一种基于SERS增强的基底检测不同类型新冠病毒的方法与流程

一种基于sers增强的基底检测不同类型新冠病毒的方法
技术领域
1.本发明涉及一种新冠病毒的检测方法，具体涉及一种基于sers增强的基底检测不同类型新冠病毒的方法，一种氧化锌/纳米碳/纳米银sers增强的基底的制备方法及其在新冠病毒抗原检测方面的应用。本发明属于分子生物检测领域。


背景技术：

2.新型冠状肺炎病毒rna变异快，传播能力强。因此，研究新型的新冠病毒（sars-cov-2）检测方法及器械化。
3.sars-cov-2检测方法主要有核酸检测法和免疫学检测法。核酸检测法主要对病毒rna基因组进行检测，包括基因测序、荧光定量pcr（rt-qpcr）、数字pcr（dpcr）、基因芯片和环介导等温扩增（lamp）等技术。免疫学检测法是对病毒抗原或人体免疫反应产生的特异性抗体检进行检测，如酶联免疫吸附试验（elisa）、侧流免疫层析试纸条（lfics）。
4.无论是核酸检测或者免疫检测，仍面临诸多问题：（1）病毒rna检测灵敏度有限，检测样本需要纯化，检测耗时繁琐，对于发病前患者和病毒载量较低的无症状患者筛查准确度不足，无法满足疑似新冠病毒患者的现场快速检测需求；（2）部分新冠患者无血清转化，抗体水平较低；疾病早期抗受体结合区域抗体等抗体含量较低；并且新冠病毒潜伏期较长，采用抗体检测可能在早期无法将症状前患者和无症状感染者进行有效区分。迫切需要开发一种新型检测方法及配套检测装置，无需复杂的样本处理，可更快速、更灵敏地对新冠早期患者、无症状感染者进行有效筛查。


技术实现要素：

5.本发明目的在于提供一种基于sers增强的捕获基底的制备方法。
6.本发明的再一目的在于，提供上述方法得到的基底。
7.本发明的另一目的在于，提供所述基底在检测不同类型新冠病毒的应用。
8.本发明的又一目的在于，提供所述基底检测不同类型新冠病毒的方法。
9.本发明目的提供以下方案实现：一种基于sers增强的捕获基底的制备方法，在硅片或玻璃表面生成纳米氧化锌薄膜，随后在其表面生成碳基纳米颗粒，通过磁控检测法镀一层纳米银薄膜，以生成sers增强基底；进一步地，在基底表面偶联荧光分子和抗体从而获得捕获基底，包括下述步骤：（1）氧化锌/纳米碳/纳米银 sers增强基底的制备：玻璃或硅片经过丙酮、乙醇、去离子水和氢氟酸浸泡和彻底清洗；浸入质量比1:（1~1.5）的硝酸锌和六亚甲基四铵的混合溶液，ph6，80℃加热2 hr，乙醇彻底清洗烘干，得到处理过的硅片或玻璃；将处理过的硅片或玻璃在蜡烛火焰上来回灼烧一段时间，生成纳米碳薄膜；采用真空镀膜技术在上述步骤处理的硅片或玻璃上镀上一层100~150nm聚酰亚胺（pi）薄膜，随后采用磁射溅控技术进一步在其表面溅射一层纳米银薄膜，即可得到氧化锌/纳米碳/纳米银 sers增强基底；（2）捕获基底的制备：将步骤（1）制备的sers增强基底浸入1x10-5 mol/l二巯基丁
二酸溶液中，孵育30 min后，磷酸盐缓冲液（pbs）彻底清洗干净并干燥，得处理后的基底；将该处理后的基底浸入摩尔比3:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）溶液反应1hr活化羧基，然后，在基底表面滴入100-200 g/ml新冠病毒靶标蛋白抗体溶液，30℃孵育2hr，随后pbs彻底清洗，氮气吹干，得到捕获基底。
10.其中，步骤（1）中，所述的硅片或玻璃在蜡烛火焰上来回灼烧时间1~2min，生成厚度为10~20
µ
m的纳米碳薄膜，纳米碳尺寸为40~50 nm。
11.进一步的，步骤（1）中，所述的磁射溅射的纳米银的厚度在20~50 nm。
12.本发明还提供了一种基于sers增强的捕获基底，根据上述任一项方法制备得到的。
13.本发明也提供了一种根据上述的基于sers增强的捕获基底在检测不同类型新冠病毒中的应用。
14.另外，本发明也提供了一种根据上述的基于sers增强的捕获基底检测不同类型新冠病毒的方法，即进行靶标抗原的检测，包括以下步骤：（1）制备sers信号探针：50
µ
l 10
µ
m 4-巯基苯甲酸（4-mba）乙醇溶液加入1ml 50nm金纳米颗粒(au nps)（1 nm），室温震荡1 hr，离心彻底清洗未连接的4-mba，沉淀溶解于1ml pbs缓冲液中；在上述溶液中分别添加10
µ
l摩尔比3:1的edc（75mm）和nhs（25mm）溶液，随后在添加10
µ
l新冠病毒靶标蛋白抗体（1
ꢀµ
m），30℃反应2hr，获得sers信号探针；（2）检测：不同类型的10
µ
l新冠病毒靶标抗原分别滴在捕获基底上，室温孵育10min，彻底清洗后，加入10
µ
lsers信号探针，室温孵育30min，pbs彻底清洗去除未反应物，采用sers显微镜测定4-mba的拉曼信号。
15.其中，所述的新冠病毒靶标抗原为igg、igm、新冠病毒的核壳蛋白（n蛋白）或突刺蛋白（s蛋白）或者其活性片段。
16.本发明的优点在于：（1）目前，市面所售新冠病毒检测试剂盒及装置，多需要样本纯化，检测耗时繁琐，无法满足疑似新冠病毒患者的现场快速检测需求。本技术通过制备高灵敏的sers基底实现sers信号显著增强，提高检测的灵敏度和准确度。
17.（2）本发明利用sers检测的“指纹”特性，检测特异性高，并且成本低廉，可以很好的对新冠病毒抗原进行分析，适用于临床检测需求。
附图说明
18.附图1为实施例1测得10 pg igm抗原的拉曼信号强度图谱。
具体实施方式
19.以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
20.实施例1一种基于sers增强的基底检测不同类型新冠病毒的方法，通过在硅片或玻璃表面生成纳米氧化锌薄膜，随后在其表面生成碳基纳米颗粒，通过磁控检测法镀一层纳米银薄膜，以生成sers增强基底；进一步地，在基底表面偶联荧光分子和抗体从而获得捕获基底，
最后进行靶标抗原的检测，按以下步骤：1、氧化锌/纳米碳/纳米银 sers增强基底的制备：玻璃或硅片经过丙酮、乙醇、去离子水和氢氟酸浸泡和彻底清洗；浸入质量比1:1~1:1.5的硝酸锌和六亚甲基四铵的混合溶液（ph6），80℃加热2 hr，乙醇彻底清洗烘干，得处理的硅片或玻璃；将所述处理的硅片或玻璃在蜡烛火焰上来回灼烧1min，生成纳米碳薄膜；采用真空镀膜技术在所述处理的硅片或玻璃上镀上一层125nm聚酰亚胺（pi）薄膜，随后采用磁射溅控技术进一步在其表面溅射一层20 nm纳米银薄膜，即可得到氧化锌/纳米碳/纳米银 sers增强基底；2、捕获基底的制备：将步骤1制备的sers增强基底浸入二巯基丁二酸溶液（1x10-5 mol/l）中，孵育30 min后， pbs彻底清洗干净并干燥，得处理后的基底；将该处理后的基底浸入摩尔比3:1的edc和nhs溶液反应1hr活化羧基，然后在基底表面滴入200
ꢀµ
g/ml igm抗体溶液，30℃孵育2hr，随后pbs彻底清洗，氮气吹干，得到捕获基底；3、sers信号探针的制备：50
µ
l 10
µ
m 4-mba乙醇溶液加入1ml 50nm au nps（1 nm），室温震荡1 hr，离心彻底清洗未连接的4-mba，沉淀溶解于1ml pbs缓冲液中；在上述溶液中分别添加10
µ
l摩尔比3:1的edc（75mm）和nhs（25mm）溶液，随后在添加10
µ
l igm抗体（1
ꢀµ
m），30℃反应2hr，获得sers信号探针；4、检测：10
µ
l新冠病毒靶标抗原igm分别滴在捕获基底上，室温孵育10min，彻底清洗后，加入10
µ
lsers信号探针，室温孵育30min，pbs彻底清洗去除未反应物，采用sers显微镜测定4-mba的拉曼信号，附图1为本实施例测得10 pg igm抗原的拉曼信号强度图谱。
21.实施例2一种基于sers增强的基底检测不同类型新冠病毒的方法，与实施例1步骤1相同，按以下步骤：1、氧化锌/纳米碳/纳米银 sers增强基底的制备：玻璃或硅片经过丙酮、乙醇、去离子水和氢氟酸浸泡和彻底清洗；浸入质量比1:1~1:1.5的硝酸锌和六亚甲基四铵的混合溶液（ph6），80℃加热2 hr，乙醇彻底清洗烘干，得处理的硅片或玻璃；将所述处理的硅片或玻璃在蜡烛火焰上来回灼烧1min，生成纳米碳薄膜；采用真空镀膜技术在所述处理的硅片或玻璃上镀上一层125nm聚酰亚胺（pi）薄膜，随后采用磁射溅控技术进一步在其表面溅射一层20 nm纳米银薄膜，即可得到氧化锌/纳米碳/纳米银 sers增强基底；2、捕获基底的制备：将步骤1制备的sers增强基底浸入二巯基丁二酸溶液（1x10-5 mol/l）中，孵育30 min后， pbs彻底清洗干净并干燥，得处理后的基底；将该处理后的基底浸入摩尔比3:1的edc和nhs溶液反应1hr活化羧基，然后在基底表面滴入200
ꢀµ
g/ml igg抗体溶液，30℃孵育2hr，随后pbs彻底清洗，氮气吹干，得到捕获基底；3、sers信号探针的制备：50
µ
l 10
µ
m 4-mba乙醇溶液加入1ml 50nm au nps（1 nm），室温震荡1 hr，离心彻
底清洗未连接的4-mba，沉淀溶解于1ml pbs缓冲液中；在上述溶液中分别添加10
µ
l摩尔比3:1的edc（75mm）和nhs（25mm）溶液，随后在添加10
µ
l igg抗体（1
ꢀµ
m），30℃反应2hr，获得sers信号探针；4、检测：10
µ
l新冠病毒靶标抗原igg分别滴在捕获基底上，室温孵育10min，彻底清洗后，加入10
µ
lsers信号探针，室温孵育30min，pbs彻底清洗去除未反应物，采用sers显微镜测定4-mba的拉曼信号。
22.实施例 3一种基于sers增强的基底检测不同类型新冠病毒的方法，与实施例1步骤1相同，按以下步骤：1、氧化锌/纳米碳/纳米银 sers增强基底的制备：玻璃或硅片经过丙酮、乙醇、去离子水和氢氟酸浸泡和彻底清洗；浸入质量比1:1~1:1.5的硝酸锌和六亚甲基四铵的混合溶液（ph6），80℃加热2 hr，乙醇彻底清洗烘干，得处理的硅片或玻璃；将所述处理的硅片或玻璃在蜡烛火焰上来回灼烧1min，生成纳米碳薄膜；采用真空镀膜技术在所述处理的硅片或玻璃上镀上一层125nm聚酰亚胺（pi）薄膜，随后采用磁射溅控技术进一步在其表面溅射一层20 nm纳米银薄膜，即可得到氧化锌/纳米碳/纳米银 sers增强基底；2、捕获基底的制备：将步骤1制备的sers增强基底浸入二巯基丁二酸溶液（1x10-5 mol/l）中，孵育30 min后， pbs彻底清洗干净并干燥，得处理后的基底；将该处理后的基底浸入摩尔比3:1的edc和nhs溶液反应1hr活化羧基，然后在基底表面滴入200
ꢀµ
g/ml n蛋白抗体溶液，30℃孵育2hr，随后pbs彻底清洗，氮气吹干，得到捕获基底；3、sers信号探针的制备：50
µ
l 10
µ
m 4-mba乙醇溶液加入1ml 50nm au nps（1 nm），室温震荡1 hr，离心彻底清洗未连接的4-mba，沉淀溶解于1ml pbs缓冲液中；在上述溶液中分别添加10
µ
l摩尔比3:1的edc（75mm）和nhs（25mm）溶液，随后在添加10
µ
l n蛋白抗体（1
ꢀµ
m），30℃反应2hr，获得sers信号探针；4、检测：10
µ
l新冠病毒靶标抗原n蛋白分别滴在捕获基底上，室温孵育10min，彻底清洗后，加入10
µ
lsers信号探针，室温孵育30min，pbs彻底清洗去除未反应物，采用sers显微镜测定4-mba的拉曼信号。