一种基于框架核酸的多色荧光定量编码技术及其应用的制作方法

本发明属于生物，更具体地，本发明涉及一种基于框架核酸的多色荧光定量编码技术及其应用。

背景技术：

1、多种生物小分子、核酸、蛋白质的同时定性或定量检测对于生命科学及生物医药等基础研究具有重要的科学意义。例如，恶性肿瘤等复杂疾病的发生，涉及体内多种生化反应，疾病通常有多种相关联的生物标志物。因此，多种生物分子的同步识别在生物信息读取、癌症诊断和靶向治疗等许多重要领域起着至关重要的作用。以细胞识别为例，不同细胞系表达的生物标志物(如受体蛋白)呈现出的特征模式使得区分它们成为可能。因此，针对细胞上特征生物标记物的精确分子识别可以实现高灵敏度和高选择性的细胞识别。近几十年来，一类被称为核酸细胞适配体的单链寡核苷酸，由于其与靶细胞表面/内部高水平表达的某些生物分子具有特定的亲和性，已被用于细胞分析和诊断。

2、然而，在实际的多种靶标分子的荧光检测中，荧光探针之间由于光谱重叠易发生串扰及相邻光谱分子间的fret效应，导致在可见光区的有效荧光探针数量只有4～5种，极大地限制了多通道荧光成像技术的发展。而且虽然核酸细胞适配体可以与靶细胞表面/内部高水平表达的某些生物分子结合，从而实现对靶细胞的识别，然而，这些生物分子通常也存在于非靶细胞上。因此，细胞适配体通常缺乏对细胞类型的一对一特异性，仅通过单一种类的细胞适配体对于细胞的识别准确度偏低。通过使用更多的适配体来增加细胞反应的维度，构建基于多个生物标记物的模式识别已经成为细胞识别的有效策略。然而，涉及的靶标生物分子越多，就需要优选出更多的不同种类、互不串扰的荧光分子，技术难度大。同时，多个不同的适配体和相应的荧光信号的精确对应仍然是一个挑战。综上所述，发展构建编码丰富的多色荧光探针方法是当前发展多通路检测的当务之急。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

2、根据本发明的第一目的，在于提供一种基于框架核酸(framework nucleicacids，fna)自组装结构的多色荧光探针在单分子水平靶标有序识别或细胞成像中的应用，所述多色荧光探针的核苷酸序列如表1所示。

3、本发明的核心核苷酸序列如表1所示：

4、表1.核心核苷酸序列

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7、根据本发明所提供的应用，通过将所述基于框架核酸自组装结构的多色荧光探针采用生物素和亲和素结合的手段修饰，观察该荧光探针与目标序列在有序分子识别方面的研究。

8、根据本发明所提供的应用，通过将所述本发明dna四面体自组装多色荧光探针与多种细胞结合，所述细胞为本领域普通细胞，包括动物细胞，植物细胞，肿瘤细胞，微生物等，所述细胞较佳地包括肿瘤细胞，其中所述肿瘤细胞为本领域常规肿瘤细胞，包括：乳腺癌，肾上腺皮质癌，肾癌，血癌，白血病，晚期癌症，肛门癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，骨转移，成人脑/中枢神经系统肿瘤，儿童脑/中枢神经系统肿瘤，儿童癌症，不明原发性癌症，子宫颈癌，结肠/直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，尤因家族肿瘤，眼癌，胆囊癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤(gist)，妊娠滋养细胞疾病，卵巢癌，前列腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，头颈癌，神经母细胞瘤和鳞状细胞癌。较佳地包括：卵巢癌，肾癌，血癌白血病和子宫颈癌细胞，优选地包括：mcf7，hela，ccrf-cem和hek293细胞，即可在全内反射荧光显微镜中观察本发明所述荧光探针在不同肿瘤细胞中的成像情况。

9、所述多色荧光探针的孵育量优选为0.5-5nm，例如：0.5nm，1nm，2nm，3nm，4nm，5nm，更优选为1nm。所述肿瘤细胞优选地包括mcf7，hela，ccrf-cem和hek293细胞中的一种或多种组合。其中，所使用的全内反射荧光显微镜，激光波长为488，561和647nm，曝光时间为50-200ms，较佳地为80-150ms，优选地为100ms。

10、本发明的第二个目的在于提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括根据本发明所述的基于框架核酸自组装结构的多色荧光探针，以及相应缓冲液。

11、本发明还提供所述的检测试剂盒在在单分子水平靶标有序识别或细胞成像中的应用。

12、其中所述细胞为较佳地包括：动物细胞，植物细胞，肿瘤细胞或微生物细胞等。

13、其中所述肿瘤细胞为本领域普通肿瘤细胞，较佳地包括：乳腺癌，肾上腺皮质癌，肾癌，血癌，白血病，晚期癌症，肛门癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，骨转移，成人脑/中枢神经系统肿瘤，儿童脑/中枢神经系统肿瘤，儿童癌症，不明原发性癌症，子宫颈癌，结肠/直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，尤因家族肿瘤，眼癌，胆囊癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤(gist)，妊娠滋养细胞疾病，卵巢癌，前列腺癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，头颈癌，神经母细胞瘤和鳞状细胞癌细胞。所述肿瘤细胞优选地包括：mcf7，hela，ccrf-cem和hek293细胞。

14、本发明所述框架核酸自组装结构的多色荧光探针，均由本领域常规技术获得，例如核苷酸全序列合成，荧光标记等方式获得，其中所述缓冲液为本领域常规缓冲液，可以保证本发明所述多色荧光探针在其中正常行使功能，并可以通过本领域常规技术手段制备或取得。

15、本发明提供一种基于框架核酸的多色荧光探针的制备方法，所述制备方法包括：构建手臂链数量不同的dna四面体，通过在框架核酸自组装结构上标记不同种类和数量的荧光分子，从而构建一种基于框架核酸自组装结构的多色荧光探针。

16、所述框架核酸自组装结构为本领域常规框架核酸自组装结构，较佳地包括dna四面体、dna立方体、dna三角双锥、dna八面体、dna二十面体、dna折纸，更佳地为dna四面体、dna立方体、dna三角双锥，优选地为dna四面体。

17、优选地，所述手臂链位置可以设计在dna四面体的其他位点，所述手臂链的位置包含5’端、3’端或中间任意位置。

18、所述框架核酸自组装结构上的荧光分子的标记方法，为本领域常规标记方法，优选地所述标记方法包括共价、嵌入、配位中的任意一种或者多种方法。

19、所述标记的荧光分子为本领域常规荧光分子，较佳地为aleax488、rox和cy5，应该理解的是其他荧光分子也能用于该体系。

20、所述制备dna四面体的缓冲体系包括氯化镁和tris-hcl，该反应体系被维持在ph6.0-8.0条件下确保dna四面体的形成，ph值优选为8.0。

21、根据本发明的一个优选方案，提供一种基于框架核酸自组装结构的多色荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将4条dna单链混合，通过高温退火的方式得到含有不同数量手臂链、边长为20bp的dna四面体，从而构建一种基于框架核酸自组装结构的多色荧光探针。通过hplc纯化分离即可获得高纯度dna纳米自组装结构。

22、所述dna四面体的边长可以为10-100bp，较佳地为7-37bp，更佳地为20bp。但是应该理解的是，其他长度的大于20bp dna四面体同样可以用在本发明中。

23、所述dna四面体单体的组装方式包括双链杂交、共价连接等方式，只要能够保证dna四面体发生组装即可。

24、所述修饰的核酸适配体为本领域常规核酸适配体或抗体，较佳地包括as1411、syl3c、sgc8或者其他核酸适配体或抗体。

25、本发明还提供一种根据上述制备方法制得的基于框架核酸自组装结构的多色荧光探针。

26、本发明所述框架核酸自组装结构的多色荧光探针为利用本发明所述制备方法制备所得的多色荧光探针。

27、本发明所述实验方法和参数可以通过本领域教科书或公开文献获得，较佳地为利用本发明所述实验参数进行探针合成、荧光标记及细胞结合，并分析结果。

28、本发明的有益效果主要表现在：利用dna分子的可编辑性，设计连接不同的荧光分子和适配体，通过调整荧光分子在整体结构中的不同比例，可以获得检测目标，例如不同种类的细胞的特定的荧光结合图谱，从而对检测目标进行模式识别。利用该编码系统不仅实现了对多种不同种类细胞的识别，同时该编码系统可以进行扩展，实现对更多的检测目标的识别。可应用于细胞识别、药物设计、生物信息存储和读取等方面。本发明所得探针具有精确性更高，稳定性更佳等优点。