一种胃复春片中多指标成分含量测定方法与流程

1.本发明涉及中药成分含量测定技术领域，具体涉及一种胃复春片中多指标成分含量测定方法。


背景技术：

2.胃复春片收载于《中国药典》2020年版一部，由红参、香茶菜、麸炒枳壳3味中药组成，是国家中药保护品种。现代医学研究认为，它具有抑癌、杀菌、加速胃排空、促进胃液分泌及镇痛等作用。经中医辨证后，该药在临床广泛用于慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠腺化生、上皮内瘤变等胃癌癌前期病变能有效地抑制并使之逆转。2017年4月，第12届国际胃癌大会(igcc)上披露，中国胃癌每年新发现病例约68万例，占全球发病总数一半左右。中国大部分胃癌患者确诊时，病情已经进入中晚期，极为棘手。胃复春片对症治疗胃炎、癌前病变等，具有效率高、安全性高等优势。研究表明，人参皂苷及其代谢产物具有显著的抗肿瘤作用，尤其是人参经蒸制成红参后，转化的新成分能够加强抗肿瘤效果；香茶菜中二萜类、酚酸类、黄酮类成分，具有抑菌消炎、抗肿瘤、免疫调节等作用；枳壳中黄酮类成分，具有抗癌、肿瘤，抗微生物、抗炎性反应等作用。上述成分构成胃复春片的复杂体系，通过多通路、多靶点、协同增效来发挥健脾益气、活血解毒之功效。
3.现行《中国药典》标准以红参对照药材、人参皂苷rb1、re、rg1对照品作为参照，对制剂中红参进行鉴别。含量测定项下，仅对柚皮苷进行含量测定。《中国药典》(2020年版)中，以红参对照药材、人参皂苷rb1、re、rg1对照品作为参照，对制剂中红参进行鉴别，以麸炒枳壳中柚皮苷的含量进行测定，对香茶菜未作任何质量控制，因此，现行标准无法有效控制其质量。人参皂苷类成分具有较弱的紫外吸收，且在制剂中的含量较低，传统的紫外检测器(uv)的灵敏度较差。另外，中药复方的化学成分较复杂，采用高效液相色谱(hplc)分析时间较长。王桂峰等
1.建立hplc-uv(203nm)法同时测定胃复春片中的人参皂苷rg1、re、rb1、柚皮苷、新橙皮苷，检测时间为60分钟。此外，张红霞等
2.采用高效液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)同时测定胃复春片中的11种成分(柚皮苷，人参皂苷re，rg1，rb1，rf，rb2，rg2，rd，20(r)-rg3，冬凌草甲素，表诺多星醇)的含量。由于lc-ms/ms仪器的价格高昂，维护成本高，普及程度低等特点，无法满足中药企业日常的样品检验需求，方法的实际应用性不高。因此，亟待建立一种简单、准确、实用的胃复春片中全药味的质量控制方法，有效可行地控制产品质量。
4.参考文献：
5.[1]王桂峰,王云.hplc法同时测定胃复春片中的5种成分[j].天津药学,2019,31(4):32-35.
[0006]
[2]张红霞,张丽华,张莉,et al.高效液相色谱-质谱联用法同时测定胃复春片中11种成分的含量[j].中国临床药理学杂志,2018,34(12):1470-1474.


技术实现要素：

[0007]
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种同时测定胃复春片中7种成分含量的检测方法，方法简单、高效、可靠、耐用性良好，能够有效地监控生产工艺的稳定性，为产品的质量提供保障。
[0008]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009]
本发明提供了一种胃复春片中多指标成分含量测定方法，其包括如下步骤：
[0010]
步骤一，混合对照品溶液制备：精密称取橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人参皂苷re、人参皂苷rg1、人参皂苷rf、人参皂苷rb1的对照品，溶于甲醇中制得混合对照品溶液；
[0011]
步骤二，供试品溶液制备：取胃复春片样品研细，精密称定，加入甲醇溶液中制得供试品溶液；
[0012]
步骤三，测定：分别取步骤一所得的混合对照品溶液和步骤二所得的供试品溶液，定量进样，采用uplc-qda联用技术进行测定；
[0013]
其中，色谱条件的设置为：色谱柱：waters x-select hss t3，150
×
3.0mm，2.5μm；柱温：25-35℃；流速：0.3-0.6ml/min；流动相：a相为0.01-0.1％甲酸或含2mm甲酸铵的0.05％甲酸，b相为乙腈；梯度洗脱：0～4min，25％～26％b；4～5min，26％～34％b；5～8min，34％～35％b；8～10min，35％～50％b；10～12min，50％～95％b；12～13min，95％～25％b；13～16min，25％b；采用qda质谱检测器进行色谱峰的检测。
[0014]
进一步地，上述测定方法还包括如下步骤：
[0015]
步骤四，标准曲线的建立：将上述混合对照品溶液稀释不同的浓度，进样分析；以质量浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；和
[0016]
步骤五，根据供试品溶液超高效液相色谱图中7种指标成分各自的色谱峰峰面积以及已建立的各指标成分的标准曲线，分别计算出各指标性成分的含量。
[0017]
进一步地，步骤二具体为：取胃复春片样品研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理，功率330w、频率37khz，30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0018]
进一步地，步骤三中qda质谱检测器的设置：电离模式：esi-；毛细管电压：0.8kv；探头温度：550-600℃；监测方式：sir离子监测模式。
[0019]
进一步地，步骤三中qda质谱检测器的sir参数设置如下：
[0020]
[0021]
进一步地，在混合对照品溶液中，每1ml含橙皮苷6μg、新橙皮苷80μg、迷迭香酸8μg、人参皂苷re 8μg、人参皂苷rg16μg、人参皂苷rf 3μg、人参皂苷rb115μg。
[0022]
进一步地，步骤三中色谱条件的设置为：色谱柱：waters x-select hss t3，150
×
3.0mm，2.5μm；柱温：30℃；流速：0.5ml/min；流动相：a相为含0.05％甲酸的水溶液，b相为乙腈。
[0023]
进一步地，步骤三中，混合对照品溶液和供试品溶液的进样量均为1μl。
[0024]
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0025]
1、方法的先进性
[0026]
qda检测器是一种质谱检测器，能够与液相分离系统完美兼容，对紫外检测器(uv)或二极管阵列检测器(pda)进行有效地补充。qda检测器可以获得相当于单四级杆质谱仪的质谱信息，其价格相对较低，操作简单，维护保养方便，在药品分析领域的应用越来越多。本发明采用uplc-qda技术同时测定胃复春片中橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人参皂苷re、rg1、rf、rb1成分的含量，方法简单、快速高效(分析时间为15分钟)、结果可靠、耐用性良好、先进可行。
[0027]
2、方法的实用性及应用前景
[0028]
胃复春片是由红参、香茶菜、麸炒枳壳3味中药组成。其中，指标性成分人参皂苷re、rg1、rf、rb1来源于红参，迷迭香酸来源于香茶菜，橙皮苷、新橙皮苷来源于麸炒枳壳。本发明建立的uplc-qda多指标成分含量测定方法，对市售的14批胃复春片进行测定。结果表明，本发明能够用于评估胃复春片批次间的一致性及工艺的可控性，可全面控制胃复春片的质量，为其质量提升提供参考。
附图说明
[0029]
图1是本发明一实施例中供试品溶液uplc-qda色谱图，其中：1-橙皮苷；2-新橙皮苷；3-迷迭香酸；4-人参皂苷re；5-人参皂苷rg1；6-人参皂苷rf；7-人参皂苷rb1。
具体实施方式
[0030]
本发明提供了一种胃复春片中多指标成分含量测定方法，采用uplc-qda联用技术，该方法包括如下步骤：
[0031]
步骤一，混合对照品溶液制备：精密称取橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人参皂苷re、人参皂苷rg1、人参皂苷rf、人参皂苷rb1的对照品，溶于甲醇中制得混合对照品溶液；
[0032]
步骤二，供试品溶液制备：取胃复春片样品研细，精密称定，加入甲醇溶液中制得供试品溶液；
[0033]
步骤三，测定：分别取步骤一所得的混合对照品溶液和步骤二所得的供试品溶液，定量进样，采用uplc-qda联用技术进行测定；
[0034]
其中，色谱条件的设置为：色谱柱：waters x-select hss t3，150
×
3.0mm，2.5μm；柱温：25-35℃；流速：0.3-0.6ml/min；流动相：a相为0.01-0.1％甲酸或含2mm甲酸铵的0.05％甲酸，b相为乙腈；梯度洗脱：0～4min，25％～26％b；4～5min，26％～34％b；5～8min，34％～35％b；8～10min，35％～50％b；10～12min，50％～95％b；12～13min，95％～25％b；13～16min，25％b；采用qda质谱检测器进行色谱峰的检测。
[0035]
上述测定方法还包括如下步骤：
[0036]
步骤四，标准曲线的建立：将上述混合对照品溶液稀释不同的浓度，进样分析；以质量浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；和
[0037]
步骤五，根据供试品溶液超高效液相色谱图中7种指标成分各自的色谱峰峰面积以及已建立的各指标成分的标准曲线，分别计算出各指标性成分的含量。
[0038]
在本发明一优选的实施方式中，步骤二具体为：取胃复春片样品研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理，功率330w、频率37khz，30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0039]
在本发明一优选的实施方式中，步骤三中qda质谱检测器的设置：电离模式：esi-；毛细管电压：0.8kv；探头温度：550-600℃；监测方式：sir离子监测模式。
[0040]
在本发明一优选的实施方式中，步骤三中qda质谱检测器的sir参数设置如下：
[0041][0042][0043]
在本发明一优选的实施方式中，在混合对照品溶液中，每1ml含橙皮苷6μg、新橙皮苷80μg、迷迭香酸8μg、人参皂苷re 8μg、人参皂苷rg16μg、人参皂苷rf 3μg、人参皂苷rb115μg。
[0044]
在本发明一优选的实施方式中，步骤三中色谱条件的设置为：色谱柱：waters x-select hss t3，150
×
3.0mm，2.5μm；柱温：30℃；流速：0.5ml/min；流动相：a相为含0.05％甲酸的水溶液，b相为乙腈。
[0045]
在本发明一优选的实施方式中，步骤三中，混合对照品溶液和供试品溶液的进样量均为1μl。
[0046]
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0047]
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0048]
实施例1
[0049]
本实施例提供一种胃复春片中多指标成分含量测定方法，其包括如下步骤：
[0050]
(1)对照品溶液制备：取橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人参皂苷re、人参皂苷rg1、人参皂苷rf、人参皂苷rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含橙皮苷6μg、新橙皮苷80μg、迷迭香酸8μg、人参皂苷re 8μg、人参皂苷rg16μg、人参皂苷rf3μg、人参皂苷rb115μg的
混合对照品溶液，即得。
[0051]
(2)供试品溶液制备：取本品，研细，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率330w，频率37khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0052]
(3)流动相的制备：配制含0.05％甲酸的水溶液，作为流动相a；取色谱纯乙腈，作为流动相b，备用；
[0053]
(4)色谱条件的设置：色谱柱：waters x-select hss t3(150
×
3.0mm，2.5μm)；柱温：30℃；流速：0.5ml/min；取步骤(1)的对照品溶液与步骤(2)的供试品溶液，定量进样，进行梯度洗脱(0～4min，25％～26％b；4～5min，26％～34％b；5～8min，34％～35％b；8～10min，35％～50％b；10～12min，50％～95％b；12～13min，95％～25％b；13～15min，25％b)；采用qda质谱检测器进行色谱峰的检测；
[0054]
(5)qda条件的设置：电离模式：esi-；毛细管电压：0.8kv；探头温度：600℃，sir质量数见表1。
[0055]
表1 sir参数
[0056][0057]
(6)样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。
[0058]
(7)标准曲线：取橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人参皂苷re、rg1、rf、rb1的混合对照品溶液，用甲醇稀释配制为7个不同浓度的混合对照品溶液，进样分析。以质量浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及线性范围(见表2)。结果表明各成分在各线性范围内线性关系良好。
[0059]
表2线性回归方程和线性范围
[0060]
[0061]
(8)精密度：取混合对照品溶液，连续进样6次，记录各指标性成分的峰面积并计算各成分的相对标准偏差(rsd％)。6针样品中各指标性成分峰面积rsd％值在0.5～2.2之间，表明仪器精密度良好。
[0062]
(9)重复性：取同一批次胃复春片，平行制备6份，分别注入高效液相色谱仪，记录各指标性成分的峰面积并计算各成分含量，以及其相对标准偏差(rsd％)。6份样品中橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、人参皂苷re、rg1、rf、rb1含量rsd％值分别为0.6％，0.5％，2.2％，1.1％，1.0％，1.2％，0.8％，表明样品重复性良好。
[0063]
(10)准确度：取已知含量的胃复春片适量，精密称定，精密加入一定量的混合对照品溶液，使其加入量与所取胃复春片中各指标成分量之比控制在1：1左右。按“供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，进样，测定峰面积，计算回收率，结果见表3。各指标性成分的回收率和rsd％值均符合标准，表明方法准确度良好。
[0064]
表3回收率结果
[0065][0066]
(11)样品的测定：取14批胃复春片(杭州胡庆余堂药业有限公司，批号：1906615，1906664，1906665，1906666，1906697，1906699，19066102，19066109，19066110，19066116，19066119，20066215，20066220，20066226)，按照上述方法进行测定，胃复春片中每片含麸炒枳壳以橙皮苷(c
28h34o15
)和新橙皮苷(c
28h34o15
)总量计，大于2.5mg；含香茶菜以迷迭香酸(c
18h16
o8)量计，大于0.1mg；含红参以人参皂苷re(c
48h82o18
)、人参皂苷rg1(c
42h72o14
)、人参皂苷rf(c
42h72o14
)和人参皂苷rb1(c
54h92o23
)总量计，大于0.7mg。
[0067]
方法耐用性测试1
[0068]
(1)对照品溶液制备：同实施例1
[0069]
(2)供试品溶液制备：同实施例1
[0070]
(3)流动相的制备：同实施例1
[0071]
(4)色谱条件的设置：流速：0.3ml/min；其它条件同实施例1
[0072]
(5)qda条件的设置：同实施例1
[0073]
(6)样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。胃复春片中每片含麸炒枳壳以橙皮苷(c
28h34o15
)和新橙皮苷(c
28h34o15
)总量计，3.0mg；含香茶菜以迷迭香酸(c
18h16
o8)量计，0.3mg；含红参以人参皂苷re(c
48h82o18
)、人参皂苷rg1(c
42h72o14
)、人参皂苷rf(c
42h72o14
)和人参皂苷rb1(c
54h92o23
)总量计，1.1mg。
[0074]
方法耐用性测试2
[0075]
(1)对照品溶液制备：同实施例1
[0076]
(2)供试品溶液制备：同实施例1
[0077]
(3)流动相的制备：同实施例1
[0078]
(4)色谱条件的设置：流速：0.6ml/min；其它条件同实施例1
[0079]
(5)qda条件的设置：同实施例1
[0080]
(6)样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。胃复春片中每片含麸炒枳壳以橙皮苷(c
28h34o15
)和新橙皮苷(c
28h34o15
)总量计，2.8mg；含香茶菜以迷迭香酸(c
18h16
o8)量计，0.2mg；含红参以人参皂苷re(c
48h82o18
)、人参皂苷rg1(c
42h72o14
)、人参皂苷rf(c
42h72o14
)和人参皂苷rb1(c
54h92o23
)总量计，1.1mg。
[0081]
方法耐用性测试3
[0082]
(1)对照品溶液制备：同实施例1
[0083]
(2)供试品溶液制备：同实施例1
[0084]
(3)流动相的制备：同实施例1
[0085]
(4)色谱条件的设置：柱温：25℃；其它条件同实施例1
[0086]
(5)qda条件的设置：同实施例1
[0087]
(6)样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。胃复春片中每片含麸炒枳壳以橙皮苷(c
28h34o15
)和新橙皮苷(c
28h34o15
)总量计，3.0mg；含香茶菜以迷迭香酸(c
18h16
o8)量计，0.3mg；含红参以人参皂苷re(c
48h82o18
)、人参皂苷rg1(c
42h72o14
)、人参皂苷rf(c
42h72o14
)和人参皂苷rb1(c
54h92o23
)总量计，1.1mg。
[0088]
方法耐用性测试4
[0089]
(1)对照品溶液制备：同实施例1
[0090]
(2)供试品溶液制备：同实施例1
[0091]
(3)流动相的制备：同实施例1
[0092]
(4)色谱条件的设置：柱温：35℃；其它条件同实施例1
[0093]
(5)qda条件的设置：同实施例1
[0094]
(6)样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。胃复春片中每片含麸炒枳壳以橙皮苷(c
28h34o15
)和新橙皮苷(c
28h34o15
)总量计，2.9mg；含香茶菜以迷迭香酸(c
18h16
o8)量计，0.3mg；含红参以人参皂苷re(c
48h82o18
)、人参皂苷rg1(c
42h72o14
)、人参皂苷rf(c
42h72o14
)和人参皂苷rb1(c
54h92o23
)总量计，1.1mg。
[0095]
方法耐用性测试5
[0096]
(1)对照品溶液制备：同实施例1
[0097]
(2)供试品溶液制备：同实施例1
[0098]
(3)流动相的制备：同实施例1
[0099]
(4)色谱条件的设置：色谱柱agilent infinitylab poroshell ec-c18(150
×
3.0mm,2.7μm)；其它条件同实施例1
[0100]
(5)qda条件的设置：同实施例1
[0101]
(6)样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。胃复春片中每片含麸炒枳壳以橙皮苷(c
28h34o15
)和新橙皮苷(c
28h34o15
)总量计，3.0mg；含香茶菜以迷迭香酸(c
18h16
o8)量计，0.3mg；含红参以人参皂苷re(c
48h82o18
)、人参皂苷rg1(c
42h72o14
)、人参皂苷rf(c
42h72o14
)和人参皂苷rb1(c
54h92o23
)总量计，1.2mg。
[0102]
方法耐用性测试6
[0103]
(1)对照品溶液制备：同实施例1
[0104]
(2)供试品溶液制备：同实施例1
[0105]
(3)流动相的制备：同实施例1
[0106]
(4)色谱条件的设置：色谱柱waters x-select csh c18(150
×
4.6mm,3.5μm)；其它条件同实施例1
[0107]
(5)qda条件的设置：同实施例1
[0108]
(6)样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。胃复春片中每片含麸炒枳壳以橙皮苷(c
28h34o15
)和新橙皮苷(c
28h34o15
)总量计，3.2mg；含香茶菜以迷迭香酸(c
18h16
o8)量计，0.3mg；含红参以人参皂苷re(c
48h82o18
)、人参皂苷rg1(c
42h72o14
)、人参皂苷rf(c
42h72o14
)和人参皂苷rb1(c
54h92o23
)总量计，1.2mg。
[0109]
方法耐用性测试7
[0110]
(1)对照品溶液制备：同实施例1
[0111]
(2)供试品溶液制备：同实施例1
[0112]
(3)流动相的制备：配制含0.01％甲酸的水溶液，作为流动相a；取色谱纯乙腈，作为流动相b，备用；
[0113]
(4)色谱条件的设置：同实施例1
[0114]
(5)qda条件的设置：同实施例1
[0115]
(6)样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。胃复春片中每片含麸炒枳壳以橙皮苷(c
28h34o15
)和新橙皮苷(c
28h34o15
)总量计，2.9mg；含香茶菜以迷迭香酸(c
18h16
o8)量计，0.2mg；含红参以人参皂苷re(c
48h82o18
)、人参皂苷rg1(c
42h72o14
)、人参皂苷rf(c
42h72o14
)和人参皂苷rb1(c
54h92o23
)总量计，1.0mg。
[0116]
方法耐用性测试8
[0117]
(1)对照品溶液制备：同实施例1
[0118]
(2)供试品溶液制备：同实施例1
[0119]
(3)流动相的制备：配制0.05％甲酸水溶液(含2mm甲酸铵)，作为流动相a；取色谱纯乙腈，作为流动相b，备用；
[0120]
(4)色谱条件的设置：同实施例1
[0121]
(5)qda条件的设置：同实施例1
[0122]
(6)样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。胃复春片中每片含麸炒枳壳以橙皮苷(c
28h34o15
)和新橙皮苷(c
28h34o15
)总量计，2.8mg；含香茶菜以迷迭香酸(c
18h16
o8)量计，0.2mg；含红参以人参皂苷re(c
48h82o18
)、人参皂苷rg1(c
42h72o14
)、人参皂苷rf(c
42h72o14
)和人参皂苷rb1(c
54h92o23
)总量计，1.1mg。
[0123]
方法耐用性测试9
[0124]
(1)对照品溶液制备：同实施例1
[0125]
(2)供试品溶液制备：同实施例1
[0126]
(3)流动相的制备：配制含0.1％甲酸的水溶液，作为流动相a；取色谱纯乙腈，作为流动相b，备用；
[0127]
(4)色谱条件的设置：同实施例1
[0128]
(5)qda条件的设置：同实施例1
[0129]
(6)样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定。胃复春片中每片含麸炒枳壳以橙皮苷(c
28h34o15
)和新橙皮苷(c
28h34o15
)总量计，2.8mg；含香茶菜以迷迭香酸(c
18h16
o8)量计，0.2mg；含红参以人参皂苷re(c
48h82o18
)、人参皂苷rg1(c
42h72o14
)、人参皂苷rf(c
42h72o14
)和人参皂苷rb1(c
54h92o23
)总量计，1.0mg。
[0130]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。