一种的制作方法

一种
ɑ-l-岩藻糖苷酶检测试剂盒及方法
技术领域
1.本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种
ɑ-l-岩藻糖苷酶检测试剂盒及方法，本发明用于体外定量检测人血清中
ɑ-l-岩藻糖苷酶(afu)的活性。


背景技术：

2.通过
ɑ-l-岩藻糖苷酶检测试剂盒体外定量检测人血清中
ɑ-l-岩藻糖苷酶(afu)的活性的相关技术已经出现。其主要用于对恶性肿瘤患者进行动态监测以辅助判断疾病进程或治疗效果，不能作为恶性肿瘤早期诊断或确诊的依据，不用于普通人群的肿瘤筛查。
3.afu检测方法主要有荧光法和比色法。这种技术的检测原理在于，
ɑ-l-岩藻糖苷酶(afu)是一种酸性水解酶，广泛分布在人体内的各个组织、细胞和体液中。在酸性缓冲环境下，2-氯-4硝基苯-ɑ-l-岩藻糖苷在样本中的
ɑ-l-岩藻糖苷酶作用下水解产生2-氯-4硝基苯和
ɑ-l-岩藻糖苷。测定405nm波长下2-氯-4硝基苯(cnp)每分钟的吸光度变化值，与样本中
ɑ-l-岩藻糖苷酶的活性成正比。从而计算出
ɑ-l-岩藻糖苷酶的活性。
4.即在具体的测试流程中，需要观察数个分钟时间段内的吸光度变化值，然而，当长时间地保持测试样本在仪器内放置的时候，由于溶解度和沉降的问题，会造成一些沉淀物或者轻微分层现象的产生，并且随着时间的延长这种问题会逐渐加重，因此当时间延长之后，后面测量的数据由于溶液的不均匀性而造成数据有一定的失真。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的是提供一种能够对于样本内液体的分数均匀性进行保障。
6.为了完成上述目的，本发明提供了一种
ɑ-l-岩藻糖苷酶检测试剂盒，其包括pbs缓冲液、2-氯-4硝基-ɑ-l-岩藻糖苷和聚酰亚胺纳米微球。
7.本发明的有益效果为：通过引入聚酰亚胺纳米微球，其在溶液中具有良好分散性，并且聚酰亚胺纳米微球能够很好地把待测样品中的
ɑ-l-岩藻糖苷酶进行吸附附着，从而保持样品中的
ɑ-l-岩藻糖苷酶在检测过程中始终以很好地分散状态而分布在溶液中，这样就使得检测结果更为准确，避免了长时间的放置或者检测样品发生的沉淀、团聚等物体，并且通过纳米微球对于酶的吸附和分散性而保持酶在溶液中与底物的持续反应。
8.一个优选的方案是，所述pbs缓冲液的ph值为5.4，pbs缓冲液的浓度为≥0.1mol/l,且pbs缓冲液的浓度小于0.2mol/l；所述2-氯-4硝基-ɑ-l-岩藻糖苷的浓度为≥0.5g/l，且所述2-氯-4硝基-ɑ-l-岩藻糖苷的浓度为小于1.0g/l。
9.一个优选的方案是，所述聚酰亚胺纳米微球的重量与2-氯-4硝基-ɑ-l-岩藻糖苷的重量比为1：10至1:20。
10.一个优选的方案是，所述聚酰亚胺纳米微球的粒径在50纳米至120纳米。
11.一个优选的方案是，所述试剂盒还包括校准品试剂和质控品试剂，所述校准品试剂和质控品试剂均为合成的
ɑ-l-岩藻糖苷酶。
12.本发明提供的
ɑ-l-岩藻糖苷酶检测试剂盒的测试方法，其特征在于，包括下面的
步骤：在酸性缓冲环境下，2-氯-4硝基苯-ɑ-l-岩藻糖苷在待检测样本中的
ɑ-l-岩藻糖苷酶作用下水解产生2-氯-4硝基苯和
ɑ-l-岩藻糖苷，同时所述聚酰亚胺纳米微球负载吸附
ɑ-l-岩藻糖苷酶以使得反应溶液均一；
13.测定405nm波长下2-氯-4硝基苯每分钟的吸光度变化值，与样本中
ɑ-l-岩藻糖苷酶的活性成正比；从而计算出
ɑ-l-岩藻糖苷酶的活性。
附图说明
14.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
15.图1是本发明的
ɑ-l-岩藻糖苷酶检测试剂盒的测试过程中的参数图标；
16.图2是本发明的
ɑ-l-岩藻糖苷酶检测试剂盒的测试过程中的时间轴图；
17.图3是本发明的测试结果计算示意图。
具体实施方式
18.下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
19.本发明提供了一种
ɑ-l-岩藻糖苷酶检测试剂盒，其包括pbs缓冲液、2-氯-4硝基-ɑ-l-岩藻糖苷和聚酰亚胺纳米微球。所述聚酰亚胺纳米微球的重量与2-氯-4硝基-ɑ-l-岩藻糖苷的重量比为1：10至1:20。所述聚酰亚胺纳米微球的粒径在50纳米至120纳米。聚酰亚胺纳米微球采用现有的纳米微球的制造方法得到，这里不再赘述。
20.通过引入聚酰亚胺纳米微球，其在溶液中具有良好分散性，并且聚酰亚胺纳米微球能够很好地把待测样品中的
ɑ-l-岩藻糖苷酶进行吸附附着，从而保持样品中的
ɑ-l-岩藻糖苷酶在检测过程中始终以很好地分散状态而分布在溶液中，这样就使得检测结果更为准确，避免了长时间的放置或者检测样品发生的沉淀、团聚等物体，并且通过纳米微球对于酶的吸附和分散性而保持酶在溶液中与底物的持续反应。
21.所述pbs缓冲液的ph值为5.4，pbs缓冲液的浓度为≥0.1mol/l,且pbs缓冲液的浓度小于0.2mol/l；所述2-氯-4硝基-ɑ-l-岩藻糖苷的浓度为≥0.5g/l，且所述2-氯-4硝基-ɑ-l-岩藻糖苷的浓度为小于1.0g/l。
22.所述试剂盒还包括校准品试剂和质控品试剂，所述校准品试剂和质控品试剂均为合成的
ɑ-l-岩藻糖苷酶。
23.本发明提供的
ɑ-l-岩藻糖苷酶检测试剂盒的测试方法，其包括下面的步骤：在酸性缓冲环境下，2-氯-4硝基苯-ɑ-l-岩藻糖苷在待检测样本中的
ɑ-l-岩藻糖苷酶作用下水解产生2-氯-4硝基苯和
ɑ-l-岩藻糖苷，同时所述聚酰亚胺纳米微球负载吸附
ɑ-l-岩藻糖苷酶以使得反应溶液均一；
24.测定405nm波长下2-氯-4硝基苯每分钟的吸光度变化值，与样本中
ɑ-l-岩藻糖苷酶的活性成正比；从而计算出
ɑ-l-岩藻糖苷酶的活性。
25.试剂盒的规格为50ml/盒(1
×
50ml、2
×
25ml)、100ml/盒(1
×
100ml、2
×
50ml、4
×
25ml)、200ml/盒(2
×
100ml、4
×
50ml、5
×
40ml、8
×
25ml)、300ml/盒(3
×
100ml、5
×
60ml、6
×
50ml、8
×
37.5ml)、300测试/盒、600测试/盒、900测试/盒。
26.校准品(选配)：1
×
0.5ml；质控品(选配)：水平1:1
×
0.5ml，水平2:1
×
0.5ml。
27.检测原理为：
ɑ-l-岩藻糖苷酶(afu)是一种酸性水解酶，广泛分布在人体内的各个组织、细胞和体液中。在酸性缓冲环境下，2-氯-4硝基苯-ɑ-l-岩藻糖苷在样本中的
ɑ-l-岩藻糖苷酶作用下水解产生2-氯-4硝基苯和
ɑ-l-岩藻糖苷。测定405nm波长下2-氯-4硝基苯(cnp)每分钟的吸光度变化值，与样本中
ɑ-l-岩藻糖苷酶的活性成正比。从而计算出
ɑ-l-岩藻糖苷酶的活性。
28.试剂盒的储存条件及有效期：
29.1.试剂在2～8℃密封避光保存可稳定至有效期，有效期一年，开瓶后2～8℃保存1个月，不得冻融。
30.2.校准品，质控品在2～8℃密封避光保存可稳定至有效期，有效期一年，开瓶后2～8℃保存1个月。
31.适用仪器为：
32.本试剂盒适用日立7180、日立7600、日立008as、贝克曼au2700、贝克曼au480、贝克曼au680、贝克曼au5800系列、西门子advia1800、西门子advia2400、西门子adviaxpt、罗氏cobas c501、雅培c16000、东芝tba120、东芝tba2000、东芝tba fx8、迈瑞bs480、迈瑞bs680、迈瑞bs800、迈瑞bs2000、迪瑞cs480、迪瑞cs680、迪瑞cs1200、东软威特曼nt480、东软威特曼nt480p、东软威特曼nt1000、东软威特曼nt1000p、颐兰贝es480。
33.待测试的样本要求：血清，空腹采血。2～8℃保存，可稳定7天，不可使用已被污染的样本。
34.测试方法为：
35.1、速率法；
36.2、自动分析基本参数，具体参考图1和图2；
37.3、校准程序
38.3.1采用配套校准品定标。
39.3.2校准程序的要求见所使用分析仪器的说明书。
40.3.3校准及校准频次的要求：
41.a.校准模式：两点线性；
42.b.校准频次：正常情况下，应每月进行一次校准。当发生下列情况时，如：使用的试剂批号发生改变；使用的仪器进行维修、保养或更换光学系统关键部件后；质控品的测定结果发生漂移或超出规定的范围等，建议进行重新校准。
43.4、质量控制程序
44.推荐使用本公司选配的质控品。各实验室须建立室内质控方案及程序，质控测定值应在标示值范围内，一旦质控结果不在容许范围内需进行校正。
45.5、结果计算(u/l)，具体参见图3的公式。
46.参考区间：
47.正常参考范围：＜40u/l。
48.以正常人95％的百分界限确定参考值范围。
49.引用的参考范围代表本法的期望值，仅供参考。建议各实验室验证这一参考范围
或建立自己的参考值范围。
50.检验结果的解释：
51.专业人员负责检验结果的审核，检验结果的分析，受年龄、性别、饮食、地域影响，通常在参考范围内认为正常，如超出范围，应重新测定进行确认，检验结果如出现与临床不符甚至相悖的情况，应分析查找原因。
52.检验方法的局限性：
53.胆红素≤342μmol/l，血红蛋白≤2g/l，抗坏血酸≤170μmol/l，甘油三酯≤37mmol/l时不会对该实验产生干扰(相对偏差不超过
±
10％)。
54.产品性能指标：
55.1、试剂空白：试剂空白吸光度应≤0.3
56.2、试剂空白吸光度变化率：试剂空白吸光度变化率δa/min≤0.002
57.3、分析灵敏度：测试30u/l样本时，吸光度变化率(δa/min)≥0.005
58.4、线性：[5，200]u/l，r≥0.990
[0059]
在[5，50]u/l范围内，线性绝对偏差≤
±
5u/l
[0060]
在[50，200]u/l范围内，线性相对偏差≤
±
10％
[0061]
5、测量精密度：重复性变异系数(cv)≤5％，批间差：相对极差(r)≤10％
[0062]
6、准确度：对于具有溯源性的企业参考品进行检测，相对偏差应不超过
±
10％
[0063]
7、校准品：准确度相对偏差≤10％，均一性(cv)≤10％
[0064]
8、质控品：准确度检测结果在标示值范围内，均一性(cv)≤10％。
[0065]
在其它的实施例中，聚酰亚胺纳米微球可以作为另外一种单独的试剂，即在试剂盒对于样品测试之前再把临时配制或者配制好的分散性良好的聚酰亚胺纳米微球溶液加入到具有pbs缓冲液和2-氯-4硝基-ɑ-l-岩藻糖苷的试剂盒中，这样就能够更好地体现出稳定分散性。另外，聚酰亚胺的存在会使得吸光度增强，而在计算吸光度的时候可以将聚酰亚胺增加的部分减去，并且根据聚酰亚胺的浓度变化会使得吸光度增加程度不同，而在一些情况下，当灵敏度不足的时候，则可以通过聚酰亚胺加入而提高检测灵敏度，即更容易测量到吸光度的光谱信号。
[0066]
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。