一种冰冻切片盖玻片贴片染色方法

1.本发明属于病理切片技术领域，具体涉及一种冰冻切片盖玻片贴片染色方法。


背景技术：

2.冰冻切片免疫染色是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织原位检测技术。冰冻切片免疫染色实验的主要步骤包括组织取样、固定、脱水、包埋、切片、挑片、贴片、抗原修复(可选步骤)、封闭、抗体孵育、封片及显微成像等。传统冰冻切片免疫染色有贴片法和漂片法。
3.贴片法最常用于石蜡切片，也可以用于冰冻切片。贴片法使用的载玻片需要提前预处理。组织经冰冻切片机切片后，立即贴片、风干，然后存于-20℃冰箱备用。该方法进行封闭之前，需要用免疫组化笔在组织周围圈定范围，防止封闭液或者抗体扩散影响染色。贴片法所需要的抗体体积较少，可以不进行回收抗体，能较好保持组织的完整性，但在洗脱抗体时，需将整个载玻片浸泡在洗涤剂中，才能较好的去除未结合的残余抗体，降低背景。此外，贴片法的缺点还包括：(1)虽然免疫组化笔画圈可以在一定程度上阻止抗体扩散，但一抗过夜孵育时很难避免抗体扩散或挥发，引起染色效果较差。(2)载玻片预处理不当或组织在载玻片上未干透容易发生脱片。(3)需要多次摸索抗体孵育温度和打孔次数。(4)一抗，二抗结束后需在染色缸中进行清洗，耗费试剂更多。
4.漂片法是指在封片之前，组织样品均是漂浮的状态，不在载玻片或者盖玻片上贴片。组织冰冻切片后，切片直接保存于-20℃的防冻液(甘油：乙二醇：pbs缓冲液的比例为3：3：4)中备用。染色前将组织切片转移到24或12孔板中的pbs缓冲液中，清洗三次后进行后续封闭和染色步骤。待抗体孵育，漂洗结束之后，再将组织转移到载玻片上进行封片。漂片法中抗体能较好进入组织，染色效果会比较好。但漂片法的缺点包括：(1)对切片厚度、切片保存方式有特殊要求。(2)经过十几次操作以后容易烂片、碎片最后封片困难。(3)容易造成抗体染色和漂洗不均匀，(4)抗原修复时直接将组织片在修复液中煮沸容易造成组织卷曲或破碎。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于现有技术缺陷，提供一种冰冻切片盖玻片贴片染色方法。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种冰冻切片盖玻片贴片染色方法，包括如下步骤：
8.(1)将洗净的盖玻片用新鲜的apes工作液浸泡处理后，经蒸馏水清洗以去除未结合的apes，然后晾干，获得预处理盖玻片；
9.(2)将预处理盖破片放入多孔板的对应孔中，用pbs浸没，然后用细软的毛笔将冰冻切片转移至该对应孔中，并用毛笔轻轻按压使冰冻切片沉底于预处理盖玻片之上，该对应孔的尺寸使盖玻片可以平铺在对应孔的底部；
10.(3)移除pbs，同时避免冰冻切片被吸出，并用毛笔辅助调整冰冻切片在预处理盖
玻片上的位置；
11.(4)将孔板中的冰冻切片组织干燥至由透明变发白，加pbst缓冲液于脱色摇床上室温漂洗5min，加入封闭液室温孵育1h；
12.(5)移除封闭液，加入一抗溶液，2-4℃孵育12-16h；
13.(6)孵育完毕后，回收一抗溶液，于脱色摇床上室温漂洗3次，每次10-15min，然后加入含有dapi的荧光二抗溶液室温避光孵育1h；
14.(7)孵育完毕后，移除上述荧光二抗溶液，pbst避光漂洗3次，每次10-15min，最后进行封片。
15.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中，洗净的盖玻片放置于玻璃容器中，用新鲜的apes工作液浸泡。
16.在本发明的一个优选实施方案中，所述冰冻切片的厚度范围可以为40μm。
17.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)中的干燥为室温风干或烘箱烘干。
18.进一步优选的，所述室温风干为置于通风橱中，时间为20-30min。
19.进一步优选的，所述烘箱烘干的温度为37℃，时间为10min。
20.在本发明的一个优选实施方案中，所述一抗溶液的溶剂为所述封闭液。
21.进一步优选的，所述一抗溶液中添加有0.01％叠氮化钠。
22.在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光二抗溶液的溶剂为所述封闭液。
23.在本发明的一个优选实施方案中，所述封片前，用pbs清洗。
24.本发明的有益效果是：
25.1、本发明通过将冰冻切片后的组织直接贴到apes处理的盖玻片上，在孔板里进行后续的免疫染色步骤。不仅使得操作步骤变得简单易行，而且极大提高了一抗重复使用的次数，有效节约成本，同时可以得到高质量图片。
26.2、本发明中的抗体回收非常方便，延长了抗体重复使用次数和时间。后续洗脱未结合一抗、二抗的液体使用较少就可以达到很好的洗脱效果。
27.3、本发明操作简单，整个后续过程都在孔板中进行，无论孵育抗体还是漂洗，无需转移组织切片，大大降低了样品损坏的可能性。
28.4、本发明贴片效果好且组织不易变干，传统贴片染色抗体滴加在免疫组化笔画的圈内，难免遇上抗体扩散导致样品染色失败，本发明可以很好地避免这个问题。
29.5、本发明可以同时进行大批量的实验，每个盖玻片根据组织大小大约可以放2-5片冰冻切片样品，一个12孔板可以同时进行12-36个不同样品的实验，样品重复性好，实验操作占用面积较少，即使大批量实验，孔板之间也可以叠加摆放。
30.6、本发明无需额外的实验器材，传统贴片法需要暗盒和免疫组化笔。
31.7、现有的漂片法虽然染色效果较好，但经过多次步骤后，组织样品损坏严重，甚至在洗的时候丢失样品；本发明可以很好地保持组织样品的形态结构，大大提高染色的成功率。
附图说明
32.图1为本发明实施例1的流程示意图。
33.图2为本发明实施例的实验效果图。
具体实施方式
34.以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
35.实施例1
36.如图1所示，一种冰冻切片盖玻片贴片染色方法，包括如下步骤：
37.(1)盖玻片预处理：以12孔板为例，将洗净的20mm直径的圆形盖玻片置于玻璃皿中(注意避免用一次性塑料培养皿，塑料平皿容易被丙酮腐蚀)，用新鲜的apes(3-aminopropyltriethoxysilane，3-三乙氧基甲硅烷基-1-丙胺)工作液(1:50丙酮稀释或按照相应产品说明书进行)浸泡处理1-2min后(apes工作液因含有丙酮，实验操作需要在通风橱进行，工作液用后需倒入有机溶剂回收瓶待处理)，经蒸馏水冲洗2-3遍以去除未结合的apes，然后于通风橱中晾干，获得预处理盖玻片，置于4℃备用，注意防尘。
38.(2)组织贴片：将预处理盖破片放入12孔板的对应孔中，用1ml左右的pbs缓冲液浸没，然后用细软的毛笔将冰冻切片组织(本实施例中为e16.5(胚胎16.5d)小鼠脑组织的冰冻切片，厚度为40μm)转移至该对应孔中，并用毛笔轻轻按压使冰冻切片沉底于预处理盖玻片之上；用移液枪轻轻吸出孔里面的pbs缓冲液，同时避免冰冻切片组织被吸出，并用毛笔辅助调整冰冻切片在预处理盖玻片上的位置。将12孔板中的组织切片干燥至由透明变发白。
39.上述干燥为：放于通风厨，室温风干，待组织由透明变发白说明已经干透，大约需要20-30min；或放于37℃烘箱快速烘干，约5-10min；注意事项：如果没有完全干透就往下操作，组织容易发生掉片，在后续操作中应避免吸走样品。
40.(3)封闭：贴好的组织切片用pbst漂洗1-2遍(每遍5min)，接着加入300μl封闭液室温摇床孵育1h，去除封闭液。
41.(4)孵育一抗：用封闭液按照相应的抗体稀释比例对一抗进行稀释后，将一抗加入到贴有组织切片的孔板中，置于4℃孵育过夜(12-16h)，每个对应孔中大约需要300-350μl的一抗溶液即可没过盖玻片和组织样品。本实施例抗体稀释比例及相关信息见表1。
42.(5)洗脱未结合的一抗：孵育完毕后，将一抗溶液用移液枪回收到1.5ml ep管。用pbst缓冲液在脱色摇床上室温漂洗，重复三次(每孔500μl，每次10-15min)以除去未结合的一抗。
43.注意事项：回收的一抗溶液务必密封保存于4℃，下次使用前确保溶液澄清无浑浊现象即可重复使用，但多次使用后效果可能下降。经实验室测试统计，90％以上的一抗可以在半年内至少重复使用4次以上；保存半年以上的，80％的抗体至少可以重复实验2次以上。
44.(6)孵育二抗：将相应的交联有荧光基团(比如alexa 488,568,647等等)的二抗和dapi按照合适的稀释比例稀释在封闭液中，并放在脱色摇床上室温避光孵育1h。本实施例二抗配方为thermo fisher公司goat-anti rat alexa fluor 488 1:1000,goat-anti rabbit alexa fluor 568 1:1000，dapi 1mg/ml，溶剂为封闭液。
45.(7)洗脱未结合的二抗：二抗孵育完毕后，移除二抗(二抗一般不重复使用)，用pbst缓冲液摇床室温避光漂洗三次(每次15min)以除去未结合的二抗；
46.(8)封片成像：二抗洗脱结束后，为减少封片时出现气泡，pbst换成pbs再清洗一遍。用眼科镊取出盖玻片，沥干水分，轻轻倒贴至滴有封片剂(含防淬灭剂)的载玻片上，标明日期以及样品信息。用指甲油封好盖玻片边缘，防止掉落。避光，在室温晾干10-20min，用
普通荧光显微镜或者共聚焦显微镜对免疫染色组织片进行成像，也可置于玻片盒子-20℃保存用于后续成像。
47.pbs缓冲液配方：nacl：8g；kcl：0.2g；kh 2
po 4
：0.27g；na 2
hpo 4
·
12h 2
o：3.58g。溶解在1l ddh 2
o中，调节ph至7.4。
48.pbst缓冲液配方：pbs缓冲液加0.2％tritonx-100。
49.封闭液配方：10％的胎牛血清(v/v)，5％的bsa(m/v)，0.2％的tritonx-100，0.01％的nan3，溶解在pbs缓冲液中。
50.表1本实施例免疫染色抗体信息
[0051][0052]
本发明的方法(盖玻片贴片法)与传统的贴片法和漂片法(具体操作参见：詹合琴,et al.,脑组织切片免疫组化技术中漂片法与贴片法效果比较.新乡医学院学报,2006.23(1):p.9-11.)相比在实验操作明显更加便捷。如图2所示，同时采用这三种方法对e16.5(胚胎16.5d)小鼠大脑切片进行了两种增殖标记物brdu和ki67抗体的免疫荧光染色，结果显示这三种方法均可以得到较好的染色效果。三种方法中，虽然漂片法背景较低，但酸化处理过程时间较难把握，且容易造成脑片卷曲，染色成功率低。本发明的方法与贴片法相比由于洗脱未结合抗体的步骤更彻底，显示出较低的背景信号。
[0053]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。