一种阿伐那非及其相关杂质的检测方法与流程

1.本发明属于涉及药物分析技术领域，具体为阿伐那非及其相关杂质的检测方法。


背景技术：

2.阿伐那非(avanafil)，是一种口服速效的高选择性磷酸二酯酶-5(pde-5)抑制剂，2012年在美国上市，用于治疗治疗男性勃起功能障碍。对于采用全合成方法得到的药物，由于经过多种中间体及使用许多反应试剂，所以在得到所需要的最终活性药物成分(api)时，在api中会夹杂药物杂质。这些杂质可能会对最终产品的有效性和安全性产生重大影响。根据国际协调会议(ich)推荐的关于原料药中杂质的通用指南，对于最大日剂量等于或小于2g的药物，原料药中任何大于0.10％的杂质都应该被识别和定性。专利cn111208232a公开了一种阿伐那非及其制剂中有关物质的分析方法，该专利中采用高效液相色谱方法进行分析检测，使用辛烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，可以分离阿伐那非及其9个工艺杂质。专利cn106198766a公开了一种阿伐那非及其制剂的高效液相色谱分析方法，通过使用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，可以从阿伐那非中检测分离3种已知杂质。现有技术都是通过液相色谱对阿伐那非中的已知杂质进行分离，且未对其杂质的结构进行鉴定，有一定的局限性。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种阿伐那非及其相关杂质的检测方法，该方法可以很好地分离特定合成路线合成的阿伐那非及其有关杂质，还可以通过uplc兼容lc-ms对已知杂质和未知杂质进行鉴定，达到药品质量控制要求。
4.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
5.一种阿伐那非及其相关杂质的检测方法，所述方法为采用c18色谱柱，以10-30mm的甲酸铵水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，0.2-0.5ml/min为流速的uplc兼容lcms方法对由以下路线合成的阿伐那非进行分析检测：
[0006][0007]
优选地，所述流动相a为20mm的甲酸铵水溶液，ph为4.95～5.05。
[0008]
优选地，所述检测方法中uplc和lc-ms的流速均为0.3ml/min。
[0009]
优选地，所述检测方法中uplc的进样量为1.0μl，柱温为35℃。
[0010]
优选地，所述检测方法中lc-ms的雾化器气体压力为4.0bar，干燥气流速为8.0l/min，毛细管电压为3.5kv，转移毛细管温度为200℃。
[0011]
优选地，所述检测方法的uplc方法的线性梯度方案设置为:t时间/流动相a:b(％):t0/90:10；t1/90:10；t8/20:80；t10 90:10；t11/90:10。
[0012]
优选地，所述检测方法的lc-ms方法的线性梯度方案设置为:时间(min)/a:b(v/v)：t0/90:10；t1/90:10；t8/20:80；t10/；90:10t11/90:10。
[0013]
优选地，待测阿伐那非中含有[1-(4-{[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-5-{[(嘧啶-2-基)甲基]氨基甲酰基}嘧啶-2-基)吡咯烷-2-基]甲基4-{[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-2-[2-(羟甲基)吡咯烷-1-基]嘧啶-5-甲酸酯。
[0014]
优选地，待测阿伐那非中含有4-{[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-2-[2-(羟甲基)吡咯烷-1-基]嘧啶-5-羧酸、4-{[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-2-(甲硫基)-n-[(嘧啶-2-基)甲基]嘧啶-5-羧酰胺、2-[2-(羟甲基)吡咯烷-1-基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-[(嘧啶-2-基)甲基]嘧啶-5-羧酰胺以及[1-(4-{[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-5-{[(嘧啶-2-基)甲基]氨基甲酰基}嘧啶-2-基)吡咯烷-2-基]甲基4-{[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-2-[2-(羟甲基)吡咯烷-1-基]嘧啶-5-甲酸酯。
[0015]
本发明的技术方案所取得的有益效果在于：提供一种阿伐那非及其相关杂质的检测方法，该方法使用uplc可以很好地将阿伐那非与杂质分离，兼容lc-ms可以方便地通过正离子和负离子模式分析来确定杂质的分子量，并且该方法能够分离鉴定浓度为0.3-2.25μg/ml的杂质，为阿伐那非的药物监管提供了一种新方法。
附图说明
[0016]
图1为本发明所述阿伐那非待测液1的uplc谱图；
[0017]
图2为本发明所述阿伐那非待测液2的uplc谱图。
具体实施方式
[0018]
为了更好理解本发明的技术方案和优点，以下通过具体实施方式对本发明做进一步说明。
[0019]
检测条件：
[0020]
uplc方法：采用agilent 1260uhplc系统，色谱柱为waters acquity hss c18，径为50mm
×
2.1mm，色谱柱为1.8μm，分辨率高。流动相a为20mm甲酸铵水溶液，用稀释甲酸调节ph至5.00
±
0.05，流动相b为乙腈。经过脱气和过滤，然后在真空下通过0.22μm过滤器进入系统。通过流动相百分比变化优化线性梯度方案，设置为:t时间/流动相a:b(％):t0/90:10,t1/90:10；t8/20:80；t10 90:10；t11/90:10；流速0.3ml/min。进样量为1.0μl，柱温为35℃。分析物在光电二极管阵列探测器中检测，波长为239nm。
[0021]
lc
–
ms方法：采用agilent6470 lc/tq质谱仪(美国安捷伦)，该质谱仪与安捷伦1260-lc系统在正负esi模式下耦合。所有化合物的分析均在waters c18柱上进行。梯度洗脱采用溶液a和b作为流动相组分。流动相a为20mm甲酸铵缓冲液(用1％甲酸将ph调节至5.00)，而流动相b为乙腈。梯度程序设置如下：时间(min)/a:b(v/v)；流速为0.3ml/min的t0/90:10,t1/90:10；t8/20:80；t10/90:10t11/90:10，在100～1000da的m/z范围内获得了产物质谱；操作参数如下：雾化器气体压力为4.0bar，干燥气流速为8.0l/min，毛细管电压为3.5kv，转移毛细管温度为200℃。所有数据均由安捷伦数据分析软件mass hunter采集和处理。
[0022]
实施例1
[0023]
阿伐那非待测液1采用uplc方法进行检测，结果如图1所示，杂质a、b、c、d的含量分别为0.89％、0.57％、0.57％和1.44％。
[0024]
阿伐那非待测液1采用lc-ms方法分离和鉴定，结果显示：杂质a存在393.2的[m+h]+峰、杂质b存在430.8的[m+h]+峰、杂质c存在450的[m+h]+峰、杂质d存在858.0的[m+h]+峰。
[0025]
表1和表2为阿伐那非待测液1的检测数据。
[0026]
表1阿伐那非及其相关杂质的保留时间和分离度
[0027]
名称保留时间(min)分离度杂质a4.29-杂质c5.025.35
±
0.03阿伐那非5.442.81
±
0.03杂质b6.023.88
±
0.03杂质d7.8512.35
±
0.1
[0028]
表2线性和灵敏度
[0029][0030]
经检测验证，杂质a为4-{[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-2-[2-(羟甲基)吡咯烷-1-基]嘧啶-5-羧酸，杂质b为4-{[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-2-(甲硫基)-n-[(嘧啶-2-基)甲基]嘧啶-5-羧酰胺，杂质c为2-[2-(羟甲基)吡咯烷-1-基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-[(嘧啶-2-基)甲基]嘧啶-5-羧酰胺，杂质d为[1-(4-{[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-5-{[(嘧啶-2-基)甲基]氨基甲酰基}嘧啶-2-基)吡咯烷-2-基]甲基4-{[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-2-[2-(羟甲基)吡咯烷-1-基]嘧啶-5-甲酸酯。
[0031]
实施例2
[0032]
阿伐那非待测液2采用uplc方法检测，结果如表3所示：
[0033]
表3阿伐那非及其相关杂质的含量及分离度
[0034][0035][0036]
需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。