用于制备循环肿瘤细胞质控品的试剂盒及循环肿瘤细胞质控品的制备方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于制备循环肿瘤细胞质控品的试剂盒以及利用该试剂盒制备循环肿瘤细胞质控品的制备方法。


背景技术：

2.质控品是检测体系中非常重要的组成部分。在循环肿瘤细胞细胞检测领域，目前已建立了很多不同的检测方法或检测系统，但用于评价这些检测方法或检测系统的循环肿瘤细胞质控品或者标准物质目前仍然比较欠缺。此外，如何实现保护细胞系质控品的细胞膜结构和膜蛋白、维持细胞形态和减少胞内物质损失是目前制备细胞系质控品的难点之一。
3.中国专利cn109122669b公开了一种干式肿瘤细胞质控品的制备方法，该方法在制备质控品的过程中需要加入含有大量的胎牛血清、牛血清白蛋白或酪蛋白等成分的细胞冷冻液，使得制备过程中极易产生气泡，而后气泡的破裂会导致细胞膜受损进而影响细胞形态；且该方法包含对细胞进行冷冻干燥的步骤，细胞在冷冻干燥的过程中极容易受溶液渗透压力变化等因素的作用造成细胞形态变化。
4.中国专利申请cn105177124a公开了一种细胞源性质控品的制备方法，该方法在制备质控品的过程中使用10％中性福尔马林对细胞进行固定，会导致细胞膜蛋白受损，且该方法需要对细胞进行脱水和石蜡62℃包埋，严重破坏了细胞的形态。
5.目前，市面上仍缺少一种能够很好地保护细胞系质控品的细胞膜和膜蛋白，维持细胞形态的细胞系质控品的制备方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种用于制备循环肿瘤细胞质控品的试剂盒，以解决上述技术问题中的至少一个。
7.本发明的另一个目的在于提供一种循环肿瘤细胞质控品的制备方法，以解决上述技术问题中的至少一个。
8.本发明的又一个目的在于提供一种循环肿瘤细胞质控品，以解决上述技术问题中的至少一个。
9.根据本发明的一个方面，提供了一种用于制备循环肿瘤细胞质控品的试剂盒，包括：独立存在的二甲基亚砜(dmso)和泊洛沙姆188(f68)。其中，在应用于制备循环肿瘤细胞质控品时，dmso按体积百分比计，应用的终浓度为20％-60％；f68按质量体积百分比计，应用的终浓度为0.1％-1％。
10.本发明发明人在研究制备循环肿瘤细胞质控品的过程中发现，在制备循环肿瘤细胞质控品的过程中，dmso和f68既可以用于对循环肿瘤细胞进行固定，还可以作为细胞保存液的主要有效成分应用于制备保存液对制得的循环肿瘤细胞质控品进行保存。
11.利用高浓度(20％-60％)的dmso对循环肿瘤细胞进行固定，可以有效保护细胞膜的结构和保护膜蛋白，从而可以有效维持循环肿瘤细胞的形态；同时，在质控品的保存过程中，dmso还可以有效防止细胞破裂以及防止低温保存过程中细胞内的水形成晶体，有利于维持循环肿瘤细胞的细胞形态；而f68可以起到消泡剂和细胞膜保护剂的作用，在制备和保存过程中减少气泡的产生，并且f68对细胞还具有明显的冷冻保护作用，从而可以保护细胞膜和维持细胞形态。单独使用dmso制备循环肿瘤细胞质控品时，虽然也能制得能够长期保存的循环肿瘤细胞质控品，但制备过程中细胞的损失率较大，dmso与f68一起使用则可以对细胞起到协同保护的效果，可以有效降低制备过程中细胞的损失率以及可以维持循环肿瘤细胞质控品的细胞形态和维持细胞成分检测水平的稳定，使得循环肿瘤细胞质控品可以长期在-20℃保存。
12.在一些实施方式中，可以利用细胞培养基和/或缓冲液将dmso和f68配制成dmso溶液和f68溶液以应用于制备循环肿瘤细胞质控品和/或质控品保存液。由此，有利于减少外界环境对细胞的影响，特别是在保存过程中，减少外界环境对循环肿瘤细胞质控品的影响，维持细胞的形态。
13.细胞培养基可以为基础培养基、在基础培养基中添加血清、抗生素等添加剂中的至少一种配制而成的不完全培养基或完全培养基、在基础培养基中添加促贴壁物质、生长因子、激素、结合蛋白、转运蛋白、微量元素等添加剂中的至少一种配制而成的无血清培养基；其中，基础培养基可以选自mem、dmem、ham f12、1640、bme、imdm、dmem/f12、m199、mccoy5a、l15中的至少一种。
14.需要说明的是，本发明中，用于配制不完全培养基、完全培养基、无血清培养基的添加剂可为本领域技术人员所熟知的任意一种或多种可用于配制不完全培养基、完全培养基、无血清培养基的添加剂而不仅限于上述列举的几种。
15.缓冲液可以选自pbs缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、生理盐水中的一种。
16.在实际应用过程中，细胞培养基和/或缓冲液可以随dmso和f68一起由试剂盒一并提供，也可以由试剂盒使用者自行准备。
17.根据本发明的另一个方面，提供了一种循环肿瘤细胞质控品的制备方法，包括如下步骤：
18.用细胞培养基或缓冲液将f68配制成f68溶液；
19.用细胞培养基将dmso配制成dmso溶液，置于低温条件下进行预冷，低温条件的温度可以为-20℃～4℃；
20.往循环肿瘤细胞悬液中加入f68溶液，混合后于4℃条件下放置2-4h；然后与在低温条件下预冷后的dmso溶液混合，得含有循环肿瘤细胞的混合液；其中，含有循环肿瘤细胞的混合液中，dmso按体积百分比计，终浓度为20％-60％，f68按质量体积百分比计，终浓度为0.1％-1％；
21.将含有循环肿瘤细胞的混合液于-20℃条件下放置12-18h，即得循环肿瘤细胞质控品。
22.dmso在稀释的过程会放热导致溶液的温度可能会超过37℃，直接用于处理细胞会影响细胞状态，由此，将dmso溶液、循环肿瘤细胞悬液与f68溶液的混合液在低温条件下预冷后再进行混合可以保证细胞形态以及蛋白含量。
23.本发明提供的循环肿瘤细胞质控品的制备方法可以很好地保护细胞的细胞膜结构和膜蛋白、维持细胞形态和保存胞内物质，经dmso和f68处理后的循环肿瘤细胞，细胞的形态结构和物质成分能够得以保持，具有细胞形态饱满、细胞成分检测水平稳定等特性，可作为循环肿瘤细胞质控品用于评价循环肿瘤细胞细胞检测方法或检测系统。此外，通过本发明提供的方法制得循环肿瘤细胞质控品后，可以直接将含有循环肿瘤细胞质控品、终浓度为20％-60％的dmso和终浓度为0.1％-1％的f68的混合液于-20℃条件下长期保存。需要使用循环肿瘤细胞质控品时，将含有循环肿瘤细胞质控品的混合液从-20℃中取出，去除混合液，将循环肿瘤细胞质控品用细胞培养基或pbs缓冲液清洗1-3遍后即可。
24.本发明提供的循环肿瘤细胞质控品的制备方法操作简单，工艺稳定，可应用于批量制备能够长期保存的循环肿瘤细胞质控品。
25.在一些实施方式中，细胞培养基可以选自基础培养基、不完全培养基、完全培养基、无血清培养基中的至少一种，基础培养基可以选自mem、dmem、ham f12、1640、bme、imdm、dmem/f12、m199、mccoy5a、l15中的一种或多种混合。
26.在一些实施方式中，缓冲液可以选自pbs缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、生理盐水中的一种。
27.在一些实施方式中，可以用pbs缓冲液将泊洛沙姆188配制成按质量体积百分比计，浓度为5％-20％的泊洛沙姆188溶液。
28.在一些实施方式中，循环肿瘤细胞质控品的制备方法可以包括如下步骤：
29.(1)用pbs缓冲液将泊洛沙姆188配制成按质量体积百分比计，浓度为10％的泊洛沙姆188溶液；
30.(2)将二甲基亚砜和细胞培养基按体积比2:1配制成二甲基亚砜溶液，置于4℃条件下进行预冷；
31.(3)将循环肿瘤细胞悬液和步骤(1)配制的泊洛沙姆188溶液按体积比9:1混匀后，将混合液于4℃条件下放置3h；然后分次加入到混合液3倍体积的在4℃条件下预冷后的二甲基亚砜溶液中，混匀后于-20℃条件下放置12-18h，即得循环肿瘤细胞质控品。
32.其中，步骤(1)和步骤(2)顺序可以互换或者同时进行。
33.根据本发明的又一个方面，提供了由上述的制备方法制得的循环肿瘤细胞质控品。本发明提供的循环肿瘤细胞质控品，质量稳定，可长期保存。
34.本发明提供的循环肿瘤细胞质控品对保存条件要求低，直接将含有循环肿瘤细胞质控品、终浓度为20％-60％的dmso和终浓度为0.1％-1％的f68的混合液置于低温环境中保存即可，最佳保存温度为-20℃。
35.将本发明提供的循环肿瘤细胞质控品置于含有终浓度为20％-60％的dmso和终浓度为0.1％-1％的f68的保存液中，在-20℃条件下保存时，循环肿瘤细胞质控品的膜蛋白表达水平、细胞的面积和圆率在6个月内均无明显变化。
附图说明
36.图1显示了实施例1制得的sw480细胞质控品于-20℃条件下保存9个月后的细胞形态；
37.图2显示了实施例2制得的cem细胞质控品于-20℃条件下保存9个月后的细胞形
态；
38.图3显示了sw480细胞质控品和cem细胞质控品保存不同时间后细胞的圆率变化情况；
39.图4显示了3个不同批次的采用实施例1的方法制得的sw480细胞质控品和3个不同批次的采用实施例2的方法制得的cem细胞质控品于-20℃条件下保存不同时间后的细胞面积的变化情况；
40.图5显示了荧光显微镜下的于-20℃条件下保存不同时间后的实施例1制得的sw480细胞质控品和实施例2制得的cem细胞质控品细胞表面epcam蛋白的荧光强度变化情况；
41.图6显示了于-20℃条件下保存不同时间后的实施例1制得的sw480细胞质控品和实施例2制得的cem细胞质控品细胞表面epcam蛋白的荧光强度变化情况以及新鲜细胞在培养一段时间内的细胞表面epcam蛋白的荧光强度变化情况；
42.图7显示了采用流式细胞术测定的于-20℃条件下保存不同时间后的实施例1制得的sw480细胞质控品和实施例2制得的cem细胞质控品细胞表面epcam蛋白的荧光强度变化情况；
43.图8-10依次显示了在2-8℃条件下保存不同时间后的实施例1制得的sw480细胞质控品和实施例2制得的cem细胞质控品的面积、圆率和细胞表面epcam蛋白的荧光强度变化情况；
44.图11-13依次显示了在10-15℃条件下保存不同时间后的实施例1制得的sw480细胞质控品和实施例2制得的cem细胞质控品的面积、圆率和细胞表面epcam蛋白的荧光强度变化情况；
45.图14-16依次显示了在20-25℃条件下保存不同时间后的实施例1制得的sw480细胞质控品和实施例2制得的cem细胞质控品的面积、圆率和细胞表面epcam蛋白的荧光强度变化情况。
具体实施方式
46.下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。如无特殊说明，实施例中所用原料和试剂为可以通过市售获得的常规产品；实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件。
47.本发明中，如无特殊说明，dmso的浓度指的是体积分数，f68的浓度指的是质量体积(g/ml)百分比。
48.实施例1sw480细胞质控品的制备
49.包括如下步骤：
50.(1)将胎牛血清、青霉素和链霉素加入到dmem培养基中配制成完全培养基，其中，在完全培养基中，胎牛血清的体积百分比为10％，青霉素和链霉素的终浓度均为100u/ml；
51.(2)取1ml完全培养基和2ml dmso加入到50ml离心管中混匀，得3ml dmso溶液，将dmso溶液置于冰箱4℃预冷；
52.(3)取0.1g f68溶解于pbs中，溶液定容至1ml，得10％的f68溶液；
53.(4)将培养的sw480细胞(人结肠癌细胞)用消化液消化后加完全培养基重悬，细胞计数后，调整细胞密度为(1-1.5)
×
105个/ml，然后每900μl细胞悬液加入100μl 10％f68溶液，混匀后将细胞和f68的混合液于4℃条件下放置3h；
54.(5)将1ml于4℃条件下放置了3h的细胞和f68的混合液分5次加入到4℃预冷后的3ml dmso溶液中，边加边混匀，混匀后即得含sw480细胞、终浓度约为50％的dmso和终浓度约为0.25％的f68的混合液；将混合液于-20℃条件下放置12-18h，即得sw480细胞质控品；
55.(6)将sw480细胞质控品分装后于-20℃条件下保存。
56.图1为sw480细胞质控品保存9个月后的细胞形态，由图1可知，本发明提供的sw480细胞质控品的细胞膜结构完整，形态饱满，在保存9个月后，细胞膜的结构和形态无明显变化。
57.实施例2cem细胞质控品的制备
58.包括如下步骤：
59.(1)将胎牛血清、青霉素和链霉素加入到1640培养基中配制成完全培养基，其中，在完全培养基中，胎牛血清的体积百分比为10％，青霉素和链霉素的终浓度均为100u/ml；
60.(2)取1ml完全培养基和2ml dmso加入到50ml离心管中混匀，得3ml dmso溶液，将dmso溶液置于冰箱4℃预冷；
61.(3)取0.1g f68溶解于pbs中，溶液定容至1ml，得10％的f68溶液；
62.(4)将培养的cem细胞(人白血病细胞)离心去上清后加完全培养基重悬，细胞计数后，调整细胞密度为(1-1.5)
×
105个/ml，然后每900μl细胞悬液加入100μl 10％f68溶液，混匀后将细胞和f68的混合液于4℃条件下放置3h；
63.(5)将1ml于4℃条件下放置了3h的细胞和f68的混合液分5次加入到4℃预冷后的3ml dmso溶液中，边加边混匀，混匀后即得含sw480细胞、终浓度约为50％的dmso和终浓度约为0.25％的f68的混合液；将混合液于-20℃条件下放置12-18h，即得cem细胞质控品；
64.(6)将cem细胞质控品分装后于-20℃条件下保存。
65.制得的cem细胞质控品保存9个月后的细胞膜及形态如图2所示。由图2可知，本发明提供的cem细胞质控品，细胞膜结构完整，形态饱满，且在保存9个月后，细胞膜的结构和形态无明显变化。
66.图3显示了实施例1制得的sw480细胞质控品和实施例2制得的cem细胞质控品保存不同时间后的圆率变化情况，其中，图中“dn”表示固定后的第n天，“nm”表示固定后的第n个月，本发明其他附图中的类似标记含义与图3相同。由图3结果可知，本发明提供的sw480细胞质控品和cem细胞质控品的圆率在保存6个月内无明显变化。
67.图4显示了3个不同批次(批次0430、批次0518和批次0525)的sw480细胞质控品和cem细胞质控品的细胞尺寸(面积)保存不同时间后细胞尺寸(面积)的变化情况，由图4的结果可知，不同批次的循环肿瘤细胞质控品的细胞尺寸在一个月内均没有明显的变化，说明本发明提供的制备方法制得的循环肿瘤细胞质控品可批量生产、质量稳定且可以长期保存。
68.实验例1
69.(1)实验对象：实施例1-2制得的循环肿瘤细胞质控品，于-20℃条件下保存；未进行固定的新鲜细胞，新鲜细胞在常规条件下培养。选取保存时间为1-6天、11天、15天、20天、
25天和30天的循环肿瘤细胞质控品细胞以及常规培养的细胞进行实验。
70.(2)实验方法：取150μl含有质控品的混合液，在1500rpm，3min，4℃的条件下离心，去上清后用100μl4℃预冷后的含0.25％f68的pbs清洗两次，然后将细胞重悬于45μl pbs，加入anti-epcam-fitc，室温孵育30min；1500rpm离心3min，去上清后用100μlpbs清洗两次，然后用50μlpbs重悬，利用荧光显微镜进行拍照，使用20
×
物镜，11.4增益曝光时间600ms，迅速拍照。
71.(3)实验结果：如图5-6所示。图中，d0表示进行固定前的新鲜细胞的实验结果，dn表示固定后第n天的细胞的实验结果。图6中，“新鲜细胞表面蛋白荧光强度”中的横坐标表示的是取出常规培养的未固定的细胞进行实验的日期，如“200511”表示的是2020年5月11日。
72.epcam(epithelial cell adhesion molecule，上皮细胞粘附分子)蛋白在sw480中表达，在cem中不表达。由图5-6的结果可知，随着保存时间的增加，本发明提供的质控品细胞表面epcam蛋白的荧光强度稳定。
73.试验例2
74.(1)实验对象：实施例1-2制得的循环肿瘤细胞质控品，于-20℃条件下保存；未进行固定的细胞。选取保存时间为1天、5天10天、15天、20天、25天、30天和60天的细胞以及常规培养的未固定的细胞进行实验。
75.(2)实验方法：质控品细胞洗涤后采用流式细胞术检测epcam蛋白的荧光强度。
76.(3)结果：如图7所示。
77.由图7的结果可知，随着保存时间的增加，本发明提供的质控品细胞表面epcam蛋白的荧光强度整体没有变化。
78.试验例3
79.(1)实验对象：实施例1制得的sw480细胞质控品和实施例2制得的cem细胞质控品。
80.(2)实验方法：将质控品分别置于2-8℃、10-15℃、20-25℃条件下保存一定的时间，然后检测不同的保存时间内细胞尺寸(面积)和细胞形态(圆率)的变化情况，并采用流式细胞术检测细胞表面epcam蛋白的表达情况。
81.(3)实验结果：如图8-16所示。
82.由图8-10的结果可知，在2-8℃条件下保存时，在1个月内，sw480细胞质控品和cem细胞质控品的细胞面积和圆率均无明显变化，cem细胞质控品细胞膜表面epcam蛋白的表达水平有波动，sw480细胞质控品细胞膜表面epcam蛋白的表达水平整体无明显变化。
83.由图11-13的结果可知，在10-15℃条件下保存时，在15天内，sw480细胞质控品和cem细胞质控品的细胞面积、圆率、细胞膜表面epcam蛋白的表达水平均无明显变化。
84.由图14-16的结果可知，在20-25℃条件下保存时，在3天内，sw480细胞质控品和cem细胞质控品的细胞面积和圆率无明显变化。
85.以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。