一种基于ELISA双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒的制作方法

一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒
技术领域
1.本发明涉及细胞种属鉴定领域，尤其涉及一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒。


背景技术：

2.目前进行细胞种属鉴定主要使用pcr方法，利用物种特异性引物进行鉴定，基于pcr方法又主要分为常规pcr与荧光定量pcr，二者均需要设计多对引物进行pcr，实验操作较为复杂；其中常规法需要使用具有致癌性的eb进行产物染色，荧光定量pcr需要用到荧光引物及荧光定量pcr仪，其成本较高，因此急需一种方法简单，成本较低的细胞种属鉴定试剂盒。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明提出了一种方法简单，成本较低的细胞种属鉴定的双抗夹心elisa检测试剂盒。
4.本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒，包括包被内参通用抗体a的酶标板、酶标板稳定液、细胞裂解液、生物素标记的物种特异性抗体b、hrp-链霉亲和素、pbs缓冲液、稀释液和tmb显色液。
5.在以上技术方案的基础上，优选的，所述内参通用抗体a制备方法：选择内参蛋白beta-actin或gapdh不同物种的通用片段合成相应多肽，并偶联bsa或klh后免疫小鼠，然后制备小鼠抗体得到内参通用抗体a，用稀释液稀释备用。
6.在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶标板的包被包括如下步骤：
7.s1，包被，将2-5μg/ml的内参通用抗体a溶液按照100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；
8.s2，洗板，步骤s1包被的酶标板按照200μl/孔加入洗液，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；
9.s3，封闭，步骤s2甩干的酶标板按照200μl/孔加入封闭液封闭，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；
10.s4，稳定，封闭处理后的酶标板按照200μl/孔加入酶标板稳定液，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液。
11.在以上技术方案的基础上，优选的，所述生物素标记的特异性抗体b制备方法为：选择内参蛋白beta-actin或gapdh不同物种的特异性片段合成相应多肽，并偶联bsa或klh后免疫小鼠，然后制备小鼠抗体并用生物素标记得到生物素标记的特异性抗体b，用稀释液稀释至2-20μg/ml备用。
12.在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶标板稳定液由如下质量分数的各组分组成：0.2-2％的海藻糖，0.01-0.1％的聚山梨酯，0.8％氯化钠，0.1-1％冰乙酸和0.01-0.1％叠氮化钠，溶剂为去离子水。
13.在以上技术方案的基础上，优选的，所述细胞裂解液由质量分数为0.2-2％的np40，终浓度为10-100mmol/l的tris-hcl，质量分数为0.8％的氯化钠，终浓度为0.05-0.5mmol/l的pmsf，终浓度为0.2-2mmol/l的胃蛋白酶抑制剂，终浓度为0.2-2mmol/l的亮抑制肽和终浓度为0.2-2mmol/l的抑蛋白酶肽组成，溶剂为去离子水。
14.在以上技术方案的基础上，优选的，所述稀释液由如下质量分数的各组分组成：0.1-1％的ova，0.8％的氯化钠，0.1-1％的冰乙酸，0.01-0.1％的叠氮化钠，0.02％的氯化钾，0.144％的磷酸氢二钠和0.024％的磷酸二氢钾，溶剂为去离子水。
15.本发明还提供了一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
16.s1，裂解，取2
×
106个细胞，加入200-500μl细胞裂解液裂解细胞，并用pbs缓冲液稀释备用；
17.s2，加样，取包被内参通用抗体a的酶标板，按照50-100μl/孔加入步骤s1裂解后的细胞溶液，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；
18.s3，加酶标抗体，步骤s2吸干洗液后的酶标板按照100μl/孔加入生物素标记的物种特异性抗体b，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；按照100μl/孔加入hrp-链霉亲和素，37℃孵育30-40min，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；
19.s4，tmb显色，加入tmb显色液，每孔90μl，37℃避光显色5-10min；
20.s5，观察各孔反应液的颜色确定细胞种属，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
21.在以上技术方案的基础上，优选的，所述样本选自人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡中的一种或多种的组合。
22.本发明的一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：
23.(1)本发明的一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒，主要原理是将物种通用内参抗体a包被在酶标板上，然后加入处理后的细胞裂解液，在不同孔内加入生物素标记的各物种特异性抗体b，最后加入hrp-链霉亲和素复合物，最终通过tmb显色判断具体种属,具有操作简单，检测时间较短，反应灵敏，不需要特殊仪器，不含有害物质的种属鉴定方法。
24.(2)本发明的样本不限于人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡物种，可根据需要增加或减少物种；也不限于细胞样本，也可以检测组织样本。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为本发明的实施例的检测结果图。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
28.内参通用抗体a的制备方法：
29.s1，根据相应ncbi信息，分别选择内参蛋白beta-actin或gapdh不同物种(人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡)通用片段/特异性片段，合成相应多肽，并偶联bsa或klh后免疫小鼠；
30.s2，小鼠血清效价检测达1:20000以上时，取小鼠脾脏与sp2/0通过peg方法进行融合，获得相应杂交瘤细胞；
31.s3，对杂交瘤细胞上清进行筛选，选择阳性杂交瘤细胞；
32.s4，阳性杂交瘤细胞注射小鼠腹腔形成腹水，取腹水离心后获得上清；
33.s5，腹水上清经proteina/g纯化，获得内参蛋白物种通用抗体a/特异性抗体b。
34.实施例1
35.一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒，包括包被内参通用抗体a的酶标板、酶标板稳定液、细胞裂解液、生物素标记的物种特异性抗体b、hrp-链霉亲和素、pbs缓冲液、稀释液、洗液和tmb显色液。
36.内参通用抗体a制备方法：选择内参蛋白beta-actin不同物种(人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡)的通用片段合成相应多肽，并偶联bsa后免疫小鼠，然后制备小鼠抗体得到内参通用抗体a，用稀释液稀释备用。
37.生物素标记的特异性抗体b制备方法为：选择内参蛋白beta-actin不同物种(人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡)的特异性片段合成相应多肽，并偶联bsa后免疫小鼠，然后制备小鼠抗体并用生物素标记得到生物素标记的特异性抗体b，用稀释液稀释至2μg/ml备用。
38.酶标板稳定液由如下质量分数的各组分组成：0.2％的海藻糖，0.01％的聚山梨酯，0.8％氯化钠，0.1％冰乙酸和0.01％叠氮化钠，溶剂为去离子水。
39.细胞裂解液由质量分数为0.2％的np40，终浓度为10mmol/l的tris-hcl，质量分数为0.8％的氯化钠，终浓度为0.05mmol/l的pmsf，终浓度为0.2mmol/l的胃蛋白酶抑制剂，终浓度为0.2mmol/l的亮抑制肽和终浓度为0.2mmol/l的抑蛋白酶肽组成，溶剂为去离子水。
40.稀释液由如下质量分数的各组分组成：0.1％的ova，0.8％的氯化钠，0.1％的冰乙酸，0.01％的叠氮化钠，0.02％的氯化钾，0.144％的磷酸氢二钠和0.024％的磷酸二氢钾，溶剂为去离子水。
41.洗液由如下质量分数的各组分组成：20％的氯化钠，0.5％的氯化钾，3.6％的磷酸氢二钠，0.6％的磷酸二氢钾，溶剂为去离子水。用纯水按1:25稀释后使用。
42.tmb显色液：武汉菲恩生物tmb单组分显色液，货号：e024。
43.一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
44.s1，包被，将2μg/ml的内参通用抗体a溶液按照100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；
45.s2，洗板，步骤s1包被的酶标板按照200μl/孔加入洗液，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；
46.s3，封闭，步骤s2甩干的酶标板按照200μl/孔加入封闭液封闭，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；封闭液制备：将5g drymilk溶解于100ml稀释液中制得；
47.s4，稳定，封闭处理后的酶标板按照200μl/孔加入酶标板稳定液，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；
48.s5，裂解，取2
×
106个人、大鼠、小鼠、仓鼠和猪的细胞，分别加入200μl细胞裂解液裂解细胞，并用pbs缓冲液稀释备用；
49.s6，加样，取步骤s4的酶标板，按照50μl/孔加入步骤s5裂解后的细胞溶液，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；
50.s7，加酶标抗体，步骤s2吸干洗液后的酶标板按照100μl/孔加入生物素标记的物种特异性抗体b，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；按照100μl/孔加入hrp-链霉亲和素，37℃孵育30min，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；
51.s8，tmb显色，加入tmb显色液，每孔90μl，37℃避光显色5min；
52.s9，观察各孔反应液的颜色确定细胞种属，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
53.实施例2
54.一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒，包括包被内参通用抗体a的酶标板、酶标板稳定液、细胞裂解液、生物素标记的物种特异性抗体b、hrp-链霉亲和素、pbs缓冲液、稀释液、洗液和tmb显色液。
55.内参通用抗体a制备方法：选择内参蛋白gapdh不同物种(人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡)的通用片段合成相应多肽，并偶联klh后免疫小鼠，然后制备小鼠抗体得到内参通用抗体a，用稀释液稀释备用。
56.生物素标记的特异性抗体b制备方法为：选择内参蛋白gapdh不同物种(人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡)的特异性片段合成相应多肽，并偶联klh后免疫小鼠，然后制备小鼠抗体并用生物素标记得到生物素标记的特异性抗体b，用稀释液稀释至20μg/ml备用。
57.酶标板稳定液由如下质量分数的各组分组成：2％的海藻糖，0.1％的聚山梨酯，0.8％氯化钠，1％冰乙酸和0.1％叠氮化钠，溶剂为去离子水。
58.细胞裂解液由质量分数为2％的np40，终浓度为100mmol/l的tris-hcl，质量分数为0.8％的氯化钠，终浓度为0.5mmol/l的pmsf，终浓度为2mmol/l的胃蛋白酶抑制剂，终浓度为2mmol/l的亮抑制肽和终浓度为2mmol/l的抑蛋白酶肽组成，溶剂为去离子水。
59.稀释液由如下质量分数的各组分组成：1％的ova，0.8％的氯化钠，1％的冰乙酸，0.1％的叠氮化钠，0.02％的氯化钾，0.144％的磷酸氢二钠和0.024％的磷酸二氢钾，溶剂为去离子水。
60.洗液由如下质量分数的各组分组成：20％的氯化钠，0.5％的氯化钾，3.6％的磷酸氢二钠，0.6％的磷酸二氢钾，溶剂为去离子水。用纯水按1:25稀释后使用。
61.tmb显色液：武汉菲恩生物tmb单组分显色液，货号：e024。
62.一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
63.s1，包被，将5μg/ml的内参通用抗体a溶液按照100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；
64.s2，洗板，步骤s1包被的酶标板按照200μl/孔加入洗液，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；
65.s3，封闭，步骤s2甩干的酶标板按照200μl/孔加入封闭液封闭，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；封闭液制备：将5g drymilk溶解于100ml稀释液中制得；
66.s4，稳定，封闭处理后的酶标板按照200μl/孔加入酶标板稳定液，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；
67.s5，裂解，取2
×
106个人、大鼠、小鼠、仓鼠和猪的细胞，分别加入500μl细胞裂解液裂解细胞，并用pbs缓冲液稀释备用；
68.s6，加样，取步骤s4的酶标板，按照100μl/孔加入步骤s5裂解后的细胞溶液，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；
69.s7，加酶标抗体，步骤s2吸干洗液后的酶标板按照100μl/孔加入生物素标记的物种特异性抗体b，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；按照100μl/孔加入hrp-链霉亲和素，37℃孵育30-40min，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；
70.s8，tmb显色，加入tmb显色液，每孔90μl，37℃避光显色10min；
71.s9，观察各孔反应液的颜色确定细胞种属，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
72.实施例3
73.一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒，包括包被内参通用抗体a的酶标板、酶标板稳定液、细胞裂解液、生物素标记的物种特异性抗体b、hrp-链霉亲和素、pbs缓冲液、稀释液、洗液和tmb显色液。
74.内参通用抗体a制备方法：选择内参蛋白gapdh不同物种(人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡)的通用片段合成相应多肽，并偶联bsa后免疫小鼠，然后制备小鼠抗体得到内参通用抗体a，用稀释液稀释备用。
75.生物素标记的特异性抗体b制备方法为：选择内参蛋白gapdh不同物种(人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡)的特异性片段合成相应多肽，并偶联klh后免疫小鼠，然后制备小鼠抗体并用生物素标记得到生物素标记的特异性抗体b，用稀释液稀释至10μg/ml备用。
76.酶标板稳定液由如下质量分数的各组分组成：1％的海藻糖，0.05％的聚山梨酯，0.8％氯化钠，0.5％冰乙酸和0.05％叠氮化钠，溶剂为去离子水。
77.细胞裂解液由质量分数为1％的np40，终浓度为55mmol/l的tris-hcl，质量分数为0.8％的氯化钠，终浓度为0.3mmol/l的pmsf，终浓度为1mmol/l的胃蛋白酶抑制剂，终浓度为1mmol/l的亮抑制肽和终浓度为1.5mmol/l的抑蛋白酶肽组成，溶剂为去离子水。
78.稀释液由如下质量分数的各组分组成：0.5％的ova，0.8％的氯化钠，0.6％的冰乙酸，0.04％的叠氮化钠，0.02％的氯化钾，0.144％的磷酸氢二钠和0.024％的磷酸二氢钾，溶剂为去离子水。
79.洗液由如下质量分数的各组分组成：20％的氯化钠，0.5％的氯化钾，3.6％的磷酸氢二钠，0.6％的磷酸二氢钾，溶剂为去离子水。用纯水按1:25稀释后使用。
80.一种基于elisa双抗体夹心法对细胞种属鉴定的试剂盒的使用方法，包括如下步
骤：
81.s1，包被，将3μg/ml的内参通用抗体a溶液按照100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；
82.s2，洗板，步骤s1包被的酶标板按照200μl/孔加入洗液，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；
83.s3，封闭，步骤s2甩干的酶标板按照200μl/孔加入封闭液封闭，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；封闭液制备：将5g drymilk溶解于100ml稀释液中制得；
84.s4，稳定，封闭处理后的酶标板按照200μl/孔加入酶标板稳定液，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复4次，吸干洗液；
85.s5，裂解，取2
×
106个人、大鼠、小鼠、仓鼠和猪的细胞，分别加入400μl细胞裂解液裂解细胞，并用pbs缓冲液稀释备用；
86.s6，加样，取步骤s4的酶标板，按照75μl/孔加入步骤s5裂解后的细胞溶液，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；
87.s7，加酶标抗体，步骤s2吸干洗液后的酶标板按照100μl/孔加入生物素标记的物种特异性抗体b，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；按照100μl/孔加入hrp-链霉亲和素，37℃孵育35min，震荡洗涤5min，重复3次，吸干洗液；
88.s8，tmb显色，加入tmb显色液，每孔90μl，37℃避光显色7min；
89.s9，观察各孔反应液的颜色确定细胞种属，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
90.实施例1-3选用人、大鼠、小鼠、仓鼠和猪物种，制备内参通用抗体a和特异性抗体b，物种细胞选用人、大鼠、小鼠、仓鼠和猪，按照实施例步骤进行检测，实施例1检测结果见图1。
91.图1可见，通过各孔颜色可判断样本物种，且染色深，便于观察，与目前常用的pcr方法相比，本发明建立的双抗体夹心elisa法成本低、操作简便、重复性好，适用于细胞或组织的物种鉴定推广应用，具有巨大的经济效益和广阔的应用前景。
92.将人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡细胞裂解液稀释成不同的浓度后进行酶标、显色和检测，检测灵敏度和检测时间，以不加细胞裂解液的试剂盒为对比例1，结果如表1-2。
93.表1灵敏度比较
94.组别稀释5倍稀释10倍稀释15倍稀释20倍实施例1+++++++++++++++对比例1++++
‑‑
95.表2检测时间比较
96.组别5min10min20min30min40min实施例1+++++++++++++++对比例1
‑‑‑
+++
97.备注：表1-2中，
“‑”
表示不显色，呈阴性结果；“+”表示显色程度，“+”越多，显色程度越深，阳性程度越高。
98.表1-2数据验证了本发明试剂盒检测时间短和反应灵敏的优点，反应时间5分钟即可判读结果，不需要辅助仪器，可直接肉眼观察结果，适用范围广。
99.本发明的样本不限于人、大鼠、小鼠、仓鼠、猪和鸡物种，可根据需要增加或减少物种；也不限于细胞样本，也可以检测组织样本。
100.以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。