斑蝥素乳膏中斑蝥素的检测方法与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及斑蝥素乳膏中斑蝥素的检测方法。


背景技术：

2.斑蝥素乳膏为抗病毒药，其中的主要成分是斑蝥素，是中药斑蝥的主要提取物经提炼制成的乳膏，主要应用于尖锐湿疣的治疗。
3.目前，对斑蝥素乳膏中有效成分的检测方法主要包括气相色谱法、薄层色谱发或见见滴定法等。但上述方法普遍存在准确性不高、精密度不足的缺陷。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供斑蝥素乳膏中斑蝥素的检测方法。
5.本发明提供的斑蝥乳膏中斑蝥素的检测方法，其将斑蝥乳膏经前处理获得上样液，将所述上样液浓缩后进行气相色谱检测；
6.所述气相色谱检测的条件包括：
7.色谱柱：agilent db-1毛细管气相色谱柱；
8.升温程序：初始温度为175℃保持19min，再以30℃/min速率升温至320℃保持30min。
9.本发明中，所述前处理包括：
10.将斑蝥乳膏加入氯化钠-氢氧化钠溶液60～90℃加热3～5min后，冰水浴5～10min，离心取下层溶液，重复4次合并下层溶液获得提取液；
11.将所述提取液与盐酸混合后以氯仿提取3次，氯仿部分经浓缩后，以乙酸乙酯定容，获得上样液。
12.本发明中，所述氯化钠-氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度为120g/l，氯化钠的浓度为20g/l。一些实施例中，每4g斑蝥乳膏加入8ml氯化钠-氢氧化钠溶液。一些实施例中，将斑蝥乳膏加入氯化钠-氢氧化钠溶液60℃加热5min后，冰水冷却10min，离心取下层溶液，重复3次合并下层溶液获得提取液。一些实施例中，离心的条件包括4000r/min，离心5min。
13.本发明中，所述提取液与盐酸的体积比为25:15。一些实施例中，盐酸为浓度为36％-38％的浓盐酸水溶液。加入盐酸后摇匀，然后静置3min。
14.本发明中，所述氯仿提取3次的过程中，提取液和浓盐酸混和后的溶液体积与加入的氯仿的体积比依次为40:30、40:20、40:20。即(提取液+浓盐酸)：氯仿的体积比为40：(20～30)。
15.一些实施例中，所述氯仿萃取的条件包括：震摇3次每次20s，共60s，静止10min。一些实施例中，所述浓缩采用旋转蒸发的方式，条件包括50℃，100r/min。浓缩至体积为原体积的5/70。
16.本发明中，所述上样液的上样量为2μl。
17.本发明中，所述色谱柱规格为30m
×
320μm，1μm。
18.本发明中，所述气相色谱的载气为氮气；载气流量为：1ml/min；不分流进样。
19.本发明中，所述气相色谱的进样口参数还包括：进样口温度：250℃；压力：112.6psi；隔垫吹扫流量：3ml/min；侦测器fid：350℃；空气：400ml/min；氢气：30ml/min；尾吹气：25ml/min。
20.本发明提供的斑蝥素乳膏中斑蝥素的检测方法包括将斑蝥素乳膏经前处理获得上样液，将所述提取液浓缩后进行气相色谱检测；通过对前处理条件和检测条件的改善，该方法具有良好的系统适用性、专属性、线性、准确度、精密度(重复性、中间精密度)、范围、溶液稳定性、耐用性试验。
附图说明
21.图1示稀释剂检测色谱图；
22.图2示空白辅料检测色谱图；
23.图3示对照品图谱检测色谱图；
24.图4示供试品检测色谱图。
具体实施方式
25.本发明提供了斑蝥素乳膏中斑蝥素的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
26.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
27.其中，斑蝥素对照品来自中检院，批号110783-201105，含量98.6％。
28.斑蝥素乳膏来自海南回元堂药业有限公司；批号为200801，或来自于海南碧凯药物研究所有限公司的自制制剂，其批号为21081001、21081201。斑蝥素乳膏成品约重4g，因此每支含斑蝥素约1.0mg；空白乳膏约4g
29.本发明提供的斑蝥素乳膏中斑蝥素的检测方法，其将斑蝥素乳膏经前处理获得上样液，将所述提取液浓缩后进行气相色谱检测；
30.所述气相色谱检测的条件包括：
31.色谱柱：agilent db-1毛细管气相色谱柱；
32.升温程序：初始温度为175℃保持19min，再以30℃/min速率升温至320℃保持30min。
33.研究表明，空白溶剂和空白辅料溶液无干扰，已排除杂质峰干扰。主峰无干扰峰，因此具有良好的专属性。
34.拖尾因子为0.7，理论塔板数为13275，对照品溶液std-1的5针主成份峰面积rsd为0.52％。对照品溶液std-1对对照品溶液std-2的相对百分比为100.4％。说明该方法具有良好的系统适用性。
35.线性结果为r2≥0.996。y轴截距为1.6％，在100％目标浓度响应值可接受标准的2.0％以内，均符合规定。
36.斑蝥素乳膏主药的水平80％、100％、120％，其回收率92％-98％之间(三个水平，每个水平平行三配制，n＝9，rsd为2.4％)；主药的水平70％、130％，其回收率在100％-108％之间(两个水平，每个水平平行三配制，n＝6，rsd为2.4％)。主药的水平从70％到130％回收率均符合可接受标准，说明本发明提供的方法具有良好的准确性。
37.连续重复测定6次，斑蝥素乳膏含量rsd(n＝6)为1.57％。中间精密度不同分析人员，第一个分析人员重复测定3次，第二个分析人员重复测定6次，斑蝥素乳膏含量rsd(n＝6+3＝9)为1.38％。说明本发明提供的方法具有良好的精密度。
38.按照相关要求，对照品溶液：室温放置后的溶液中斑蝥素峰面积与0h时斑蝥素峰面积的比值在98.0％-102.0％，即认为溶液稳定。供试品溶液：室温放置后的溶液中斑蝥素峰面积与0h时斑蝥素峰面积的比值在98.0％-102.0％，即认为溶液稳定。经检测，本发明中对照品储备液在避光，稳定62小时。供试品溶液在避光，稳定24小时。
39.按照相关要求，每个改变的条件下与标准条件相比，测得的含量差值≤2.0％。而在本发明目前已做的耐用性条件为斑蝥素乳膏提取温度60℃、70℃、80℃，其中60℃为优选温度。毛细管色谱柱起始温度(柱温)为160℃、170℃、175℃、180℃，其中175℃为优选温度。气相进样口温度为200℃、210℃、250℃，其中250℃为优选温度。
40.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
41.实施例1
42.一、溶液配制
43.1.1稀释液的配制
44.氯化钠-氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠12g和氯化钠2g于烧杯中，加入100ml纯化水搅拌使其溶解。
45.稀释剂:乙酸乙酯。
46.1.2对照品溶液的配制
47.对照品溶液：称取10mg的斑蝥素至容量瓶中，并用乙酸乙酯定容至刻度配制成50μg/ml对照品溶液，平行两个配制即可。
48.1.3供试品溶液的配制
49.供试品溶液：精密称取斑蝥素乳膏4g，置于15ml离心管中作为样品1、2、3分别加入氯化钠-氢氧化钠溶液8ml，置于60℃水浴加热5min，边加热边涡旋使其溶解，再冰水浴10min，用15ml离心管离心5min(4000r/min)。取下清液置于50ml容量瓶中，剩余乳膏同法提取共4次。将下清液并入瓶中，用氯化钠-氢氧化钠溶液定容至刻度线，再精密量移取定容好的液体25ml置于分液漏斗中，用加入盐酸15ml摇匀，静止大约3min至不发热后，再加入氯仿提取3次，每次加入量分别为30、20、20ml，提取液用旋转蒸发仪(50℃，100r/min)浓缩至大约5ml，再转移至10ml容量瓶中，乙酸乙酯定容即可。
50.二、分析方法
51.表1色谱系统和参数
52.气相色谱仪7890b色谱柱agilent db-1，30m
×
320μm
×
1μm进样口温度(℃)250柱温(℃)见下表
流速(ml/min)1.0进样量(ul)2fid侦测器温度(℃)350运行时间(min)54.8分流比不分流分流衬管体积870μl，内径4mm，安捷伦(定货号：5910-2295)隔垫吹扫流量(ml/min)3.0
53.柱温箱温度及运行程序：初始温度为175℃保持19min，再以30℃/min速率升温至320℃保持30min。
54.三、计算方法：含量计算公式
[0055][0056]
其中：w
std
：斑蝥素对照品称样量，mg；
[0057]
wsam：斑蝥素供试品称样量，mg；
[0058]astd
：对照品溶液std-1中斑蝥素主峰平均峰面积；
[0059]vstd
：对照品溶液std-1的稀释倍数；
[0060]asam
：供试品溶液中斑蝥素主峰峰面积；
[0061]vsam
：供试品溶液的稀释倍数；
[0062]
p:对照品的含量；
[0063]
b:斑蝥素乳膏规格，0.25mg/g。
[0064]
对上述方法的系统适用性、专属性、线性与范围、准确度、精密度、溶液稳定性、耐用性进行考察。
[0065]
结果如下：
[0066]
1)、系统适用性
[0067]
表2系统适用性结果
[0068][0069]
结论：斑蝥素峰的分离度均大于1.5；各峰理论塔板数均大于3000；斑蝥素的5组数据峰面积rsd％为0.52％。
[0070]
2)、专属性
[0071]
结果如图1～4，色谱图中，空白溶剂对对照品峰无干扰；斑蝥素峰与相邻峰的分离度均大于1.5；
[0072]
3)、线性与范围
[0073]
线性与范围结果
[0074]
表3系统适用性结果
[0075][0076]
结果表明，本发明提供的方法线性相关系数满足r2≥0.998，y轴截距在100％目标浓度响应值的2％以内。
[0077]
4)、准确度
[0078]
表4 80％-120％回收率结果表
[0079][0080]
结果表明：80％～120％的斑蝥素回收率的9组数据rsd符合rsd≤3％
[0081]
表5 70％、130％回收率结果表
[0082][0083]
结果表明：70％～130％的斑蝥素回收率的6组数据rsd符合rsd≤3％
[0084]
5)、精密度
[0085]
表6精密度试验结果
[0086][0087]
结果表明：重复性：6份数据斑蝥素rsd为1.57％；中间精密度：9份数据斑蝥素rsd分别为1.38％
[0088]
6)溶液稳定性
[0089]
表7溶液稳定性试验结果
[0090][0091]
结果表明：对照品储备液在避光，稳定62小时。供试品溶液在避光，稳定24小时。
[0092]
7)、耐用性
[0093]
表8耐用性试验结果
[0094][0095]
结果表明：目前已做的耐用性条件为改变斑蝥素乳膏提取温度80℃、70℃、60℃，
其中60℃为优选温度。
[0096]
表9进样口温度对结果的影响
[0097]
进样口温度结果评估200℃斑蝥素的出峰位置较不适当。210℃斑蝥素的出峰位置较不适当。250℃斑蝥素的出峰位置较适当，而且可以排除杂质峰干扰。
[0098]
结果表明：目前已做的耐用性条件为改变气相分析条件的进样口温度200℃、210℃、250℃，其中250℃为优选的进样口温度。
[0099]
表10毛细管色谱柱起始温度对效果影响
[0100][0101]
结果表明：目前已做的耐用性条件为改变斑蝥素乳膏气相分析条件的毛细管色谱柱起始温度(柱温)160℃、170℃、175℃、180℃，其中175℃为优选的柱温。
[0102]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。