一种同型半胱氨酸和维生素B12的检测方法、检测试纸条及其应用与流程

一种同型半胱氨酸和维生素b12的检测方法、检测试纸条及其应用
技术领域
1.本发明属于分析化学和临床检测技术领域，具体涉及一种同型半胱氨酸和维生素b12的检测方法、检测试纸条及其应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)是一种含巯基的氨基酸，是人体内甲硫氨酸代谢过程中的重要中间代谢产物。研究发现，在疾病条件下，酶的代谢出现障碍，血液中的hcy浓度升高。hcy已被国际医学界认为是动脉粥样硬化和血栓、冠心病等心脑血管疾病发病的独立危险因子，其临床意义甚至已被认为超过胆固醇。此外，hcy升高还是反映人体维生素b12缺乏的一个灵敏的生物标记物。
4.维生素b12（vitamin b12，vb12），是一种含有3价钴的多环系化合物，4个还原的吡咯环连在一起变成为1个咕啉大环（与卟啉相似），是唯一含金属元素的必需水溶性维生素，在机体内的物质代谢过程中发挥重要作用，缺乏时会引起机体出现巨幼红细胞贫血，会诱发各种神经性疾病。因此，具有高选择性和灵敏度的同型半胱氨酸和vb12检测方法具有重要的价值。
5.现有针对同型半胱氨酸和vb12检测方法主要包括高效液相色谱
‑
紫外光谱、原子吸收光谱(aas)、酶联免疫吸附分析(elisa)、分光光度法和微生物学分析法等等。但这些检测方法普遍存在检出限高、分析时间长、价格高昂、需要专业技术人员等问题。
6.量子点(qds)作为一种新型的发光纳米材料，其在检测领域具有独特的光致发光，化学稳定性和出色的生物相容性。但目前基于量子点(qds)的荧光检测体系对前体物质和检测环境要求严格，分析时间长，成本高，无法满足快速大量的检测需要，检测流程复杂；对同型半胱氨酸和vb12特异性不强。同时，同型半胱氨酸和vb12在体内是与蛋白结合而存在的，所以在检测血清或血浆等生物样本时，需要对样本进行解离，使其将同型半胱氨酸和vb12从结合蛋白上释放出来，再进行检测。然而，目前前处理过程往往过于复杂，且解离不彻底，从而导致检测结果并不准确。


技术实现要素：

7.针对上述现有技术的不足，本发明提供一种同型半胱氨酸和维生素b12的检测方法、检测试纸条及其应用。本发明通过对同型半胱氨酸和维生素b12的解离和检测过程进行优化，从而实现对上述物质的快速、灵敏和特异性检测。
8.本发明是通过如下技术方案实现的：本发明的第一个方面，提供一种同型半胱氨酸和维生素b12的检测方法，所述检测
方法包括采用竞争法，以固相免疫层析形式进行测定。
9.具体的，当待测物为同型半胱氨酸时，所述检测方法包括：s1、将待测样品加入稀释液中进行稀释并解离，并通过酶促反应使其转化为s
‑
腺苷同型半胱氨酸（sah）的待测物；s2、将上述待测物加入基于量子点的免疫层析试纸条上，对显色完成的试纸条进行荧光检测。
10.其中，所述稀释液包括解离剂r1和转化剂r2，r1与r2按照体积比为7~10:1（优选为9:1）进行混合，其中解离剂r1为含有1~10 mm（优选为5 mm） dtt的tris
‑
hcl溶液，r2为含有1~10 u/ml（优选为5 u/ml）s
‑
腺苷同型半胱氨酸水解酶的tris
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hcl溶液，催化待测样品向sah转化。
11.具体的，当待测物为维生素b12时，所述检测方法包括：s1、将待测样品加入稀释液中进行稀释并解离，经还原后在氰化物条件下转化为氰钴胺素的待测物；s2、将上述待测物加入基于量子点的免疫层析试纸条上，对显色完成的试纸条进行荧光检测。
12.其中，所述稀释液为含有硫代甘油、dtt和氰化钾的强碱溶液；更具体的，所述强碱溶液为0.01~0.1m（优选为0.05m）的naoh溶液，所述硫代甘油的终浓度为0.5~2 mm，优选为1 mm）；dtt的终浓度为1~10mm，优选为5mm；氰化钾的终浓度为0.001~0.01%，优选为0.005%。
13.所述待测样品可以为血液制品，包括但不限于全血、血清和血浆。
14.本发明的第二个方面，提供一种基于量子点的免疫层析试纸条，所述基于量子点的免疫层析试纸条包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，相邻各垫在连接处交叠连接。
15.其中，所述样品垫上喷涂有缓释膜。
16.具体的，所述样品垫可由玻璃纤维素膜材质制成，其具有极佳的亲水性，迅速重湿润，使得结合物释放充分。
17.所述缓释膜由明胶、羟丙基甲基纤维素（hpmc）和甘油加入水中搅拌均匀后获得，通过调整明胶、hpmc和甘油的配比，以及调整含水量，控制其成膜性，并达到控制其在加入样本液后5min定时溶解的目的，且整个过程对检测结果无影响。
18.其中，所述明胶、羟丙基甲基纤维素和甘油的质量比为1~3:1:1，优选为2:1:1，所述明胶和水的质量体积比为1~3g：50ml；优选为2g：50ml；本发明的一个具体实施方式中，将2g明胶加入到50ml纯化水中，先浸泡2h，再恒温至65
°
c左右匀速搅拌使其溶解；然后向其中加入1g羟丙基甲基纤维素（hpmc）和1g甘油，充分搅拌混匀后即得。
19.具体过程如下：将血液样本与解离剂混合后制成样本液，取一定量的样本液滴加到加样孔处，此处的膜起到了物理隔离的作用，使样本中的待测物质被解离剂充分解离、转化，5min之后，膜被溶解掉，解离后的待测物被释放进入样品垫，随即开始展板。
20.所述检测垫以硝酸纤维素膜（nc膜）为基垫，硝酸纤维素膜上依次设置检测线和质控线。
21.当待测物为同型半胱氨酸时，
所述结合垫喷涂有量子点标记sah抗体和量子点标记鸡igy抗体；进一步的，二者质量比可以为0.5~2:1，优选为1:1。
22.其中，所述量子点为cdse/zns量子点，相对普通荧光物质，其具有发射光谱半峰宽小、发光效率高、灵敏度高、性能稳定等优点。
23.所述sah抗体为sah单克隆抗体；具体的，所述量子点标记sah抗体采用如下制备方法获得：将cdse/zns量子点加入缓冲液中活化量子点羧基后，将其与所述sah单克隆抗体的氨基基团连接。
24.具体的，所述制备方法包括：将cdse/zns量子点加入mes缓冲液中进行活化，然后向其中加入edc、nhs，然后再加入sah单克隆抗体混合充分反应后，使用硼酸盐缓冲液进行离心洗脱，复溶后稀释即得。
25.其中，所述mes缓冲液为中性或弱酸性，进一步优选为ph为5~7，如ph为6.5。
26.所述硼酸盐缓冲液为中性或弱碱性，进一步优选为ph为7~9，如ph为8.4。
27.所述检测线包被有sah
‑
bsa抗原，即偶联bsa的sah抗原；所述质控线包被有羊抗鸡igy抗体。
28.所述吸水垫可以为吸水板或吸水纸；所述底板可采用pvc板。
29.当待测物为维生素b12时，所述结合垫喷涂有量子点标记的维生素b12抗体和量子点标记鸡igy抗体；进一步的，二者质量比可以为0.5~2:1，优选为1:1。
30.其中，所述量子点为cdse/zns量子点，相对普通荧光物质，其具有发射光谱半峰宽小、发光效率高、灵敏度高、性能稳定等优点。
31.所述维生素b12抗体为维生素b12单克隆抗体；具体的，所述量子点标记维生素b12抗体采用如下制备方法获得：将cdse/zns量子点加入缓冲液中活化量子点羧基后，将其与所述维生素b12单克隆抗体的氨基基团连接。
32.具体的，所述制备方法包括：将cdse/zns量子点加入mes缓冲液中进行活化，然后向其中加入edc、nhs，然后再加入维生素b12单克隆抗体混合充分反应后，使用硼酸盐缓冲液进行离心洗脱，复溶后稀释即得。
33.其中，所述mes缓冲液为中性或弱酸性，进一步优选为ph为5~7，如ph为6.5。
34.所述硼酸盐缓冲液为中性或弱碱性，进一步优选为ph为7~9，如ph为8.4。
35.所述检测线包被有维生素b12偶联抗原；所述质控线包被有羊抗鸡igy抗体。
36.本发明的第三个方面，提供上述检测方法或试纸条在如下任意一种或多种中的应用：1）同型半胱氨酸检测；2）维生素b12检测。
37.所述检测可以为定性或定量检测，优选为定量检测。
38.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：上述技术方案通过对同型半胱氨酸和维生素b12的解离和检测过程进行优化，从而实现对上述物质的快速、灵敏和特异性检测，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
39.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
40.图1为本发明试纸条结构示意图；其中，1
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样品垫，2
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结合垫，3
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nc膜，4
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吸水纸，5
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pvc底板，6
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缓释膜，7
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同型半胱氨酸检测线，8
‑
vb12检测线，9
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质控线；图2 为本发明检测卡的外部结构示意图；所述检测卡由试纸条包装检测卡壳后获得；其中，10为加样孔，11为检测视窗；图3为本发明同型半胱氨酸标准曲线图；图4为本发明维生素b12标准曲线图。
具体实施方式
41.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
42.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件或它们的组合。
43.本发明基于量子点荧光技术同型半胱氨酸检测方法原理如下：在nc膜上划线sah
‑
bsa抗原作为检测线，结合垫上喷涂量子点标记sah抗体（q
‑
ab）与量子点标记鸡igy抗体作为结合垫。加样后样本中待测抗原（sah）分别与量子点标记抗体结合形成量子点标记抗体
‑
抗原复合物。随后，样本通过固化有sah
‑
bsa抗原的检测线区域，未与待测抗原结合的标记抗体与检测线抗原结合形成量子点标记抗体
‑
抗原复合物，未结合的量子点标记鸡igy抗体继续前移，与质控线区域的羊抗鸡igy抗体结合，完成质控校准反应。通过配套仪器激发量子点产生荧光信号，从而可获得定性结果，而样品中待测抗原（sah）的含量与荧光信号强度在一定范围内呈负相关，通过标准曲线计算即可得出待测样品浓度，从而获得定量检测结果。
44.本发明基于量子点荧光技术vb12检测方法原理如下：本试剂盒采用竞争法，以固相免疫层析形式进行测定。将维生素b12
‑
bsa抗原包被在硝酸纤维素膜（nc膜）上作为检测线，将羊抗鸡igy包被在nc膜上作为质控线；将量子点标记vb12单克隆抗体与量子点标记鸡igy混合均匀后喷涂于硝酸纤维素膜上制成结合垫。测试时，将样本滴入加样孔内，标本中的维生素b12与预先包被在硝酸纤维素膜上量子点标记的维生素b12单克隆抗体结合，从而使量子点标记的叶酸单克隆抗体与预先包被在检测线
上的维生素b12偶联抗原结合量减少，检测线（t线）荧光条带减弱或是消失。无论样本中是否存在维生素b12，质控线区域均会出现荧光条带。通过配套仪器激发量子点产生荧光信号，从而可获得定性结果，而检测线上的光信号强度与质控线光信号强度的比值（t/c）与样本浓度呈负相关，通过标准曲线计算即可得出待测样品浓度，从而获得定量检测结果。
45.本技术将血清、血浆或者全血样本经样本稀释液处理后，直接用移液器取样滴加入加样孔中，进行加样，展板15min后，取出检测。
46.1）所得实验结果准确度好，与国家标准品的相对偏差在
±
10%以内；2）所得实验结果重复性好，cv不超过10%；3）样本无需特殊处理，血清、血浆、全血样本均可用于检测；4）试剂盒和解离液无需冷藏，常温运输储藏即可。
47.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
48.实施例1本实施例提供同型半胱氨酸、维生素b12联合检测用试剂盒，包括检测试纸条，所述试纸条包括pvc板、设置在pvc板上的硝酸纤维素膜（nc膜），nc膜上端设置有聚酯膜材质的结合垫，结合垫上端设置有玻璃纤维素膜材质的样品垫，与此二者相对应的nc膜的另一端设有吸水垫（纸）。所述结合垫上包被有质量比为1：1：1的量子点标记同型半胱氨酸抗体、量子点标记维生素b12抗体和量子点标记鸡igy抗体的混合物；所述硝酸纤维素膜（nc膜）上设置有检测线1、检测线2和质控线，所述检测线1上包被有同型半胱氨酸抗原、所述检测线2上包被有维生素b12抗原，所述质控线上包被有羊抗鸡igy；所述量子点为硒化镉量子点。
49.本实施例同型半胱氨酸、维生素b12联合检测用试剂盒的制备方法，具体操作步骤为：1）制备包被膜：取nc膜和pvc板，将nc膜非点样面贴于pvc板的既定位置，取浓度为1.0mg/ml的同型半胱氨酸抗原、维生素b12抗原、羊抗鸡igy，应用划膜喷金仪按1μl/cm划膜包被于nc膜的检测线1、检测线2和质控线位置，37℃烘干8h，即得所述的包被膜。
50.2）制备结合垫：a：取50μl硒化镉量子点，加入到4ml浓度为10mm的mes缓冲液（ph6.5）中，活化15min，4℃避光保存备用；b：取步骤a制备的量子点标记液，向其中依次加入20mg/ml edc、20mg/ml nhs各15μl，再加入5mg/ml sah抗体200μl，避光反应2h；c：取步骤b中的标记后混合液转移至100kd超滤管中进行离心，以3500g/min离心15min，确保离心后液体体积小于原体积的1/10；用50mm 硼酸盐缓冲液（ph8.4）作为洗脱液，洗脱5次，确保每次离心后液体体积小于原体积的1/10；d：应用复溶液对步骤c中得到的标记后抗体进行稀释，并混匀，即得到量子点标记的同型半胱氨酸抗体；所述复溶液为含有1%bsa、1%peg
‑
200、5%海藻糖、5%甘露醇的20mm tris
‑
hcl缓冲液。
51.e：按照上述步骤a~d同样的方法制备量子点标记维生素b12抗体和量子点标记鸡igy抗体；然后将三种标记抗体按照体积比1：1：1混匀后制成结合垫包被液，应用划膜喷金仪按照3μl/cm喷于聚酯垫上，37℃干燥4小时，即可得到所述的结合垫；
3）组装：将底板上对应位置的粘纸撕去，将吸水纸粘贴在包被膜的nc膜上方，覆盖nc膜1.5mm；将结合垫粘贴在包被膜的nc膜下方，覆盖nc膜1.5mm；将样品垫粘贴在结合垫下方，覆盖结合垫3mm，即可得到组装好的大板。
52.4）覆膜：向组装好的大板样品垫的加样孔位置覆盖上已经制备好的缓释膜，在其上下方分别用隐形胶带固定住。
53.其中，所述缓释膜制备方法如下：将2g明胶加入到50ml纯化水中，先浸泡2h，再恒温至65
°
c左右匀速搅拌使其溶解；然后向其中加入1g羟丙基甲基纤维素（hpmc）和1g甘油，充分搅拌混匀后即得。
54.5）切条装壳：应用微电脑斩切机，设置好试纸条宽度后，进行裁切，即为制备好的试纸条；将试纸条正向放入检测卡壳中，压壳封装好，即得到单人份同型半胱氨酸、维生素b12联合检测卡。所述检测卡壳由上下两部分扣合而成，检测卡壳上部具有加样孔及检测视窗，所述加样孔对应缓释膜的位置，用于向检测试纸条加样；透过检测视窗可观察到检测线及质控线。
55.6）所述试剂盒还含有样品稀释液，当试剂条用于检测同型半胱氨酸时，样品稀释液按照最优配方，具体包括解离剂r1和转化剂r2，其中解离剂r1为含有二硫苏糖醇（dtt，浓度为5mm）的tris
‑
hcl溶液，r2为含有s
‑
腺苷同型半胱氨酸水解酶（sahh，浓度为5u/ml）的tris
‑
hcl溶液，将r1与r2按照体积比为9：1进行混合。
56.当用于检测维生素b12时，样品稀释液样按照最优配方，具体为含有硫代甘油、dtt和氰化钾的强碱溶液，向0.05m的naoh溶液中添加硫代甘油、dtt和氰化钾，使其终浓度分别为1mm、5mm和0.005%。
57.需要说明的是，本实施中提供的是一种同型半胱氨酸、维生素b12联合检测用试剂盒，包括同型半胱氨酸、维生素b12联合检测用试纸条和对应的样品稀释液。由上述技术方案可知，采用同一同型半胱氨酸、维生素b12联合检测用试纸条即可实现对同型半胱氨酸、维生素b12的分别检测。
58.当然，也可以制备单独检测同型半胱氨酸检测试纸条和单独检测维生素b12的检测试纸条，区别仅在于当制备单独检测同型半胱氨酸检测试纸条时，结合垫上包被有质量比为1：1的量子点标记同型半胱氨酸抗体和量子点标记鸡igy抗体的混合物；所述硝酸纤维素膜（nc膜）上仅设置有一条检测线和质控线，所述检测线上包被有同型半胱氨酸抗原，所述质控线上包被有羊抗鸡igy；当制备单独检测维生素b12检测试纸条时，结合垫上包被有质量比为1：1的量子点标记维生素b12抗体和量子点标记鸡igy抗体的混合物；所述硝酸纤维素膜（nc膜）上仅设置有一条检测线和质控线，所述检测线上包被有维生素b12抗原，所述质控线上包被有羊抗鸡igy。具体制备方法做相应调整即可。
59.对比例1制备方法同实施例1，区别仅在于缓释膜配制时，加入2g羟丙基甲基纤维素（hpmc）和0.5g甘油。
60.对比例2制备方法同实施例1，区别仅在于量子点标记sah抗体、vb12抗体时，缓冲体系为ph7.0的磷酸盐缓冲液。
61.对比例3制备方法同实施例1，区别仅在于量子点标记sah抗体时，加入浓度为5mg/ml的sah抗体体积为100μl；量子点标记vb12抗体时，加入浓度为5mg/ml的vb12抗体体积为100μl。
62.对比例4制备方法同实施例1，区别仅在于当待测物为同型半胱氨酸时，所述样本稀释液中r1与r2分的积比为8：1进行混合，制备得到稀释液。
63.对比例5制备方法同实施例1，区别仅在于当待测物为维生素b12时，所述样本稀释液中硫代甘油的终浓度为2mm。
64.效果验证将实施例1与对比例1平行对比测试20例临床样本，将待测样本用稀释液稀释后滴加入加样孔中，并开始计时，记录缓释垫阻隔样本液的时间（从样本液加样开始到进入样品垫之间的时间），以及对20例样本的检测结果。
65.阻隔时间如下表1所示：表1
检测结果如下表2所示：表2结合上述表2中数据可知，本发明试剂盒实施例中使用配制的缓释垫，能准确控制样本液进入样品垫的时间在5min（300s）左右，保证了样本的解离效果，从而具有较高的灵敏度和准确性，对样本的检测结果与赋值结果相比较相关系数均在0.975以上，远优于对比例1的检测结果。
66.将实施例1与对比例2、3平行对比测试40例临床样本，将待测样本用稀释液稀释后滴加入加样孔中，15min后记录40份样本的检测结果。
67.检测结果如下表3所示：表3
结合上述表3中数据可知，本发明试剂盒实施例中使用的标记抗体的缓冲体系和抗体的添加量，是优化后最合适的标记体系，保证了加样后反应的灵敏度和准确性，对样本的检测结果与赋值结果相比较相关系数均在0.975以上，远优于对比例2和对比例3的检测结果。
68.将实施例1分别与对比例4、5平行对比测试40例临床样本，将待测样本用稀释液稀释后滴加入加样孔中，15min后记录40份样本的检测结果。
69.检测结果如下表4所示：表4
结合上述表4中数据可知，本发明试剂盒实施例中使用的样本稀释液中的组分配比已经达到最优，与样本混合后可对目标检测物质进行充分的解离，保证了加样后样本检测结果的准确性，对样本的检测结果与赋值结果相比较相关系数均在0.975以上，远优于对比例4和对比例5的检测结果。
70.试验例：将同型半胱氨酸稀释为1μm、2μm、5μm、10μm、20μm、50μm；将维生素b12稀释为100pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、3000pg/ml作为标准品溶液，并同时配制空白溶液。
71.分别取各浓度的标准品溶液50μl分别加入到实施例1制备的检测卡的加样孔中，15min后将展板完成的检测卡放入荧光免疫分析仪（山东子峰生物技术有限公司）进行判读，获取不同浓度检测线、质控线的荧光值，并记录各浓度标准品的荧光值与标准品浓度之间的对应关系。根据测量结果的荧光信号——标定浓度值，制定标准曲线方程。如图2~3所示，同型半胱氨酸的标准曲线回归方程为：y=1/（0.1627x+1.2465）；微生素b12的标准曲线方程为：y=1/（0.0161x+4.3667）。将标准曲线烧录到id卡中，制成同型半胱氨酸、维生素b12校准卡。
72.另外，取空白溶液加入到实施例1制备的检测卡中，同型半胱氨酸的反代浓度显示
为0μmol/l，微生素b12的反代浓度为0pg/ml。
73.取100例随机临床样本，采用本发明实施例1制备的试剂盒对同型半胱氨酸、维生素b12的浓度进行检测，检测方法为：取校准卡插入到荧光免疫分析仪（山东子峰生物技术有限公司）中，对仪器进行校准；取10μl样本中加入到90μl样品稀释液中，混匀后取50μl样本液滴加至样品垫上，展板15min放入荧光免疫分析仪（山东子峰生物技术有限公司）中，测得同型半胱氨酸、维生素b12的检测结果并记录。
74.其中，当用于检测同型半胱氨酸时，样品稀释液按照最优配方，具体包括解离剂r1和转化剂r2，其中解离剂r1为含有二硫苏糖醇（dtt，浓度为5mm）的tris
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hcl溶液，r2为含有s
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腺苷同型半胱氨酸水解酶（sahh，浓度为5u/ml）的tris
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hcl溶液，将r1与r2按照体积比为9：1进行混合。
75.当用于检测维生素b12时，样品稀释液样按照最优配方，具体为含有硫代甘油、dtt和氰化钾的强碱溶液，向0.05m的naoh溶液中添加硫代甘油、dtt和氰化钾，使其终浓度分别为1mm、5mm和0.005%。
76.所测得结果如下表5所示：表5
由此可见，本试剂盒可以直接定量检测同型半胱氨酸和维生素b12的浓度，方便快速，15min即可获得结果，适合在基层医院和体检中心推广和使用。
77.应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参
照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。