非洲猪瘟病毒检测试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,asfv)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血为临床特征，病程短，发病率高，病死率高(可高达100％)。特别是传染源多、传播途径多、传播方式多，一旦发生损失惨重。asf为世界动物卫生组织(oie)的法定报告动物疫病为我国规定的一类动物疫病，受到世界各国的高度重视。
3.该病由于致死率高，同时在世界范围内缺少有效的疫苗和特异性治疗手段，导致asf成为目前世界上危害养猪业的最重要的疫病之一。对asf的控制目前只能依赖快速诊断、对发病动物的扑杀，以及采取有效的检疫措施和严格的卫生措施。
4.asfv的实验室诊断方法主要分为病原学检测和血清学检测。其中世界动物卫生组织(world organization for animal health，oie)推荐的病原学检测方法包括病毒分离和红细胞吸附、传统的聚合酶链反应试验检测(pcr检测)、荧光定量聚合酶链反应试验检测(realtime-pcr检测)、酶联免疫吸附试验检测(elisa检测)，我国也批准了商业化的基于realtime-pcr检测和等温扩增技术的asfv核酸检测产品以及免疫吸附的胶体金快速检测试纸条。然而这些方法均存在一定的缺点，如病毒分离和红细胞吸附需要在高等级生物安全实验室开展，不利于临床检测和诊断；核酸检测存在耗时长，且有核酸污染的风险，容易造成假阳性；传统的elisa检测敏感性低，且由于其反应载体本身的特性，导致非特异性反应现象普遍，容易出现假阳性，且反应时间较长，普遍在1个小时以上；胶体金快速检测试制条敏感性低，存在较大比例的漏检。
5.专利cn111925436a公开了基于asfv p30蛋白单克隆抗体1b11和4f7的elisa检测试剂盒和胶体金检测试纸条，与pcr检测方法相比，elisa检测试剂盒的敏感性达到了90.3％，特异性100％；胶体金检测试纸条的敏感性为85.5％，特异性为100％。elisa检测试剂盒和胶体金检测试纸条的检测下限分别为30ng/ml和50ng/ml，检测时间分别为1小时和5分钟。但是存在以下缺陷：1、elisa的检测时间过长，需要1个小时，不利于现场快速检测；2、elisa的灵敏度不够，存在漏检的可能性；3、胶体金快速检测试纸条的敏感性低，存在较大比例的漏检。
6.专利cn111072774a公开了抗asfv p30蛋白的单域抗体，并在此基础上开发了检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒。该试剂盒的最低检测限为21.8ng/ml，但其检测时间过长，需要1个小时，不利于现场快速检测。
7.为了克服当前检测技术的缺点，并应对目前临床中非洲猪瘟检测的需要，亟需开发一种敏感性高、特异性好，且可在短时间内完成检测的高通量检测技术。


技术实现要素：

8.针对现有技术中存在的不足，本技术提供一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，具有敏感性高、特异性好、反应时间短、使用方便，从而便于现场快速检测诊断的优点。
9.本技术的第一方面提供了一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其包括芯片、酶标试剂、洗涤液、tmb底物溶液和无尘纸，所述芯片包括改性硅胶膜载体和固定于所述改性硅胶膜载体上的第一单克隆抗体。
10.根据本技术的一些实施方式，所述改性硅胶膜载体包括表面修饰寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯的聚二甲基硅氧烷。根据本技术的一些实施方式，所述改性硅胶膜载体通过包括如下步骤的方法制备：
11.a：提供表面含引发剂的聚二甲基硅氧烷；
12.b：将所述表面带引发剂的聚二甲基硅氧烷与寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯发生聚合反应，得到所述改性硅胶膜载体。
13.根据本技术的一些实施方式，通过将聚(二甲基甲基乙烯基硅氧烷)、2-溴-2-甲基丙酸10-十一碳烯基与带烯末端的聚(二甲基甲基乙烯基硅氧烷)或聚(二甲基甲基氢基硅氧烷)混合，静置，形成弹性体，得到所述表面带引发剂的聚二甲基硅氧烷。根据本技术的一些具体实施方式，聚(二甲基甲基乙烯基硅氧烷)、聚(二甲基甲基乙烯基硅氧烷)或聚(二甲基甲基氢基硅氧烷)与2-溴-2-甲基丙酸10-十一碳烯基的重量比为10：1：(4-0.01)。根据本技术的一些具体实施方式，所述静置的时间为6-24h。
14.本技术中，改性硅胶膜载体是以生物学研究常用的聚二甲基硅氧烷(pdms)为基础，在其中加入特定的引发剂成分(使该材料可通过表面引发聚合反应(sip)实现表面功能化修饰)，再经过寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poegma)表面修饰获得的。具体地，以聚(二甲基甲基乙烯基硅氧烷)为高分子前体，带烯末端的聚(二甲基甲基乙烯基硅氧烷)或聚(二甲基甲基氢基硅氧烷)为交联剂，2-溴-2-甲基丙酸10-十一碳烯基酯为带烯末端引发剂。在高分子前体和交联剂的基础上加入带烯末端引发剂，通过硅氢键合以共价键附着到聚二甲基硅氧烷pdms的三维结构中，最后得到表面带引发剂的聚二甲基硅氧烷。在该表面带引发剂的聚二甲基硅氧烷上，进一步引发聚合寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯的聚合而得到本技术的改性硅胶膜载体。本技术的改性硅胶摸载体具有优秀的抗蛋白质非特异性吸附(nonspecific protein adsorption，npa)能力，可以将复杂蛋白免疫检测中的非特异性蛋白质吸附控制到接近“绝对”水平(接近或低于仪器的检测极限)，不仅可以免除封闭和多次清洗的麻烦，还可以通过使用更强的信号扩增手段来提高蛋白质微阵列的灵敏性。而且其硅橡胶的本质赋予了该材料较强的机械性能和良好的可操作性。
15.根据本技术的一些实施方式，所述第一单克隆抗体在所述改性硅胶膜载体的点样量为18-22nl/点，点样浓度为0.1-0.8mg/ml。
16.根据本技术的一些实施方式，所述酶标试剂包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-d-半乳糖苷酶标记的第二单克隆抗体。
17.根据本技术的一些实施方式，所述第一单克隆抗体的重链可变区包括seq.id no.1所示的核苷酸序列或其简并序列编码的氨基酸序列。根据本技术的一些实施方式，所述第一单克隆抗体的轻链可变区包括seq.id no.3所示的核苷酸序列或其简并序列编码的氨基酸序列。
18.根据本技术的一些实施方式，所述第一单克隆抗体的重链可变区包括seq.id no.2所示的氨基酸序列或其保守性变异体。根据本技术的一些实施方式，所述第一单克隆抗体的轻链可变区包括seq.id no.4所示的氨基酸序列或其保守性变异体。
19.根据本技术的一些实施方式，所述第二单克隆抗体的重链可变区包括seq.id no.5所示的核苷酸序列或其简并序列编码的氨基酸序列。根据本技术的一些实施方式，所述第二单克隆抗体的轻链可变区包括seq.id no.7所示的核苷酸序列或其简并序列编码的氨基酸序列。
20.根据本技术的一些实施方式，所述第二单克隆抗体的重链可变区包括seq.id no.6所示的氨基酸序列或其保守性变异体。根据本技术的一些实施方式，所述第二单克隆抗体的轻链可变区包括seq.id no.8所示的氨基酸序列或其保守性变异体。
21.本技术中，术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链n末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链n末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员能够知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与非洲猪瘟病毒特异性结合。
22.根据本技术的一些实施方式，所述洗涤液为20
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浓缩洗涤液。根据本技术的一些实施方式，所述20
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浓缩洗涤液包括含5-15％吐温20(v/v)、0.2％-5％蔗糖(w/v)和0.5-2％edta(w/v)的ph值为7.2-7.6的pbs溶液。根据本技术的优选实施方式，所述pbs溶液的浓度为0.1-0.2mol/l。根据本技术的优选实施方式，所述20
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浓缩洗涤液包括含10％吐温20(v/v)、0.5％-2％蔗糖(w/v)和1％edta(w/v)的ph值7.4的0.1mol/l的pbs溶液。根据本技术的进一步优选实施方式，所述20
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浓缩洗涤液包括含10％吐温20(v/v)、0.5％-2％蔗糖(w/v)、1％edta(w/v)、0.004％am染料(w/v)的ph值7.4的0.1mol/l的pbs溶液。其中，v/v表示体积/体积，w/v表示质量/体积。
23.本技术中，tmb底物溶液也叫3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液。根据本技术的一些实施方式，所述tmb底物溶液为沉淀型单组分tmb底物溶液。
24.根据本技术的一些实施方式，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
25.s1：将芯片上的微孔用20倍稀释后的洗涤液洗涤、浸润后，弃洗涤液，除去多余的水分；
26.s2：在相应的微孔中先加入待测样品，然后加入酶标试剂，得到反应液；优选地，待测样品和酶标试剂的加入量为1：1；
27.s3：将所述反应液温育，优选所述温育的温度为35-40℃，时间为10-20min；转速为800-1200rpm；
28.s4：除去反应液，用洗涤液洗涤，浸泡后弃洗涤液，除去多余的水分；
29.s5：在相应的微孔中加入tmb底物液，温育；优选所述温育的温度为35-40℃，时间为10-20min；转速为800-1200rpm；
30.s6：将温育后的反应液弃掉，除去多余的水分，拆除芯片上盖，用无尘纸吸干芯片膜表面的水分，将其置于微孔盘芯片影像仪内测定结果。
31.根据本技术的一些实施方式，所述酶标试剂中，所述第二单克隆抗体的标记率为0.5-0.6。
32.根据本技术的一些实施方式，所述酶标试剂的使用浓度为6000-9000倍稀释。
33.根据本技术的一些实施方式，所述酶标试剂的加样量为20-100μl/孔。
34.根据本技术的一些实施方式，所述待测样品与所述酶标试剂的反应时间为15-30min。
35.根据本技术的一些实施方式，所述待测样品与所述酶标试剂的反应的反应转速为500-1000rpm。
36.本发明提供的试剂盒采用改性硅胶膜作为反应载体，将asfv p30蛋白的单克隆抗体固定于该反应载体上，进行非洲猪瘟病毒的检测。本发明所提供的非洲猪瘟病毒检测试剂盒在保留了常规elisa试剂盒可单批次处理多份样品优点的同时，提高了灵敏度，最低检测限可达20ng/ml，同时大大缩短了检测时间，将检测时间从常规elisa的1个小时左右缩短只35分钟左右，大大提高了检测效率，更便于现场快速检测诊断。
37.本技术的第二方面提供了第一方面所述的试剂盒在检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒中的应用。
38.根据本技术的一些实施方式，所述待测样品包括血清、全血、血浆、组织研磨液和唾液中的一种或多种。
39.根据本技术的一些实施方式，所述酶标试剂中，所述第二单克隆抗体的标记率为0.5-0.6。
40.根据本技术的一些实施方式，所述酶标试剂的使用浓度为6000-9000倍稀释。
41.根据本技术的一些实施方式，所述酶标试剂的加样量为20-100μl/孔。
42.根据本技术的一些实施方式，所述待测样品与所述酶标试剂的反应时间为15-30min。
43.根据本技术的一些实施方式，所述待测样品与所述酶标试剂的反应的反应转速为500-1000rpm。
44.本发明的有益效果：
45.1.本发明利用非洲猪瘟病毒单克隆抗体，将传统的elisa反应转移至改性硅胶膜上进行，开发出了非洲猪瘟病毒检测试剂盒(蛋白芯片法)，在保证传统elisa检测所具备的高通量优点的同时，提高了灵敏度，检测灵敏度可达20ng/ml。
46.2.本发明的非洲猪瘟病毒检测试剂盒(蛋白芯片法)，检测时间仅需35分钟左右，相比传统elisa检测，大大缩短了检测时间，更利于现场快速检测诊断。
47.3.相比荧光定量pcr及普通pcr检测方法，本发明的非洲猪瘟病毒检测试剂盒(蛋白芯片法)不存在核酸污染的风险，因此，大大降低了假阳性的出现。
具体实施方式
48.为使本发明容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
49.本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
50.实施例1非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
51.1.1非洲猪瘟病毒p30蛋白的制备和纯化
52.参考genbank公开的基因序列(genbank登录号：mh766894.1)，合成asfv p30蛋白基因片段，采用大肠杆菌表达系统进行了诱导表达，对表达的蛋白进行蛋白亲和层析纯化，纯化后测定含量为2.4mg/ml。
53.1.2非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备和纯化
54.将asfv p30蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，并添加安必奇生物科技有限公司的magic佐剂10μl，混合乳化后免疫小鼠1次。随后分别间隔1周、间隔3周，将asfv p30蛋白与弗氏不完全佐剂等体积、安必奇生物科技有限公司的magic佐剂10μl混合乳化后免疫小鼠2次。将免疫后的小鼠血清用asfv p30蛋白包被的间接elisa板子评价小鼠血清的抗体效价，选取抗体效价最高的小鼠在融合前3天腹腔注射不含佐剂的p30蛋白80μg进行加强免疫，选取间隔1周的小鼠进行细胞融合，通过有限稀释法进行杂交瘤细胞的亚克隆筛选，最后获得10株阳性杂交瘤细胞，其中有4株(3h7、5b4、2g1、4b1)细胞上清的elisa效价≥1:128，其余效价偏低、反应性不好故舍弃。将这4株(3h7、5b4、2g1、4b10)杂交瘤细胞制备腹水使用辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化。纯化后的抗体纯度至少约86％。使用bca蛋白浓度测定试剂盒测定4株(3h7、5b4、2g1、4b10)纯化单克隆抗体的浓度依次为3.2mg/ml、3.9mg/m1、0.9mg/m1、0.7mg/ml，其中2g6和4b10单克隆抗体纯化后的得率较低。
55.1.3单克隆抗体抗体相加试验研究
56.将可溶性表达的asfv p30蛋白作为包被原，按0.1μg/m1、100μ1/孔包被于微孔板后用含5％脱脂奶(m/v)的pbs封闭液进行封闭，然后加入第一株饱和浓度的单克隆抗体1与之反应，洗涤、拍干，再加入另一株饱和浓度的单克隆抗体2与之反应，洗涤、拍干。两株单克隆抗体反应完毕后，再加入hrp标记的羊抗鼠igg与之反应，洗涤、显色，测定其吸光度a值。按公式ai＝[(a1.2-a1)/a2]
×
100％，分别计算单克隆抗体两两叠加的增值指数ai。其中，a1、a2分别为单克隆抗体1和单克隆抗体2的a值，a1.2为单克隆抗体1叠加单克隆抗体2的a值；当ai大于50％即可初步断定两种单克隆抗体对应不同的抗原结合位点。结果：单克隆抗体3h7、5b4、2g1、4b10抗体相加指数a值详见表1。考虑到2g1、4b10两株单克隆抗体纯化后的得率较低，故选择识别不同抗原表位的单克隆抗体3h7、5b4进行双抗体夹心方法检测抗原的研究。其中，单克隆抗体3h7的重链可变区为seq.id no.1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列或seq.id no.2所示的氨基酸序列，单克隆抗体3h7的轻链可变区为seq.id no.3所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列或seq.id no.4所示的氨基酸序列；单克隆抗体5b4的重链可变区为seq.id no.5所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列或seq.id no.6所示的氨基酸序列，单克隆抗体5b4的轻链可变区为seq.id no.7所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列或seq.id no.8所示的氨基酸序列。
[0057]
表1单克隆抗体两两叠加的增值指数ai
[0058][0059]
1.4单克隆抗体其他特性的鉴定
[0060]
用小鼠单克隆抗体ig类/亚类/亚型鉴定用elisa试剂盒鉴定。结果3h7和5b4两株单克隆抗体的重链亚类分别为igg2a和igg1，轻链亚类均为kappa。
[0061]
1.5单克隆抗体特异性鉴定
[0062]
取单克隆抗体3h7和5b4分别对猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪伪狂犬病病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)按常规间接免疫荧光方法(ifa)检测，以判断其特异性。结果两株单克隆抗体均为阴性，说明单克隆抗体3h7和5b4特异性良好。
[0063]
1.6单克隆抗体反应性的评价
[0064]
用间接elisa方法(使用asfv p30蛋白进行包被，包被量为0.1μg/ml，100μl/孔)测定两株单克隆抗体3h7和5b4的elisa效价，结果分别为1∶1024000、1∶2048000。
[0065]
实施例2非洲猪瘟病毒检测试剂盒的制备和检测方法
[0066]
2.1酶标单克隆抗体的制备和鉴定
[0067]
采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶(hrp)标记于纯化的单克隆抗体。两株单克隆抗体3h7和5b4分别制备3批hrp标记的酶标单克隆抗体，均为棕红色澄清液体，克分子比值为1.679-1.790，均不低于1.5；标记率为0.544-0.574，均不低于0.5；活性检测直接elisa效价为1︰6400-1︰25600。
[0068]
2.2单克隆抗体配对模式的研究
[0069]
对单克隆抗体3h7和5b4分别进行包被和hrp酶标记，基于elisa反应体系通过棋盘法分别检测3份非洲猪瘟病毒阴性血液类样品(n1-n3)和非洲猪瘟病毒阳性血液类样品(p1-p3)，结果3h7作为包被抗体、5b4作为hrp酶标记抗体时，p/n值最大，为44.643，详见表2。因此确定非洲猪瘟病毒检测试剂盒(蛋白芯片法)的最佳配对模式为3h7作为包被抗体、5b4作为hrp酶标记抗体。
[0070]
表2非洲猪瘟病毒检测试剂盒单克隆抗体配对模式的选择结果
[0071]
[0072]
2.3非洲猪瘟病毒检测试剂盒的制备
[0073]
芯片：将单克隆抗体3h7稀释至0.4mg/ml，然后点样在sj改性硅胶膜上(同时点样3个asfv p30蛋白作为阳性质控点以及一个点样液点作为阴性质控点)。sj改性硅胶膜的制备过程参见中国专利cn101265329a。
[0074]
酶标试剂：用样品稀释液将酶标单克隆抗体5b4按1:6000进行稀释，0.22μm滤膜过滤，无菌分装。
[0075]
20
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浓缩洗涤液：含10％吐温20(v/v)、0.5％-2％蔗糖(w/v)、1％edta(w/v)和0.004％am染料(w/v)的ph值7.4的0.1mol/l的pbs溶液。
[0076]
tmb底物液：为商品化的沉淀型单组分tmb底物液(购自北京索莱宝科技有限公司，商品名称为“tmb单组分显色液)。
[0077]
无尘纸：为商品化的无尘纸。
[0078]
将上述芯片、酶标试剂、20
×
浓缩洗涤液、tmb底物液、无尘纸组装成非洲猪瘟病毒检测试剂盒。
[0079]
2.4非洲猪瘟病毒检测试剂盒检测方法的建立
[0080]
检测方法：步骤1)将样品对应芯片微孔按序编号。步骤2)每孔加20倍稀释后的洗涤液300μl，室温静置充分浸润3分钟。步骤3)甩弃洗涤液，在吸水材料上尽量扣干。步骤4)在相应微孔中先加入待检样品50μl，然后加入酶标试剂50μl。步骤5)置微孔板恒温振荡器37℃、1000rpm温育15分钟。步骤6)甩弃反应液，每孔加入稀释后的洗涤液300μl，浸泡10-20秒，甩弃洗涤液。如此反复连续洗板5次，最后一次在吸水材料上尽量扣干。步骤7)每孔加入tmb底物液100μl，置微孔板恒温振荡器37℃、1000rpm温育15分钟。步骤8)甩弃反应液，尽量甩净液体，拆除芯片上盖，将无尘纸平铺于芯片膜表面，轻轻按压蘸干至膜表面无水迹(勿用无尘纸在芯片膜表面来回摩擦)，并于10分钟内将其置于微孔盘芯片影像仪内测定结果。
[0081]
结果判定：阳性质控点灰度值均应≥10000，否则该孔检测结果无效。
[0082]
阳性：灰度值≥5000判为非洲猪瘟病毒阳性。
[0083]
阴性：灰度值＜5000判为非洲猪瘟病毒阴性。
[0084]
该检测方法为一步法，整个检测时间较短，仅约35分钟。
[0085]
2.5芯片制备工艺优化
[0086]
2.5.1点样量的选择
[0087]
将包被用3h7单克隆抗体用点样液稀释至0.4mg/ml，分别按18nl、20nl及22nl点样量制备芯片，分别检测非洲猪瘟病毒阳性血液类样品(p1-p3)和阴性血液类样品(n1-n3)，结果点样量18-22nl时p/n值均在10以上，均较为理想，其中20nl点样量时p/n最大。结果详见表3。
[0088]
表3不同点样量检测结果
[0089]
[0090][0091]
2.5.2点样浓度的选择
[0092]
将包被用3h7单克隆抗体用点样液分别稀释至0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml点样制备芯片，分别检测非洲猪瘟病毒阳性血液类样品(p1-p3)和阴性血液类样品(n1-n3)，结果点样浓度在0.1-0.8mg/ml时，p/n值均在10以上，均较为理想，其中0.2mg/ml点样浓度的p/n值最高，结果详见表4。
[0093]
表4不同点样浓度检测结果
[0094][0095]
2.5.3样品及酶标试剂加液量选择
[0096]
根据2.5.1-2.5.2优化条件制备芯片，比对50μl、75μl、100μl加液量，分别检测非洲猪瘟病毒阳性血液类样品(p1-p3)和阴性血液类样品(n1-n3)，结果样品及酶标试剂加液量在50-100μl时，p/n值均在10以上，均较为理想，其中加样量为50μl/孔时检测的p/n值最高，详见表5。
[0097]
表5样品及酶标试剂不同加液量的检测结果
[0098][0099][0100]
2.5.4酶标抗体使用浓度选择
[0101]
根据2.5.1-2.5.2优化条件制备芯片，5b4酶标抗体分别稀释3000倍、6000倍、9000倍，分别检测非洲猪瘟病毒阳性血液类样品(p1-p3)和阴性血液类样品(n1-n3)，结果酶标抗体6000-9000倍稀释时，p/n值均在10以上，均较为理想，其中6000倍稀释时检测的p/n值
最高，详见表6。
[0102]
表6不同浓度酶标抗体的检测结果
[0103][0104]
2.5.5样品及酶标试剂反应时间选择
[0105]
根据2.5.1-2.5.2优化条件制备芯片，按照2.5.3-2.5.4优化后加液量及酶标抗体浓度反应，样品及酶标试剂反应时间分别为15min、30min、60min，分别检测非洲猪瘟病毒阳性血液类样品(p1-p3)和阴性血液类样品(n1-n3)，结果不同反应时间的p/n值均在15以上，均较为理想，其中样品及酶标试剂反应时间15min与30min时p/n值差异不大，15min略高于30min，且均高于60min。结果详见表7。
[0106]
表7样品及酶标试剂不同反应时间的检测结果
[0107][0108][0109]
2.5.6反应转速选择
[0110]
根据2.5.1-2.5.2优化条件制备芯片，按照2.5.3-2.5.5优化后条件反应，设置0rpm、250rpm、500rpm、1000rpm不同反应转速，分别检测非洲猪瘟病毒阳性血液类样品(p1-p3)和阴性血液类样品(n1-n3)，结果0-1000rpm检测时，p/n值均在10以上，均比较理想，其中转速为500-1000rpm时p/n值最高，且无明显差异。结果详见表8。
[0111]
表8不同反应转速的检测结果
[0112][0113]
实施例3非洲猪瘟病毒检测试剂盒的评价
[0114]
灵敏度：将实施例1制备的asfv p30蛋白进行系列稀释，按检测方法进行检测，结果非洲猪瘟病毒检测试剂盒的检测下限为20ng/ml。
[0115]
敏感性：取50份背景清楚且pcr检测asfv核酸阴性的样品(含35份脏器组织研磨液上清、12份血清血浆或全血、3份唾液)，将实施例1中制备的asfv p30蛋白进行稀释并添加至该50份样品中，使样品中p30蛋白的最终浓度为5-80ng/ml，用试剂盒进行检测，结果试剂盒检出47份阳性(p30蛋白的最终浓度为20-80ng/ml)、3份阴性(p30蛋白的最终浓度为5-10ng/ml)，敏感性为94.0％(47/50)。
[0116]
特异性：对50份背景清楚且pcr检测asfv阴性的样品(含6份猪源其他病毒液：csfv、prrsv、prv、pcv2、pedv、tgev及18份脏器组织研磨液上清、23份血清血浆或全血、3份唾液)用试剂盒进行检测，结果均为阴性，特异性为100％(50/50)，表明特异性良好。
[0117]
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。