凝溶胶蛋白检测物在制备子宫癌评估检测试剂中的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种凝溶胶蛋白检测物在制备子宫癌患病风险或预后效果评估的检测试剂中的应用。


背景技术：

2.子宫癌主要是指子宫内膜癌(endometrial carcinoma，ec)，又称宫体癌，近年来发病率逐年上升且趋于年轻化，发达国家其发病率已跃居女性生殖系统恶性肿瘤的第一位，在我国北京及上海等地其发病率也占据妇科恶性肿瘤的首位。早期子宫内膜癌在得到有效治疗后的5年生存率可达90％，但ec早期无明显症状，妇科检查也常无异常发现，造成20-30％的患者发现时已进入晚期，5年生存率不足30％，占子宫内膜癌死亡人数的一半以上。不能及时诊断ec除了会造成本病的恶化，还会增加其转移到身体的许多部位的几率：从子宫向下扩散到子宫颈管，从输卵管向上扩散到卵巢；也可以浸润到子宫周围组织；或通过淋巴系统和血液循环转移到远离子宫的部位。因此，早发现早治疗尤为重要。
3.子宫内膜癌发病率的上升及年轻化，主要是由于ec筛查方法的缺乏和高危人群的扩大，因此，开发ec的筛查产品势在必行。子宫内膜癌最常见的筛查方法是细胞学检查和宫腔镜检查，但对于无症状或不典型症状人群应用度不高。ec最常见的症状是不规则道出血。而在年轻女性或围绝经期妇女常误认为是月经不调而被忽视，绝经期的这一症状也并不是该疾病的特异性指标，只有9％的患者会诊断为子宫内膜癌。因此，急需一种更为方便、准确的筛查产品/方法用以识别早期ec患者，以降低ec的发病率及死亡率。
4.凝溶胶蛋白(gelsolin，简称gsn)首先作为参与细胞运动的细胞内肌动蛋白结合蛋白被发现，随着不断研究，发现其与炎症、癌症、创伤、心血管疾病、阿茨海默病等多种疾病相关，但对于凝溶胶蛋白的真实功能尚不明确。例如，凝溶胶蛋白可抑制炎症反应(osbom tm,dahlgren c,hartwig j h modifications of cellular responses tolysophosphatidic acid and platelet-activating factor by plasma gelsolin[j],am j physiol cellphysiol,2007,292(4):c1323-1330)和小鼠呼吸机相关性肺炎模型中，凝溶胶蛋白基因剔除小鼠的炎症反应也明显减轻(maniatis na,harokopos v,thanassopoulou a,,et al.acritical role for gelsolin in ventilator-induced lung injury[j].am j respir cell molbiol,2009,41(4):426-432.)，两研究结果存在矛盾。在肿瘤方面的报道，gsn的高表达既有增加肿瘤细胞运动性和侵袭性的作用，又有起抑制运动的作用，其在不同癌症中的细胞增殖、凋亡和侵袭也具有不同的作用，因此，时至今日gsn水平与不同癌种的关系以及机制还在不断研究中。具体到凝溶胶蛋白与子宫癌的相关性尚无相关报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种凝溶胶蛋白检测物的新应用，特别是其在制备可用于子宫癌患病风险评估、早期子宫癌筛查检测试剂中的应用。
[0006]
基于上述目的，本发明提供一种检测受试者血液样本中凝溶胶蛋白含量的物质在制备通过凝溶胶蛋白含量来评估或辅助评估受试者患子宫癌的风险或已患子宫癌者的预后效果的检测试剂中的应用，其中包括：
[0007]
制备用于检测受试者血液中的凝溶胶蛋白含量的检测试剂，和
[0008]
将检测得到的凝溶胶蛋白含量与预定值进行比较，基于该比较来评估受试者患子宫癌的风险或已患子宫癌者的预后效果，其中，预定值为范围值，所述凝溶胶蛋白含量水平超出该预定值范围时指示受试者患子宫癌风险高，或已患子宫癌者预后效果不佳，以及，所述凝溶胶蛋白含量水平在所述预定值范围之内时指示受试者患子宫癌风险低，或已患子宫癌者预后效果良好。
[0009]
上述应用所述的检测试剂包括检测试剂盒，指以凝溶胶蛋白为检测标记物，通过将可检测出血液中gsn含量的物质制成试剂或试剂盒，以该试剂或试剂盒检测受试者血液中的凝溶胶蛋白水平并与预定值进行比较，来评估其患有子宫癌的风险或预后效果，其中，所述的预后效果通过预后复发、转移及死亡体现。所述子宫癌是指子宫内膜癌。
[0010]
近年来子宫癌发病率上升及年轻化趋势与高危人群扩大有关。高危因素包括：一、未孕、未产、不孕、月经初潮早、绝经迟、月经不调；二、高脂饮食、肥胖、高血压、糖尿病；三、雌激素因素(分泌异常或长期摄入)等。40岁以上女性中具有上述高危因素中≥3项的人极为常见。对于风险人群或不典型症状人群的筛查可很大程度上提高子宫癌的早期识别率，从而提高治愈率、降低死亡率，而实现该目的有赖于更为方便、快捷、准确的筛查产品/方法，但目前这类筛查产品/方法十分缺乏。
[0011]
本发明的发明人经大量研究，发现凝溶胶蛋白在特定范围的表达与子宫癌的发生具有明显的相关性，风险组gsn异常表达的受试者中有16.96％最终被诊断为子宫癌，远高于正常风险组。临床研究中发明人还意外的发现，该异常表达与子宫癌患者的预后效果也明显相关：gsn异常表达的子宫癌患者的2年复发(转移/死亡)率高达15.91％是正常表达组的近5倍。
[0012]
本发明的应用不但有助于子宫癌的早发现早治疗，同时，对预后的评估作用还有助于临床上的合理处理，避免治疗过度或不足，从而改善预后效果。因此，以凝溶胶蛋白的含量水平评估受试者患子宫癌的风险或已患子宫癌人群的预后效果具有很大的临床意义和社会意义。
[0013]
本发明所述凝溶胶蛋白水平的预定值为60-300mg/l，所述受试者包括表征健康人群和已确诊为子宫癌的患者，以及出现非典型症状人群。
[0014]
凝溶胶蛋白属于新标志物，又与多种疾病相关，其与具体某种疾病的关联性及作用机制均尚不明确，还在不断研究中。gsn在各相关疾病中的反应呈现出显著的差异性和复杂性。gsn不仅是与疾病的相关性关系复杂——既有促进又有抑制，关于血液中 gsn含量水平的报道也存在很大差异。如在炎症中gsn的预定值单位为mg/l(专利号 cn201610875666.0)，肝癌研究中gsn含量单位为pg/ml(gsn在广西肝癌高位队列人群血清中的表达及其临床应用价值)。由此可见，虽已有一定的凝溶胶蛋白与不同疾病包括多种癌症相关性的报道，但并不能根据这些报道通过简单归纳总结就得出一致的结论并可应用于未报到的某种疾病领域中。
[0015]
临床研究结果显示，当受试者为表征健康或出现非典型症状人群时，凝溶胶蛋白
水平超出60-300mg/l范围的，后续被确诊为子宫癌的比例明显高于较未超出者；已确诊为子宫癌的患者gsn水平超出60-300mg/l的，2年复发/转移/死亡率明显高于未超出者。说明采用可检测gsn水平的试剂检测受试者血液中的凝溶胶蛋白含量并与所述预定值比较评估，引起受试者的注意，从而进一步针对性检查诊断，即可以帮助临床及早识别出子宫癌患者，以及，指导对子宫癌患者的针对性、个性化处理，提升治疗效果，又可以为未发病的高危人群敲响警钟，及时采取措施缓解、消除危险因素。
[0016]
本发明所述的应用包括实施一次或多次测试以评价受试者子宫癌的患病风险或预后效果，所述多次测试包括连续检测及定期检测。所述的血液样本优选血清或血浆。
[0017]
本发明所述应用的试剂/试剂盒中含有可确定受试者血液中凝溶胶蛋白水平的抗体，即，含有可检测出受试者血液中凝溶胶蛋白水平的抗体。该抗体可以选自凝溶胶蛋白及其变体、片段、功能衍生物或同工型。其中，凝溶胶蛋白包括天然的、合成的和重组的凝溶胶蛋白以及凝溶胶蛋白类似物。所述的凝溶胶蛋白类似物，指在功能上与天然凝溶胶蛋白或其片段在实质上相似的物质。所述的片段，意为提供维持凝溶胶蛋白生物活性的凝溶胶蛋白区段的凝溶胶蛋白分子的任何部分。所述凝溶胶蛋白的变体，是指在结构和生物活性上与天然凝溶胶蛋白或其片段实质上类似的物质。所述的凝溶胶蛋白同工型，包括在其氨基酸序列中有一些小差异的凝溶胶蛋白变型，通常是剪接变体或是一些翻译后修饰的结果。
[0018]
本发明所述应用中的检测试剂，可以是任何一种可用于检测血液中gsn含量的试剂或试剂盒，其检测方法学优选自胶体金法、荧光法、化学发光法、免疫比浊法或 elisa(酶联免疫)法中的一种。为了实现方便快捷检测的目的，进一步优选为胶体金法、荧光法或化学发光法。在一优选实施例中，本发明应用包括制备用于检测受试者血液中的凝溶胶蛋白含量的时间分辨荧光检测试剂/试剂盒。在另一优选实施例中，本发明应用包括制备用于检测受试者血液中的凝溶胶蛋白含量的化学发光检测试剂/试剂盒。
[0019]
以凝溶胶蛋白作为检测标志物的检测试剂，本领域技术人员可在各方法学试剂常规制备方法基础上，通过有限次实验得到，在此不再一一赘述。
附图说明：
[0020]
图1为凝溶胶蛋白水平评估子宫癌风险的参考区间直方图。
具体实施方式：
[0021]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0022]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023]
下述实施例中的患者的血清均来自于全血，使用前-70℃冷冻保存。
[0024]
实施例1
[0025]
凝溶胶蛋白检测试剂(时间分辨荧光法)的制备
[0026]
凝溶胶蛋白检测试剂中的检测卡由样品垫、荧光垫、具有检测线和质控线的检测垫、吸样垫及底板组成。其具体制备方法如下：
[0027]
1.荧光微球标记抗体(以500人份/批为例)
[0028]
1)取荧光微球溶液250μl离心；
[0029]
2)加入亚胺5mg，室温避光振荡反应30min，离心弃上清；
[0030]
3)用0.01m，ph7.4的pbs清洗；
[0031]
4)加入0.5mg/ml的gsn标记抗体100μl；
[0032]
5)加入1％bsa，室温避光振荡反应30min。
[0033]
2.将标记好的溶液喷涂于荧光垫，室温下干燥箱中干燥1h。
[0034]
3.抗体包被：gsn包被抗体2，包被到膜上t线位置；质控igg抗体，包被到膜上c线位置；干燥备用。
[0035]
4.其他组装、切割等常规工序不再赘述。
[0036]
实施例2：
[0037]
凝溶胶蛋白检测试剂的使用：吸取室温待测样本(血清/血浆5μl或全血10μl)，加入到1000μl的样本稀释液中，混匀后吸取80μl垂直滴加于加样孔中，静置10分钟，用荧光免疫分析仪读取数据。
[0038]
实施例3：
[0039]
凝溶胶蛋白水平与子宫癌的相关性研究
[0040]
1.样本
[0041]
收集体检中心的健康体检人群血清样本，年龄范围为40-70岁；其中，具有3项以上子宫癌风险因素的作为风险组，300例；无子宫癌风险因素且无子宫癌相关症状或证据的作为对照组，200例；以及临床确诊为子宫癌但尚未接受治疗的患者血清样本150 例，作为子宫癌组。
[0042]
2.血清制备
[0043]
抽取静脉血5ml至离心管中(不含抗凝剂)，室温中静置30分钟，离心(2000rpm/min)，吸取上层血清分装，每管100μl，-70℃冰箱储存。
[0044]
3.实验方法
[0045]
采用实施例1制备的凝溶胶蛋白试剂和实施例2所述的使用方法对三组样本中的 gsn含量进行检测。对gsn异常表达的风险组进行临床诊断，并与对照组人群随访1 年，对于子宫癌组患者进行定期随访2年，统计分析检测数据。
[0046]
表1各组gsn水平比较(mg/l)
[0047][0048]
*注：gsn异常表达指gsn含量水平超出60-300mg/l范围，下同。
[0049]
表2 gsn异常表达与子宫癌的关系
[0050][0051]
以上结果显示，健康体检人群中gsn异常的受试者患子宫癌的比例远高于gsn正常受试者；gsn异常的子宫癌患者2年内复发(转移/死亡)的比例远高于60-300mg/l 范围内患者，且组间差异具有统计学意义，这说明通过60-300mg/l这一特定gsn水平范围可以有利于子宫癌的筛查，以及子宫癌预后的评估。
[0052]
实施例4：
[0053]
凝溶胶蛋白水平评估子宫癌的预定值选取
[0054]
以实施例3中对照组200例体检人群的凝溶胶蛋白检测数据为基础，采用spss 23对所有数据进行分析处理，绘制直方图(如图1所示)，由图1可知，该组数据的偏度为 0.092，偏度的标准误差为0.172，则偏度系数的u统计量为0.53；峰度为-1.312，峰度的标准误差为0.342，则峰度的u统计量为3.84；而且s-w检验p值＝0.000；说明该组数据为非正态分布，因此，选取双侧的第2.5百分位数至第97.5百分位数作为gsn的参考区间，即60～300mg/l，当受试者血液中gsn含量超出该预定值时，其患有子宫癌的可能性较未超出该预定值时高，应密切关注并进行确诊诊断，采取适当措施。
[0055]
上述实施例对本发明进行了具体描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明，在不脱离本发明的精神实质的前提下，对本发明的修饰、改动均应涵盖在本发明的保护范围之内。