一种检测降纤酶原料及其制剂的活性的方法及应用与流程

1.本发明涉及降纤酶原料及其制剂检测技术领域，具体涉及一种利用生色 底物法检测降纤酶原料及其制剂的活性的方法及应用。


背景技术：

2.蛇毒中含有丰富的蛋白质，其中半数以上是具有催化活性的酶类，其作 用分为神经毒类和出血毒类。类凝血酶就是出血毒性的一种，是目前研究最 多并在临床上应用最为成熟的蛇毒类生化药品。
3.而降纤酶即为蛇毒类凝血酶的一种，具有去纤、降粘、解聚、溶栓等抗 凝作用，广泛用作临床治疗和预防心脑血管性疾病。
4.关于降纤酶原料及制剂的效价和含量测定，现有研究提供了多种方法。
5.具体如下：
6.传统方法采用的是纤维蛋白凝固法，通过测定降纤酶在体外将纤维蛋白 原转变为纤维蛋白后生成凝块的时间来判定降纤酶的效价。该方法不但受主 观影响大，还受降纤酶辅料右旋糖苷的影响，影响降纤酶制剂的检测准确性。
7.胡良才等报道了精氨酸酯酶活性法，通过紫外法测定精氨酸酯酶裂解对 甲基本磺酰胺-l-精氨酸甲酯(tame)产生的裂解产物的吸收值来检测降纤 酶的活性。该方法经改进后用hplc测定tame的减少量或其产物的量求得降 纤酶的活性。然而该方法选择性不好，并且tame不稳定，产生的误差大。
8.国内学者还采用酶联免疫吸附法(elisa)技术用于降纤酶制剂及血浆中 微量降纤酶含量的测定，然而该方法需要偶联抗原抗体，成本较高，很难广 泛应用。
9.雷丹青等报道了发色底物法，原理是降纤酶与发色肽s-2160 (bz-phe-val-arg-pna)释放出有强吸收峰的对硝基苯胺(pna)，通过比色 法计算含量。然而该发色肽s-2160成本高，还没有商业化应用。
10.徐梅、李娜等公开了一种测定类凝血酶活性的方法，其同样采用发色底 物法，并根据酶动力学测试方法，以商业化发色肽s2238为底物，利用紫外分 光光度计进行测试，通过建立活力u与吸光度变化值、反应体积、反应时间的 关系曲线，进而根据曲线计算酶活力。但由于反应速率对温度过于敏感，须 严格控制反应温度，因此该方法对检测仪器要求非常高，须采用可控温紫外 分光光度计，普通实验室难以推广使用；而且该方法需要对整个反应过程实 时监控，每30s测试一次吸光度，需要多次计时，增加操作人员的工作量的同 时也增加人工误差概率。此外，该方法仅公开了类凝血酶原料活性的检测而 没有对其制剂的质量控制进行具体研究。
11.鉴于上述方法的局限性，寻找一种高效、准确、具有普适性并可用于降 纤酶制剂的质量控制的降纤酶活性测定方法成为降纤酶应用研究的关键所在。


技术实现要素：

12.本发明提供一种新的降纤酶原料及其制剂的活性的方法。该方法高效、 准确、普适性好，适用于大多数普通实验室检测，而且可用于降纤酶原料及 其制剂的质量控制，解决了现有降纤酶原料及其制剂活力检测存在的问题。
13.本发明提供的降纤酶活性的检测方法，是通过建立降纤酶标准品水解发 色底物的水解产物的吸光度值与降纤酶标准品的活力值的标准曲线方程以实 现对降纤酶样品活性的检测；所述的降纤酶样品包括降纤酶原料或其制剂。
14.不同于现有技术公开的通过建立活力u与吸光度变化值、反应体积、反应 时间的关系曲线检测降纤酶活性的方法，本发明所述的降纤酶活性的检测方 法在保持较高准确性、精密度的同时还具有更简便、高效的优点，且对试验 仪器要求低，具有普适性，更具有实用价值。此外，本发明所述的检测方法 不受辅料影响，既适用于降纤酶原料及其制剂的活性检测，还可用于降纤酶 制剂处方的筛选。
15.进一步地，本发明所述的检测方法包括如下步骤：
16.降纤酶样品水解发色底物，得到含对硝基苯胺的水解产物；
17.利用紫外分光光度仪检测水解产物的吸光度；
18.将所得吸光度值代入标准曲线方程，计算得到降纤酶样品的活力值；
19.所述标准曲线方程为y＝0.0667x+0.0455，r2＝0.9991；其中x为降纤酶标 准品的酶活单位(u/ml)，y为吸光值。
20.不同于现有酶动力学测试方法的持续检测，本发明所述的检测方法是先 进行水解反应，待水解完成后再利用紫外分光光度计对水解产物的吸光度值 进行测试，大大简化了检测次数，且对检测仪器没有控温要求，降低了检测 成本。
21.进一步地，在检测前，通常会将降纤酶样品配制成溶液后再与发色底物 的工作液混合。本发明控制所述降纤酶样品的溶液浓度在2-12u/ml之间，更有 利于获得较高的相关系数，提高检测结果的准确性。
22.本发明所述的发色底物采用商业化的凝血酶的发色底物s-2238 (h-d-phe-pip-arg-pna.hcl)，有利于降低成本。
23.进一步地，本发明还对降纤酶样品及发色底物s-2238的反应比例关系进行 研究。研究发现，对于溶液浓度在2-12u/ml之间的降纤酶样品的溶液，控制所 述发色底物的工作液浓度在0.2-0.3mg/ml之间，并按照反应体积比1:(24-26) 将降纤酶样品的溶液与其混合水解，测试所得吸光度值基本可控制在0.2-1之 间，有利于提高读数准确性，同时也有利用提高相关曲线的相关系数，提高 检测的准确性。
24.作为具体实施方式之一，所述发色底物的工作液浓度为0.25mg/ml，所述 降纤酶样品溶液与所述发色底物的工作液的反应体积比为1:25。
25.所述降纤酶样品稀释溶液及发色底物工作液由20mm～50mm的tris-hcl缓 冲液(ph7.4～7.8)进行配置。
26.进一步地，本发明所述水解是在水浴中进行，水浴温度为37℃；所述水 解的时间为15～20min。研究表明，通过控制水浴水解时间在此范围内，检测 到的吸光值基本在0.2-1之间，读数准确性高；而且相关曲线的相关系数较高， 有利于提高检测的准确性。
27.进一步地，在与降纤酶样品混合前，先将发色底物于水浴37℃孵育2min， 避免局
部温差对反应的影响，有利于反应均匀进行，从而在混合后以最优反 应速率立即反应，缩短反应时间。水解反应结束后，用50％醋酸灭活。
28.进一步地，本发明所述检测方法中，紫外分光光度计的检测波长为405nm。
29.作为本发明的具体实施方式之一，所述检测方法包括：
30.(1)配制tris-hcl缓冲液，其浓度为20mm～50mm，ph7.4～7.8；
31.(2)配制降纤酶样品溶液：浓度范围为2u/ml～12u/ml；
32.(3)配制发色底物工作液：浓度范围为0.25mg/ml；
33.(4)先将发色底物工作液于水浴37℃孵育2min，再将所述降纤酶样品稀 释溶液与所述发色底物工作液按体积比例1:25混合进行水解反应；
34.(5)反应结束后，利用紫外分光光度仪检测水解产物的吸光度；
35.(6)将所得吸光度值代入标准曲线方程，计算得到降纤酶样品的活力值；
36.标准曲线为y＝0.0667x+0.0455，r2＝0.9991；其中x为降纤酶标准品的酶 活，单位(u/ml)，y为吸光值。
37.本发明还提供一种降纤酶制剂处方的筛选方法，其采用上述检测方法对 降纤酶制剂处方进行筛选，不受辅料右旋糖苷的影响，提高处方筛选的准确 性。
38.本发明的有益效果如下：
39.本发明提供的降纤酶原料及制剂活性的检测方法具有准确性高、操作简 便、成本低廉的优点，同时该方法还可用于降纤酶处方筛选。
附图说明
40.图1为12u/ml降纤酶标准品与发色底物反应时间与吸光值的关系图。
41.图2为降纤酶标准品与吸光值的反应曲线。
42.图3为发色底物法检测60℃条件下降纤酶制剂效价结果。
具体实施方式
43.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
44.以下实施例中各组分均可通过市售购买得到。
45.实施例1
46.本实施例提供一种降纤酶原料的检测方法，具体步骤如下：
47.(1)配制tris-hcl缓冲液，其浓度为20mm，ph7.4；
48.(2)配制待测降纤酶原料样品稀释溶液，使其酶活范围在2-12u/ml之间；
49.(3)配制发色底物工作液：发色底物为s-2238，浓度范围为0.25mg/ml；
50.(4)先将发色底物工作液于水浴37℃孵育2min，再将待测降纤酶原料样 品稀释溶液与所述发色底物工作液按体积比例1:25混合；
51.(5)水浴37℃孵育15～20min后，利用紫外分光光度仪检测水解产物的吸 光度；检测波长405nm；
52.(6)将所得吸光度值代入标准曲线方程，计算得到待测降纤酶原料样品 的活力值；
53.标准曲线为y＝0.0667x+0.0455，r2＝0.9991；其中x为降纤酶标准品的酶 活，单
位(u/ml)，y为吸光值。
54.效果对比试验
55.1、发色底物与降纤酶的不同反应比例对检测结果的影响
56.表1
[0057][0058]
表2
[0059][0060][0061]
由表1、表2可知，在相同发色底物工作液的浓度情况下，降纤酶溶液与 发色底物工作液的体积比例过小或过大，都会造成吸光值的过小或过大，影 响准确性。而当发色底物工作液的浓度为0.25mg/ml，降纤酶溶液与发色底物 工作液的反应体积比为2:50(1:25)时，可以保持吸光值的准确性，此时相关 曲线的相关系数较高。
[0062]
2、不同反应时间对检测结果的影响
[0063]
选用标准曲线最大酶活单位的降纤酶标准品12u/ml进行反应。
[0064]
取500μl的0.4mm发色底物工作液于离心管中，在37℃孵育2min后， 加20μl 12u/ml降纤酶标准溶液，37℃分别孵育5、10、15、20、25、30、35、 40min后，直接用用紫外分光光度仪检测，检测波长405nm，用空白调0，开 始读数。结果如图1所示。
[0065]
表3反应时间和吸光值的关系
[0066]
反应时间/min510152025303540a4050.37510.61440.76630.94211.07531.19781.27351.3304
[0067]
结果显示，当12u/ml降纤酶标准品与发色底物作用时，随着时间的延长， 吸光值也随之增大，20min以后，吸光值趋于稳定。反应时间在5-20min范围 内呈线性，并且吸光值基本在0.2～1之间，读数较准确，考虑到时间太快无法 掌控导致误差，因此反应时间定位15～20min。
[0068]
3、专属性
[0069]
取500μl的0.4mm发色底物工作液于离心管中，在37℃孵育2min后， 分别加20μl的2、4、6、8、10、12u/ml降纤酶标准溶液，37℃孵育15min 后，直接用用紫外分光光度仪检测，检测波长405nm，用空白调0，开始读数。
[0070]
表4
[0071]
标准降纤酶酶活浓度u/mla40520.172240.311460.456580.5853100.7045120.8444
[0072]
结果显示，该实验获得的标准曲线为y＝0.0667x+0.0455，r2＝0.9991。该 方法的相关性好，准确度高，公式简单容易计算。具体如图2所示。
[0073]
相同的条件测定3批供试品(北京赛升药业股份有限公司注射用降纤酶 制剂202101265(5u)、20210401(10u)、20210527(10u)和3％右旋糖酐 溶液的吸光度，并计算供试品和辅料的酶活。
[0074]
表5
[0075]
供试品a405效价(％)2021012650.2935109.9202104010.5394109.4202105270.524105.93％右旋糖苷溶液-0.0015——
[0076]
上述供试品代入曲线公式中得到的酶活含量，3％右旋糖苷溶液吸光值为
ꢀ‑
0.0015，对供试品检测无干扰，表明专属性良好。
[0077]
两批制剂具有吸光值，效价值是用实验测得值与该浓度的降纤酶中间体 的该方法测定值(6.77u/ml)的比值来表示。
[0078]
4、检测方法的日间精密度
[0079]
取500μl发色底物工作液于离心管中，在37℃孵育2min后，分别加20μl 的2、4、6、8、10、12u/ml降纤酶标准溶液，37℃孵育15min后，直接用用 紫外分光光度仪检测，检测波长405nm，用空白调0，开始读数，相同的条件 测定供试品的吸光度。
[0080]
以标准降纤酶的酶活浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，根据标准曲线计 算供试品的酶活(u/ml)。连续三日进行检测。
[0081]
表6发色底物法的日间精密度
[0082][0083]
结果显示，不同日期测量cv(％)小于5(cv限度＜15％)，日间精密度较 好，准确度高。
[0084]
5、本发明与纤维蛋白原凝固法比较
[0085]
本发明方法：取500μl发色底物工作液于离心管中，在37℃孵育1～2min 后，分别加20μl的2、4、6、8、10、12u/ml降纤酶标准溶液，37℃孵育10～15min 后，直接用用紫外分光光度仪检测，检测波长405nm，用空白调0，开始读数， 相同的条件测定供试品的吸光度。
[0086]
以标准降纤酶的酶活浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，根据标准曲线计 算供试品的酶活(u/ml)。
[0087]
纤原凝固法：标准品溶液的制备取降纤酶标准品，加三羟甲基氨基甲烷 缓冲液(ph7.4)制成每1ml中含20、10、5、2.5单位的溶液。
[0088]
供试品溶液的制备取本品适量，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(ph7.4)(取 三羟甲基氨基甲烷2.42g与氯化钠0.585g，加水适量使溶解，用1mol/l盐酸 溶液调节ph值至7.4，加水稀释至500ml)制成标准曲线范围内浓度的溶液。
[0089]
测定法取试管(1cm
×
10cm)4支，各精密加入0.4％纤维蛋白原溶液(取纤 维蛋白原，用上述三羟甲基氨基甲烷缓冲液(ph7.4)制成0.4％可凝蛋白溶液) 0.2ml，置(37
±
0.5)℃水浴中保温2分钟，依次精密量取4种浓度的标准品溶液 各0.2ml，迅速加入上述各试管中，立即摇匀，同时记时，于(37
±
0.5)℃水浴 中观察纤维蛋白原的初凝时间，每种浓度测5次，求平均值(5次测定最大与 最小值之差不得超过平均值的10％，否则重测)。在双对数坐标纸上，以标准 品单位数(u)为横坐标，初凝时间为纵坐标计算回归方程(相关系数应大于 0.99)。
[0090]
表7发色底物法与纤原凝固法比较1
[0091][0092]
表8发色底物法与纤原凝固法比较2
[0093][0094]
表9发色底物法与纤原凝固法比较3
[0095][0096]
结果显示：
[0097]
(1)从表7显示，纤原凝固法的检测方法，受右旋糖苷的影响较大，其 会明显抬高制剂的效价，右旋糖苷的含量越大，酶活含量就越高，其数值呈 现的是降纤酶和其辅料的综合效价。而发色底物法是降纤酶本身与底物发生 反应，生成有紫外吸收的产物，酶活的大小与降纤酶的含量成正比。检测方 法不受其辅料右旋糖苷的影响。
[0098]
(2)从表8显示，发色底物法可用于检测市售常规规格的降纤酶原料和 制剂，而纤原凝固法不同批次之间的误差较大。
[0099]
(3)从表9显示，发色底物法用于降纤酶不同处方的检测，当检测不同 保护剂和包材的降纤酶制剂时，发色底物法所测的数值的差别符合预期，说 明发色底物法可避免辅料的影响，在处方筛选中可以根据真实值进行有效筛 选。而纤原凝固法受其他多种辅料检测的影响，例如海藻糖和氨基酸等保护 剂，在检测过程中会延迟纤原的凝固，因而测得酶活偏低。
[0100]
实施例2应用于筛选处方
[0101]
取500μl发色底物工作液于离心管中，在37℃孵育2min后，分别加20μl 的2、4、6、8、10、12u/ml降纤酶标准溶液，37℃孵育15min后，直接用用 紫外分光光度仪检测，检测波长405nm，用空白调0，开始读数，相同的条件 测定供试品的吸光度。
[0102]
以标准降纤酶的酶活浓度(u/ml)为横坐标，吸光度(a405)为纵坐标， 根据标准曲线计算供试品的酶活(u/ml)。
[0103]
将不同处方的供试品经60℃放置0天、5天、10天、30天的酶活变化， 考察稳定性。
[0104]
表10降纤酶制剂筛选保护剂的处方设计
[0105]
序号降纤酶(单位/支)右旋糖苷浓度保护剂1103％/2101％2％海藻糖31003％海藻糖4101％2％甘氨酸5101％2％谷氨酸和精氨酸6101％2％谷氨酸和组氨酸
[0106]
利用发色底物法对不同处方的降纤酶制剂在60℃的不同时间点进行检测。
[0107]
表11发色底物法检测60℃条件下降纤酶制剂效价(内控标准85％-115％)
[0108][0109][0110]
根据以上结果做出折线图，如图3所示。
[0111]
结果显示，本发明所述的检测方法可用于处方的筛选，在60℃条件下考 察影响因素实验，30天结束后，根据折线图分析，原处方和甘氨酸处方的稳 定性最差，效价一直呈现降低的趋势，其他处方较稳定，可通过后续的实验 继续探究处方的配比。
[0112]
综上所述，本发明采用s-2238发色底物法测定降纤酶原料及制剂的活性 具有准确性高、操作简便的优点，适用于不同原料、中间体、制剂的效价检 测，还可用于降纤酶制剂处方的筛选。
[0113]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员 而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或 改进，均属于本发明要求保护的范围。