂ⅱ洗脱残留杂质并中和小柱，弃洗脱液。（5）上述（4）中的中和后的固相萃取小柱，用洗脱溶剂ⅲ洗脱河豚毒素，直至河豚毒素完全洗脱干净。收集洗脱溶剂iii所得的洗脱液，即得到纯化的河豚毒素洗脱液。可用各种不同方法检测其中的河豚毒素含量。（6）上述（5）中所得的河豚毒素洗脱液，用0.22
µ
m滤膜过滤后，用高效液相色谱测定其中的河豚毒素含量。（7）基于以上方法制备河豚毒素分析检测样品的快速制备试剂盒，包括上述（1）中的制备好的固相萃取小柱、河豚毒素提取溶剂、洗脱溶剂i、洗脱溶剂ii和洗脱溶剂iii。用此“河豚毒素分析样品快速制备试剂盒”可简单快速制备各种来源的河豚毒素分析样品，用于准确测定河豚毒素含量。2.根据权利要求1所述的一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒，其特征在于，所述步骤（1）中固相萃取空柱规格为大小尺寸φ12.9
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67.6mm、体积6ml的小柱。3.根据权利要求1所述的一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒，其特征在于，所述步骤（1）中所属的吸附剂为阳离子交换树脂等可选择性吸附和分离河豚毒素的合成树脂 (如d152离子交换树脂）。树脂使用前需经过活化处理，活化处理的步骤为：1）用80%乙醇浸泡12h，将乙醇除去后用纯水洗至无醇味。2）用与树脂体积比1:1的2% hcl水溶液洗涤树脂4次，用纯水洗到中性。3）用与树脂体积比1:1的含4% naoh的水溶液洗涤树脂4次，用纯水洗到中性。4）用含0.5%氨水的水溶液洗涤树脂，再用纯水洗至偏碱性（ph 8-10），备用。4.根据权利要求1所述的一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒，其特征在于，所述步骤（2）中所用的河豚毒素提取溶剂和步骤（3）中所用的洗脱溶剂i均为低级脂肪醇（如甲醇、乙醇等）的水溶液，其中醇的含量不低于75%，并用氨水调ph至9.0。5.根据权利要求1所述的一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒，其特征在于，所述步骤（2）中所述的助滤剂为不溶于提取溶剂、有助滤或助溶剂流动功能的无机或有机物质（如硅藻土、纤维素等）。其作用是促进提取溶剂在粘稠组
织物中的流动，添加量因提取材料而异，一般为提取材料重量的0.5-2.0倍。6.根据权利要求1所述的一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒，其特征在于，所述步骤（4）和（5）中所用的洗脱溶剂ii和iii为低级脂肪醇（如甲醇、乙醇等）的酸水溶液。其中低级脂肪醇（如甲醇、乙醇等）的含量不低于75%，酸可为有机酸（醋酸、马来酸等）或无机酸（如磷酸、盐酸等），含量为1%-10%（一般为4%）。7.根据权利要求1所述的一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒，其特征在于，所述步骤（2）、（3）、（4）和（5）中，固相小柱的洗脱液流速控制在每小时3倍柱体积或以下。8.根据权利要求1所述的一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒，其特征在于，所述步骤（6）中所用的河豚毒素检测方法可用不同厂家的高效液相色谱仪或高效液相色谱-质谱联用仪器等不同的检测方法。用高效液相色谱检测时，分离柱可用岛津shim-pack gist c18-aq 5
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m 4.6
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250mm色谱柱或其他类似的色谱柱，流动相需用离子对试剂，如5mmol/l庚烷磺酸钠+25mmol/l磷酸盐的水溶液；可在195-200nm紫外波长下的检测。
技术总结
本发明涉及一种简便高效的同时提取和纯化制备河豚毒素检测样品的方法及其试剂盒。其过程包括1）制备一个固相萃取小柱；2）将待分析样品匀浆，用提取溶剂将匀浆后的样品完全转移到固相萃取小柱上；3）洗脱，用洗脱溶剂I将样品中的杂质洗脱干净，用洗脱溶剂II中和固相小柱，再用洗脱溶剂III将河豚毒素完全洗脱出来。洗脱液III含有全部的高纯度的河豚毒素。5）用高效液相色谱法或其他检测方法测定洗脱液III中河豚毒素。该方法简便、高效，能将各种样品中的河豚毒素完全提取出来，并同时进行纯化，实现河豚毒素的快速和准确的定量检测。现河豚毒素的快速和准确的定量检测。现河豚毒素的快速和准确的定量检测。
技术研发人员：张文龙 曾俊美 张琳琳 王美婧 储智勇 李海航 钱晓明 叶建华
受保护的技术使用者：中洋生物科技（上海）股份有限公司
技术研发日：2021.09.19
技术公布日：2023/3/24