一种亲和层析填料动态载量的测定方法与流程

1.本发明一种亲和层析填料动态载量的测定方法。


背景技术：

2.根据动态载量进行亲和层析填料的筛选是亲和层析中重要的工艺开发步骤。传统的亲和层析填料筛选是测定动态结合载量，完全按照标准的动态结合载量测定方法，虽然准确性高，但需要考虑不同的保留时间以及上样浓度等因素，这种测定方法的缺点是工艺时间长，材料消耗量大，耗时长，成本高。
3.另外一种亲和填料的筛选是采用高通量技术进行，虽然其可以节约大量的工艺开发时间以及实验样品，并节约工艺开发成本。但是，利用高通量技术测定的亲和填料载量都是静态载量，需要考虑蛋白与亲和填料间的结合动力学行为，是一种对动态载量进行预测的方法，其结果的预测准确性较差。
4.因此，亟待研究一种测定时间短但同时能够有较好预测准确性的方法。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是现有技术中亲和层析填料的动态载量的测定方法存在工艺时间长、材料消耗量大、耗时长、成本高的问题，或者使用了较为复杂的计算公式来计算亲和层析填料的动态载量，处理周期长、效率低，从而提供一种简单明了、效率高、时效性好，而且准确性也很高的亲和层析填料动态载量的方法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种亲和层析填料动态载量的测定方法，其包括如下步骤：
7.1)将样品上样到装填了待筛选的亲和层析填料的层析柱上，收集流穿液，记录上样体积；所述上样体积为紫外吸收值对应的穿透蛋白样品浓度达到样品中目标蛋白的浓度的5％～10％时上样的总体积；所述样品为蛋白溶液；
8.2)根据样品浓度-紫外吸收值标准曲线，根据步骤1)的上样体积，计算所述的亲和层析填料的动态载量。
9.如技术方案中所述，优选地，所述上样体积为紫外吸收值对应的穿透蛋白样品浓度达到样品中目标蛋白的浓度的5％或10％时上样的总体积。
10.如技术方案中所述，所述计算依据的公式可为：
[0011][0012]
其中，q
b,5％
为动态载量；c0为样品中目标蛋白的浓度；va为穿透曲线中目标样品浓度达到5％c0时上样的总体积；vc为总的柱床体积。
[0013]
如技术方案中所述，所述样品浓度-紫外吸收值标准曲线的制定步骤可为常规标准曲线制作步骤，较佳地，包括：
[0014]
1)将样品上样到亲和层析填料层析柱上，在不同的uv280紫外吸收值处收集对应
的流穿液，并检测流穿液中的蛋白浓度；
[0015]
2)以uv280紫外吸收值为x轴，对应的吸附到亲和层析填料上的蛋白浓度为y轴，拟合样品浓度-紫外吸收值标准曲线。
[0016]
如技术方案中所述，优选地，所述亲和层析填料层析柱为amsphere
tm a3层析柱。
[0017]
如技术方案中所述，较佳地，所述uv280紫外吸收值从0-250mau的范围中梯度地选择6-8个点；更佳地，所述uv280紫外吸收值分别为0mau，65mau，85mau，100mau，120mau，160mau和180mau。
[0018]
如技术方案中所述，所述样品浓度-紫外吸收值标准曲线的r2可要求为≥0.95。
[0019]
如技术方案中所述，所述待筛选的亲和层析填料可为本领域中常规的含有蛋白a配基的亲和层析填料，例如，jetted a50、mabseclet prisma、mabseclet sure lx、amsphere
tm a3或mabseclet sure；所述蛋白溶液中的蛋白可为本领域中常规的与亲和层析填料有结合的蛋白，例如单抗、双抗或融合蛋白。
[0020]
如技术方案中所述，为了筛选到合适的亲和层析填料，可以对于多种亲和层析填料，同时分别测定，当有多种待筛选的亲和层析填料时，还可根据计算得到的动态载量，对待筛选的亲和层析填料进行排序，最终获得合适的亲和层析填料。
[0021]
如技术方案中所述，按照本领域常规，一般来讲，亲和层析填料装填料到层析柱后，所述的亲和层析填料用保存液保存，具体在使用前，即在所述上样前，用亲和层析平衡缓冲液置换所述保存液，并平衡所述亲和层析填料，之后再上样蛋白溶液。
[0022]
如技术方案中所述，所述亲和层析平衡缓冲液一般可为包含nacl的磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的浓度优选20mmol/l，所述nacl浓度优选100mmol/l，所述亲和层析平衡缓冲液的ph优选7.3
±
0.2，电导率优选13.0
±
2.0ms/cm。
[0023]
如技术方案中所述，所述保存液一般可包含醋酸盐和苯甲醇；所述醋酸盐浓度优选100mmol/l，所述苯甲醇的浓度优选为2％，百分比为质量百分比，所述保存液的ph优选5.0
±
0.2，电导率优选4.5
±
1.0ms/cm。
[0024]
如技术方案中所述，所述样品中的目标蛋白浓度可为本领域常规的浓度，0.5-5g/l，所述样品的溶液一般为所述亲和层析平衡缓冲液；优选地，所述目标蛋白浓度为2.4g/l。
[0025]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0026]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0027]
本发明的积极进步效果在于：
[0028]
本发明根据亲和层析填料和抗体的亲和结合性质特点，利用亲和填料的样品浓度-紫外吸收值标准曲线的紫外吸收值对应的穿透蛋白样品浓度达到样品中目标蛋白浓度的5％时上样的总体积(5％流穿点)，来计算其它亲和层析填料的动态结合载量，相比现有的标准动态结合载量测定方法，不仅操作方便，模型计算简单，所需时间和成本低(物料成本低)，而且测定结果的准确性更高，能够实现快速的亲和层析填料优劣判定；同时处理20种亲和层析填料分别在层析柱上进行动态载量测定，8小时左右即可获得亲和层析填料的动态载量，不仅简单明了、效率高、时效性好，而且准确性也很高。
附图说明
[0029]
图1是代表性填料样品浓度—紫外吸收值标准曲线。
[0030]
图2是不同亲和层析填料层析图谱叠加全貌。
[0031]
图3是不同亲和层析填料层析图谱叠加细节。
[0032]
图4是jetted a50和mabseclet prisma填料动态结合载量。
具体实施方式
[0033]
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步详细地描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0034]
实施例1
[0035]
本实施例的亲和层析填料动态载量测定方法，首先利用亲和层析填料，拟合样品浓度-紫外吸收值标准曲线，具体地说，包括以下步骤：
[0036]
步骤1)，将亲和层析纯化后的蛋白用亲和层析平衡液稀释到正常发酵液的目标蛋白浓度2.4g/l。
[0037]
步骤2)，制备一根亲和层析填料(amsphere
tm a3)层析柱，用亲和层析平衡缓冲液(20mmol/l磷酸盐+100mmol/l nacl，ph7.3
±
0.2，电导率13.0
±
2.0ms/cm)置换亲和层析填料中的保存液(100mmol/l醋酸盐+2％苯甲醇缓冲液，ph5.0
±
0.2，电导率4.5
±
1.0ms/cm)并平衡亲和层析填料。
[0038]
步骤3)，将步骤1)制备的样品上样到步骤2)装填了亲和层析填料(amsphere
tm a3)的层析柱上，在0mau，65mau，85mau，100mau，120mau，160mau，180mau收集流穿液，并用titer-protein a hplc的方检测流穿液中的蛋白浓度，其结果如表1所示。
[0039]
表1代表性填料样品浓度-紫外吸收值标准曲线数据
[0040]
uv280-280nm紫外吸收样品浓度0mau0g/l65mau0.239g/l85mau0.295g/l100mau0.350g/l120mau0.410g/l160mau0.520g/l180mau0.655g/l
[0041]
步骤4)，以流穿液中的uv280紫外吸收值为x轴，对应的吸附到亲和层析填料上的蛋白浓度为y轴，拟合样品浓度-紫外吸收值标准曲线，其结果如图1所示。
[0042]
步骤5)，根据步骤4)的样品浓度-紫外吸收值标准曲线，确定穿透蛋白样品浓度达到样品中目标蛋白浓度的5％时上样的总体积(5％流穿点)对应的紫外吸收值50mau。
[0043]
步骤6)，制备其它需要筛选的多个不同亲和层析填料(jetted a50，mabseclet prisma，mabseclet sure lx，amsphere
tm a3，mabseclet sure)层析柱，用亲和层析平衡缓冲液(20mmol/l磷酸盐+100mmol/lnacl，ph7.3
±
0.2，电导率13.0
±
2.0ms/cm)
置换亲和层析填料中的保存液(100mmol/l醋酸盐+2％苯甲醇缓冲液，ph 5.0
±
0.2，电导率4.5
±
1.0ms/cm)并平衡亲和层析填料。
[0044]
步骤7)，将步骤1)制备的样品上样到步骤6)分别装填了亲和层析填料(jetted a50，mabseclet prisma，mabseclet sure，mabseclet sure lx，amsphere
tm a3)的层析柱上，不同亲和层析填料层析图谱叠加全貌和叠加细节分别如图2和图3所示，收集流穿液，记录步骤5)5％流穿点的紫外吸收值(50mau)对应的上样体积，如表2所示。
[0045]
步骤8)，根据步骤4)中拟合的样品浓度-紫外吸收值标准曲线y＝0.0035x+0.0021，使用公式：
[0046][0047]
计算步骤7)中上样体积对应的亲和层析填料的动态载量q
b,5％
，其中，c0为样品中目标蛋白的浓度(concentration of target solute in feed)，va为穿透曲线中目标样品浓度达到5％c0时上样的总体积(volume applied until the conc.of target solute in effluent has reached 5％of c0)，vc为总的柱床体积(total bed volume)。
[0048]
结果如表2所示，并进行优先排序：jetted a50》mabseclet prisma》mabseclet sure lx》amsphere
tm a3》mabseclet sure。
[0049]
表2不同亲和填料动态结合载量计算数据
[0050][0051]
效果实施例1
[0052]
用传统方法测定动态载量的实际值，以验证上述预测得到的动态载量值的准确性，方法如下：装填15ml的jetted a50和mabseclet prisma亲和填料的实验室规格的层析柱，采用保留时间5min、上样蛋白浓度为2.4g/l的发酵液，检测流穿液中蛋白的浓度，计算当流穿液中蛋白浓度为上样蛋白浓度的10％时，亲和填料的载量(上样蛋白的浓度乘以当流穿液中蛋白浓度为上样蛋白浓度的10％时上样蛋白的体积，再除以该层析柱中装填填料的体积)，得到的动态结合载量分别为73g/l和70g/l填料，结果如图4和表3所示，与实施例1jetted a50和mabseclet prisma的动态载量数值相吻合。说明本发明的亲和层析填料动态载量的测定方法准确性高。
[0053]
表3jetted a50和mabseclet prism填料动态结合载量测试结果
[0054]