一种检测5-对硝基苯基糠醛有关物质的方法与流程

一种检测5
‑
对硝基苯基糠醛有关物质的方法
技术领域
1.本发明属于分析化学领域。具体地，本发明涉及一种检测5
‑
对硝基苯基糠醛有关物质的方法。


背景技术：

[0002]5‑
对硝基苯基糠醛，分子量为217.17，分子式为c
11
h7no4，其结构式如下：
[0003][0004]5‑
对硝基苯基糠醛作为合成丹曲林钠的起始物料，其在生产过程中可能会产生工艺杂质，例如对硝基苯酚、对硝基苯胺、对硝基氯苯以及糠醛。现有技术中多采用液相色谱法检测5
‑
对硝基苯基糠醛纯度。但现有方法往往存在对硝基苯酚、对硝基苯胺、对硝基氯苯及糠醛等杂质的峰保留时间与主成分5
‑
对硝基苯基糠醛的峰保留时间差异不大，即分离度不好的问题，导致无法准确测定5
‑
对硝基苯基糠醛中对硝基苯酚、对硝基苯胺、对硝基氯苯以及糠醛等杂质的含量，继而对后续药物合成造成不利影响。
[0005]
鉴于此，有必要开发更可靠、更准确地检测5
‑
对硝基苯基糠醛中有关物质的方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种检测5
‑
对硝基苯基糠醛有关物质的方法，该方法检测灵敏度高、重复性好、准确度高，有关物质与主成分的分离度好，所使用的有机相减少，既有效节约了检测成本，也显著减少了检测废液。
[0007]
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0008]
一种检测5
‑
对硝基苯基糠醛有关物质的方法，其包括：
[0009]
(a)将供试品和对照品溶解于稀释剂，获得供试品溶液和对照品溶液；
[0010]
(b)分别对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行高效液相色谱检测；
[0011]
其中，所述高效液相色谱检测的条件包括：
[0012]
在365nm和275nm的检测波长下，以苯基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，以乙酸铵水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，采用梯度洗脱的方式洗脱。
[0013]
优选地，在步骤(a)中，所述稀释剂为dmf、乙酸、丙酮、以及60wt.％的乙腈水溶液的混合物。
[0014]
优选地，所述乙酸铵水溶液的浓度为3.5g/l～4.0g/l，更优选地为3.85g/l。
[0015]
在本发明中，所述乙酸铵水溶液的浓度可以选择3.5g/l、3.6g/l、3.7g/l、3.8g/l、3.85g/l、3.9g/l、3.95g/l、4.0g/l、以及以上点值中任意两个组成的范围内的任意点值。
[0016]
优选地，所述乙酸铵水溶液的ph为8.4～8.6，更优选地为8.5。
[0017]
优选地，所述高效液相色谱色谱柱的柱温为20℃～30℃，更优选地为25℃。
[0018]
在本发明中，所述高效液相色谱色谱柱的柱温可以选择例如20℃、21℃、22℃、23
℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、或30℃。
[0019]
优选地，所述流动相的流速为0.9ml/min～1.1ml/min，优选地为1.0ml/min。
[0020]
优选地，以所述流动相a和所述流动相b的体积分数计，所述梯度洗脱的程序包括：
[0021]
0min～6min，以50％～60％流动相a
‑
50％～40％流动相b洗脱；
[0022]
6min～7min，以25％～35％流动相a
‑
75％～65％流动相b洗脱；
[0023]
7min～13min，以1％～3％流动相a
‑
99％～97％流动相b洗脱；
[0024]
13min～15min，以50％～60％流动相a
‑
50％～40％流动相b洗脱。
[0025]
更优选地，以所述流动相a和所述流动相b的体积分数计，所述梯度洗脱的程序包括：
[0026]
0min～6min，以55％流动相a
‑
45％流动相b洗脱；
[0027]
6min～7min，以30％流动相a
‑
70％流动相b洗脱；
[0028]
7min～13min，以2％流动相a
‑
98％流动相b洗脱；
[0029]
13min～15min，以55％流动相a
‑
45％流动相b洗脱。
[0030]
优选地，所述有关物质选自对硝基苯酚、对硝基苯胺、对硝基氯苯、以及糠醛中的一种或多种。
[0031]
优选地，在步骤(a)中，所述对照品溶液为5
‑
对硝基苯基糠醛对照品以及所述有关物质的对照品的混合对照品溶液。
[0032]
优选地，在365nm的检测波长下检测5
‑
对硝基苯基糠醛、对硝基苯酚、以及对硝基苯胺，在275nm的检测波长下检测对硝基氯苯和糠醛。
[0033]
优选地，所述供试品溶液的浓度为0.2mg/ml～0.6mg/ml，优选地为0.25mg/ml。
[0034]
优选地，所述对照品溶液中各物质的浓度为40ng/ml～120ng/ml，优选地为50ng/ml。
[0035]
优选地，所述高效液相色谱色谱柱为ace phenyl 4.6mm
×
250mm
×
5.0μm色谱柱。
[0036]
优选地，采用外标法计算所述有关物质的含量。
[0037]
作为一种优选的实施方案，本发明提供了一种检测5
‑
对硝基苯基糠醛有关物质的方法，其包括：
[0038]
(a)将供试品和对照品溶解于稀释剂，获得供试品溶液和对照品溶液；(b)分别对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行高效液相色谱检测；
[0039]
其中，所述高效液相色谱检测的条件包括：
[0040]
在365nm和275nm的检测波长下，以苯基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，在20℃～30℃的柱温下，以乙酸铵水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，采用以下梯度洗脱的方式洗脱：
[0041]
0min～6min，以50％～60％流动相a
‑
50％～40％流动相b洗脱；
[0042]
6min～7min，以25％～35％流动相a
‑
75％～65％流动相b洗脱；
[0043]
7min～13min，以1％～3％流动相a
‑
99％～97％流动相b洗脱；
[0044]
13min～15min，以50％～60％流动相a
‑
50％～40％流动相b洗脱；
[0045]
其中，在365nm的检测波长下检测5
‑
对硝基苯基糠醛、对硝基苯酚、以及对硝基苯胺，在275nm的检测波长下检测对硝基氯苯和糠醛；采用外标法计算所述有关物质的含量。
[0046]
作为一种优选的实施方案，本发明提供了一种检测5
‑
对硝基苯基糠醛有关物质的
方法，其包括：
[0047]
(a)将供试品和对照品溶解于稀释剂，获得供试品溶液和对照品溶液；(b)分别对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行高效液相色谱检测；
[0048]
其中，所述高效液相色谱检测的条件包括：在365nm和275nm的检测波长下，以苯基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，在20℃～30℃的柱温下，以乙酸铵水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，采用以下梯度洗脱的方式洗脱：
[0049]
0min～6min，以55％流动相a
‑
45％流动相b洗脱；
[0050]
6min～7min，以30％流动相a
‑
70％流动相b洗脱；
[0051]
7min～13min，以2％流动相a
‑
98％流动相b洗脱；
[0052]
13min～15min，以55％流动相a
‑
45％流动相b洗脱；
[0053]
其中，在365nm的检测波长下检测5
‑
对硝基苯基糠醛、对硝基苯酚、以及对硝基苯胺，在275nm的检测波长下检测对硝基氯苯和糠醛；采用杂质外标法计算所述有关物质的含量。
[0054]
本发明至少具有如下有益效果：
[0055]
本发明提供了检测5
‑
对硝基苯基糠醛有关物质的方法，其检测灵敏度高、重复性好、准确度高，有关物质与主成分的分离度好，有关物质中各不同杂质之间也能够有效分离，所使用的有机相减少，既有效节约了检测成本，也显著减少了检测废液。
附图说明
[0056]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0057]
图1为实施例2中流动相a的ph在6.8时所获得的hplc谱图；
[0058]
图2为实施例2中流动相a的ph在5.5时所获得的hplc谱图；
[0059]
图3为实施例2中流动相a的ph在8.5时所获得的hplc谱图；
[0060]
图4为实施例2中流动相a的ph在9.0时所获得的hplc谱图；
[0061]
图5为实施例2中在不同检测波长下所获得的hplc谱图；
[0062]
图6为对比例1中所获得的hplc谱图。
具体实施方式
[0063]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0064]
实施例1溶液的制备
[0065]
供试品溶液的配制：
[0066]
精密称取供试品50mg，置20ml量瓶中，加入1ml的dmf和1ml的乙酸，然后加入丙酮至刻度下1cm处，超声使其充分溶解，用丙酮稀释至刻度，摇匀，作为储备液；精密量取上述储备液2ml，置20ml量瓶中，用60wt.％的乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0067]
对照品溶液的配制：
[0068]
精密称取5
‑
对硝基苯基糠醛对照品、对硝基苯酚对照品、对硝基苯胺对照品、对硝基氯苯对照品、糠醛对照品各10mg，置20ml量瓶中，加入1ml的dmf和1ml的乙酸，然后加入丙酮至刻度下1cm处，超声使其充分溶解，用丙酮稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密
量取上述储备液1ml，置100ml量瓶中，用60wt.％的乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品中间储备液；精密量取上述对照品中间储备液1ml，置100ml量瓶中，用60wt.％的乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0069]
实施例2高效液相色谱进样
[0070]
高效液相色谱检测条件：在365nm和275nm的双检测波长下，以苯基硅烷键合硅胶为色谱柱ace phenyl 250
×
4.6mm
×
5μm的填充剂，以乙酸铵溶液(取3.85g乙酸铵溶解于1l水中，用氨水调节ph)为流动相a，以乙腈为流动相b，按表1中的洗脱程序进行梯度洗脱，其他进样条件和变量总结于以下各表中。精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。用杂质外标法计算杂质含量。
[0071]
表1 梯度洗脱程序
[0072]
t(min)流动相a(％，v/v)流动相b(％，v/v)0～655456～730707～1329813～155545
[0073]
流动相a的ph选择
[0074]
考察了表2和表3中所选择的流动相a的ph变化对检测结果的影响。
[0075]
表2 高效液相色谱进样条件、流动相a的ph微调
[0076][0077]
表3 高效液相色谱进样条件、流动相a的ph变量
[0078][0079]
由图1至图4以及表2与表3中结果可以发现，当流动相a的ph在8.5时，糠醛与对硝基苯酚的分离度为2.95，对硝基苯酚与对硝基苯胺的分离度为2.40，5
‑
对硝基苯基糠醛与对硝基氯苯的分离度为1.65，大于分离度最低要求1.5。可见，各杂质峰均能够有效与主成
分峰分离，效果良好，如图3中所示。
[0080]
当流动相a的ph在8.5
±
0.1微调时，供试品溶液中糠醛、对硝基苯酚、对硝基苯胺、以及对硝基氯苯的含量与ph在8.5时的rsd值分别为0.65％、9.98％、4.15％、以及2.04％，表明在该微调的ph范围下，有关物质的分离检测效果均可行，且较稳定。
[0081]
但当流动相a的ph显著偏离8.5
±
0.1的范围时，出现了以下劣化结果：
[0082]
当流动相a的ph在6.8时，发现对硝基苯酚与对硝基苯胺的分离度为0.71，5
‑
对硝基苯基糠醛与对硝基氯苯的分离度为1.30，均小于分离度最低要求1.5，分离效果不佳，如图1中所示；
[0083]
当流动相a的ph在5.5时，发现对硝基苯酚的峰与对硝基苯胺的峰几乎重叠在一起，5
‑
对硝基苯基糠醛与对硝基氯苯的分离度为1.27，与ph在6.8时无明显区别，分离效果很不理想，如图2中所示；
[0084]
当流动相a的ph在9.0时，发现对硝基苯酚与对硝基苯胺的分离度提高为4.95，5
‑
对硝基苯基糠醛与对硝基氯苯的分离度提高为2.59，大于分离度最低要求1.5，符合要求；但糠醛与对硝基苯酚几乎重叠在一起，无法实现有关物质的全面有效分离，如图4中所示。
[0085]
柱温的考察
[0086]
流动相a的ph选择8.5，流动相流速选择1.0ml/min，其他条件不变，柱温的变化情况如表4中所列，考察了柱温变化对检测结果的影响。
[0087]
表4 柱温变化及结果
[0088][0089]
由表4中结果可知，当柱温在25℃
±
5℃范围内变化时，供试品溶液中糠醛、对硝基苯酚、对硝基苯胺、对硝基氯苯的含量与柱温在25℃时的rsd值分别为0.52％、3.61％、4.89％、以及1.00％，rsd值均在10.0％范围内，表明在该柱温范围下，有关物质的分离检测效果均可行，且较稳定。
[0090]
流速的考察
[0091]
流动相a的ph选择8.5，柱温选择25℃，其他条件不变，流动相流速的变化情况如表5中所列，考察了流动相流速变化对检测结果的影响。
[0092]
表5 流动相流速变化及结果
[0093][0094]
由表5中结果可知，当流动相流速在1.0ml/min
±
0.1ml/min范围内变化时，供试品溶液中糠醛、对硝基苯酚、对硝基苯胺、对硝基氯苯的含量与流动相流速在1.0ml/min时的rsd值分别为2.61％、3.91％、2.55％、以及2.63％，rsd值均在10.0％范围内，表明在该流速范围下，有关物质的分离检测效果均可行，且较稳定。
[0095]
色谱柱的筛选
[0096]
流动相a的ph选择8.5，柱温选择25℃，流动相流速选择1.0ml/min，其他条件不变，色谱柱的变化情况如表6中所列，考察了色谱柱变化对检测结果的影响。
[0097]
表6 色谱柱变化及结果
[0098][0099]
检测波长的选择
[0100]
流动相a的ph选择8.5，柱温选择25℃，流动相流速选择1.0ml/min，色谱柱选择ace phenyl 4.6mm
×
250mm
×
5.0μm色谱柱，其他条件不变，检测波长的变化情况如表7中所列，考察了检测波长变化对检测结果的影响。
[0101]
表7 检测波长变化及结果
[0102][0103]
不同检测波长下所获得的hplc谱图如图5所示。由图5和表7中结果可知：
[0104]
在275nm的检测波长下，糠醛、对硝基氯苯峰面积较大；在318nm及365nm的检测波长下，糠醛、对硝基氯苯峰面积则很小。
[0105]
在318nm的检测波长下，对硝基苯酚峰面积较大，在其他三个检测波长下差异不
大。
[0106]
在365nm的检测波长下，对硝基苯胺峰面积较大，在其他三个检测波长差异不大且都偏小。
[0107]
在365nm的检测波长下，5
‑
对硝基苯基糠醛峰面积较大，在其他三个检测波长下则波长越小峰面积越小。
[0108]
综合以上情况，最终确定检测在365nm的检测波长下检测对硝基苯酚、对硝基苯胺和5
‑
对硝基苯基糠醛，在275nm的检测波长下检测糠醛和对硝基氯苯，在该双波长检测下，各目标物质具有尽可能大的峰面积，使得检测灵敏度提高。
[0109]
对比例1
[0110]
溶液的制备：
[0111]
对照品溶液：精密称取对照品30mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
[0112]
供试品溶液：精密称取本品30mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
[0113]
高效液相色谱检测条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂(c18，250mm
×
3.9μm，或效能相当的色谱柱)，以甲醇为流动相，等度洗脱；流速为1.0ml/min，检测波长为254nm。精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。用面积归一化法计算杂质含量。
[0114]
检测结果如图6所示，发现对硝基苯酚、对硝基苯胺、对硝基氯苯及糠醛的峰保留时间均与主成分5
‑
对硝基苯基糠醛峰保留时间差异不大，无法有效分离。辨明本对比例的方法不能准确分离检测5
‑
对硝基苯基糠醛中的有关物质例如对硝基苯酚、对硝基苯胺、对硝基氯苯及糠醛等。
[0115]
以上所述，仅是本发明的几个示例性实施例，并非对本发明做任何形式的限制。虽然本发明以较佳的实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案范围内。