一种碳电极的制备及植物桑色素的检测方法和应用

1.本发明涉及活体检测技术领域，尤其涉及一种碳电极的制备及植物桑色素的检测方法和应用。


背景技术：

2.臭氧(o3)作为光氧化剂的主要成分，造成抑制植物生长、植株矮化、作物叶面积变小、叶片早衰、光合速率下降等负效应，从而导致作物产量下降，品质下降。尤其是工业发达的地区如京津冀地区及珠江长三角洲地区，超过10％时间的臭氧平均小时浓度高达60ng
·
l-1
。鉴于此，研究臭氧胁迫下植物的生物学机制得到学者的广泛关注。黄酮类化合物是植物体内重要的酚类次生代谢物。黄酮类化合物-桑色素可很好地清除超氧阴离子(o
2-)、羟自由基(
á
oh)和单线态氧(1o2)。检测桑色素的动态浓度变化，可揭示次生代谢产物对臭氧浓度增加的适应机制与响应机制。
3.常规的检测桑色素的技术主要是紫外分光光度法，反向高效液相色谱技术，毛细管电泳技术等，但通常无法实现原位活体检测，对植物的损伤过大，而电化学法体积小便于携带于户外实时监测，灵敏度高，抗干扰能力强的优点又满足检测需求，所以电化学技术最为适宜。在臭氧胁迫下，桑色素的活体动态浓度显得尤为重要，以了解植株的自身防御及营养元素的变化，对植物的臭氧防护提供依据。目前提供一种新的原位实时监测植物中的桑色素的检测方法是本领域亟待解决的重要课题。


技术实现要素：

4.本发明提供一种碳电极的制备及植物桑色素的检测方法和应用。本发明制备的碳电极能够基于生物传感技术原位实时监测植物中的桑色素，攻克了现有技术复杂的样品前处理、只能离体检测的难题，且利用了绿色环保的生物质炭制备的杂化材料。
5.根据本发明，向日葵是当前主要经济作物之一，种植面积及产量在全球范围都占了很大的比重。葵花籽皮是葵花籽相关产品生产工艺的副产物，产量巨大，目前大部分是直接废弃，没有开发出其成熟的二次利用的方法，造成了生物质资源极大的浪费。葵花籽皮难以制得具有比表面积高，丰富表面官能团特点的材料，未经活化的葵花籽皮不适合活体检测。本发明首次利用作为生物质炭的葵花籽皮制作杂化碳材料。该材料结构疏松多孔、比表面积大、绿色可持续，能够在生物传感领域应用。
6.本发明提供一种碳电极的制备方法，包括：
7.1)以co(ch3coo)2·
4h2o水溶液、na2sno3·
4h2o水溶液和naoh为原料制备mosn(oh)6纳米前驱体；
8.2)以葵花籽皮生物质材料、所述mosn(oh)6纳米前驱体和koh为原料制备钼-锡双金属氧化物-碳杂化材料；
9.3)以所述钼-锡双金属氧化物-碳杂化材料、萘酚甲醇溶液为原料制备钼-锡双金属氧化物-碳电极；
10.4)以镍酞菁的chcl3溶液和所述钼-锡双金属氧化物-碳电极为原料制备镍酞菁/钼-锡双金属氧化物-碳电极。
11.本发明中，通过绿色环保的生物质构成的钼-锡双金属氧化物-碳杂化材料具有大的比表面积、强的电催化能力，该杂化材料与镍酞菁协同作用实现了桑色素高灵敏度的检测。最终碳电极基于生物传感技术原位实时监测了植物中的桑色素。
12.根据本发明提供的碳电极的制备方法，步骤1)中，将co(ch3coo)2·
4h2o水溶液和na2sno3·
4h2o水溶液混合搅拌，加入氢氧化钠溶液，室温下搅拌1～2h；然后在150～200℃的温度下加热18～24h，冷却后离心、洗涤和干燥；和/或
13.步骤2)中，将所述葵花籽皮生物质材料、所述mosn(oh)6纳米前驱体与氢氧化钾溶液混合，超声处理0.5～20h优选2h，在80～110℃烘干3～6h；然后以5℃
·
min-1
的速度升温至750～950℃，保温1～10h优选3h，冷却；和/或
14.步骤3)中，将所述钼-锡双金属氧化物-碳杂化材料与0.1％的萘酚甲醇溶液混合，超声处理0.5～1h；将2～5μl优选4μl的分散液涂覆在基材表面上，在35～55℃优选48℃下干燥3～5min优选4min，重复涂覆3～6次；和/或
15.步骤4)中，将4～15μl优选12μl镍酞菁的chcl3溶液涂覆在所述钼-锡双金属氧化物-碳电极上，chcl3挥发后即得。
16.本发明中，通过采用上述步骤2)得到更佳的多孔的葵花籽皮生物质材料，通过采用上述氢氧化钾溶液，增加了葵花籽皮的比表面积及活性位点，从而进一步提高传感器的性能，能够更好的桑色素检测。
17.根据本发明提供的碳电极的制备方法，步骤1)中，co(ch3coo)2·
4h2o水溶液的浓度为0.1～0.3mmol/ml优选0.2mmol/ml，na2sno3·
4h2o水溶液的浓度为0.1～0.3mmol/ml优选0.2mmol/ml；氢氧化钠溶液的浓度为0.05～0.2m优选为0.1m；co(ch3coo)2·
4h2o的水溶液和na2sno3·
4h2o的水溶液的体积比为10～35:10:6～10优选20:10:8；和/或
18.步骤2)中，所述葵花籽皮生物质材料的制备包括：将葵花籽皮洗涤，在80～100℃烘干20～36h，进行研磨；所述葵花籽皮生物质材料、所述mosn(oh)6纳米前驱体和所述氢氧化钾溶液的质量体积比为4～8g：2～6g：10～25ml，优选的，所述葵花籽皮生物质材料、所述mosn(oh)6纳米前驱体和所述氢氧化钾溶液的质量体积比为6g：4g：20ml；所述氢氧化钾溶液的浓度为1m；和/或
19.步骤3)中，所述钼-锡双金属氧化物-碳杂化材料与所述萘酚甲醇溶液的质量体积比为2～5mg:1ml优选3mg:1ml，所述基材优选为1cm
×
1cm
×
1cm的陶瓷片；和/或
20.步骤4)中，所述镍酞菁的chcl3溶液的浓度为0.05～0.2m优选为0.1m。
21.本发明中，通过采用上述步骤1)中的co(ch3coo)2·
4h2o、na2sno3·
4h2o及氢氧化钠溶液三者的浓度比例，能够更好的得到mosn(oh)6，从而进一步得到的钼-锡双金属氧化物能够更好的桑色素检测。尤其是，通过采用步骤2)中上述比例的氢氧化钾溶液，钼-锡双金属氧化物形成更佳的多孔结构，进一步提高电流的响应。
22.本发明还提供一种碳电极，由所述碳电极的制备方法得到的镍酞菁/钼-锡双金属氧化物-碳电极。
23.本发明还提供一种传感器，包括：由所述碳电极的制备方法得到的碳电极或所述的碳电极；优选的，还包括铂丝和ag/agcl。
24.本发明中，通过采用上述步骤co(ch3coo)2·
4h2o水溶液的浓度为0.1～0.3mmol/ml优选0.2mmol/ml，na2sno3·
4h2o水溶液的浓度为0.1～0.3mmol/ml优选0.2mmol/ml；氢氧化钠溶液的浓度为0.05～0.2m优选为0.1m；co(ch3coo)2·
4h2o的水溶液和na2sno3·
4h2o的水溶液的体积比为10～35:10:6～10优选20:10:8。由以上参数制备的钼-锡双金属氧化物，通过双金属氧化物中的两种金属之间的协同作用，提高了工作电极的电催化性能，相比单一的金属氧化物能够更好的进行检测。
25.本发明还提供一种植物桑色素的检测方法，采用所述的传感器对目标植物进行电化学分析，得出桑色素的浓度。
26.根据本发明提供的所述的植物桑色素的检测方法，包括：用标准浓度的桑色素对传感器进行校正，优选计算出斜率a与截距b，使斜率偏差在15％内；将工作电极置于目标植物的待测部位，连接电化学工作站，使用电流-时间法得到工作曲线；得出目标植物待测部位的桑色素的浓度。
27.根据本发明提供的所述的植物桑色素的检测方法，检测桑色素的工作电压为0.3v。
28.根据本发明提供的所述的植物桑色素的检测方法，所述目标植物选自农作物、中草药、花卉和蔬菜中的一种或多种，优选为大豆；和/或，对所述目标植物的根、茎、叶和果实中的一种或多种进行检测，优选为叶；和/或，对不同生长时期和/或不同生长环境的所述目标植物进行检测；和/或，所述目标植物的被检测部位无离体和微创性损伤。
29.本发明中，通过采用上述电流-时间法，工作电压为0.3v，能够更好的特异识别桑色素。
30.本发明还提供采用所述的碳电极的制备方法得到的碳电极或所述的碳电极或所述的传感器在在线分析植物体内桑色素的动态浓度中的应用。
31.本发明的有益效果至少在于：本发明能够对大豆叶片实现桑色素的检测，由于电化学活体检测技术，相对于其他传统的检测手段，该电极不会对植物造成实质性损伤，植物可继续生长，并且响应信号快速，检测限低。本发明首次利用作为生物质炭的葵花籽皮制作杂化碳材料，首次制备钼-锡双金属氧化物，两者协同作用成功实时检测桑色素。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
33.图1为本发明实施例中碳电极的制备流程示意图。
具体实施方式
34.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
36.本发明实施例中，所用高o3敏感性作物-大豆具体为铁丰29号大豆，以叶片中桑色素含量为研究对象；采用瑞士万通autolab电化学工作站的电流-时间法获得电信号。
37.实施例1
38.本实施例提供一种镍酞菁/钼-锡双金属氧化物-碳电极的制备，如图1所示为实施例中碳电极的制备流程示意图，具体包括：
39.1)mosn(oh)6纳米前驱体的制备
40.分别配制浓度为0.2mmol/ml co(ch3coo)2·
4h2o和0.2mmol/ml na2sno3·
4h2o的水溶液。将两种溶液分别取体积20ml与10ml，混合搅拌逐滴滴加浓度为0.1m的氢氧化钠8ml到混合溶液中，在室温下磁力搅拌1～2h。将最终的溶液转移到不锈钢高压釜中，置于150～200℃的烘箱中18～24小时，高压釜自然冷却后，离心收集材料，用水和无水乙醇各洗涤两次，然后在真空烘箱中干燥，得到mosn(oh)6纳米前驱体。
41.2)钼-锡双金属氧化物-碳杂化材料的制备
42.摘取葵花籽皮，清水洗涤几次以去杂质，然后在80～100℃的真空干燥箱中烘干20～36h，研磨。取6g葵花籽皮生物质材料、4g mosn(oh)6纳米粒子分散在20ml的1m氢氧化钾溶液，混合搅拌，超声2h后，在鼓风干燥箱中80～110℃烘干3～6h。混合材料置于石英舟中，将石英舟放入管式炉中，在空气中，以5℃
·
min-1
的升温速度升至750～950℃，保持此温度3h，待管式炉冷却到室温，得到mo-sn双金属氧化物-碳杂化材料。
43.3)钼-锡双金属氧化物-碳电极的制备
44.将3mg钼-锡双金属氧化物-碳杂化材料置于1ml的0.1％萘酚甲醇溶液中，超声0.5～1h分散均匀。将4μl的分散液滴涂在陶瓷片(1cm
×
1cm
×
1mm)上，在48℃的鼓风干燥箱中干燥4min取出，此步骤共重复3～6次，得到钼-锡双金属氧化物-碳电极。
45.4)镍酞菁/钼-锡双金属氧化物-碳电极的制备
46.配制0.1m镍酞菁(nipc)的chcl3溶液后，超声至完全溶解后，取12μl此溶液均匀滴涂在钼-锡双金属氧化物-碳电极上。在室温下，等待三氯甲烷完全挥发后，即形成镍酞菁薄膜，得到镍酞菁/钼-锡双金属氧化物-碳电极。
47.本实施例还提供一种利用实施例中镍酞菁/钼-锡双金属氧化物-碳电极构建的传感器，该传感器采用上述镍酞菁/钼-锡双金属氧化物-碳电极的工作电极、铂丝和ag/agcl构成的三电极体系。
48.本实施例还提供一种利用实施例中镍酞菁/钼-锡双金属氧化物-碳电极构建的传感器检测大豆叶片中桑色素的含量，包括：
49.(1)选用高o3敏感性作物大豆，测试器官为叶片，将叶片扎微米级别的孔，滴加缓冲溶液覆盖住孔，工作电极、铂丝、ag/agcl置于叶子下，开始进行电化学测试。
50.(2)标准曲线的绘制：用0.1m br(ph6.8)缓冲溶液配制的桑色素标准溶液，浓度分别为0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、75、100、150、200、300μm。使用上述电极利用电流-时间法进
行不同浓度的桑色素的测定，电压设置为0.3v，时间为600s。得到一组浓度与电流的关系曲线，随之计算该工作电极的标准曲线。
51.(3)活体在线检测：所有的电极(工作电极，参比电极，对电极)用超纯水冲洗过后，电极夹与工作电极相连，连接电化学工作站，首先分别测试两份桑色素标准溶液(1μm，5μm)进行电化学校正，计算的工作曲线与标准曲线斜率在15％以内，认为电极可以正常工作，校正后先在0.1m br缓冲溶液中进行i-t测试600s，待背景电流稳定。用微米级的铂丝扎叶片15个孔。将工作电极贴在叶片微孔的下方，取100μl的br缓冲溶液滴在微孔上，铂丝、agcl/ag电极贴在叶片微孔的上方，再用一个载玻片盖在缓冲溶液上，确保覆盖住微孔，得到电流-时间曲线(电位0.3v，静止时间5s，时间600s)，获得的电流信号通过校正后的工作曲线，即可计算出大豆叶片的即时浓度。
52.(4)实验结果对比：在开顶式气室(otc)设置两个处理。对照组为环境的浓度；臭氧胁迫组：大豆出苗30天后，进行臭氧熏蒸实验，臭氧浓度为100ng
·
l-1
，每天熏蒸8h，直至分枝期测定即时浓度。
53.对照组与臭氧胁迫组的叶片分别进行活体在线检测，选择大豆相同叶片部位。分析结果对比见表1。该结果表明本发明传感器可靠。
54.表1 测试结果对比
[0055][0056]
采用本实施例进行大豆叶片中的桑色素测定，桑色素氧化峰电流与其浓度呈良好的线性关系，线性范围1
×
10-7
mol/l～1.5
×
10-3
mol/l，线性回归方程为：i
pa
＝0.152c+0.185，r＝0.98，检测限为8
×
10-8
mol/l。
[0057]
对比例1
[0058]
本对比例采用现有技术中常规的桑枝中桑色素的双安培法在线测定，使用经过恒电位预阳极化处理的双铂电极，在外加电位差为0v时，桑色素的氧化电流与其浓度在4.0
×
10-6
～1.0
×
10-3
mol/l范围内呈线性关系(r＝0.999 1,n＝14)。检出限为1.0
×
10-6
mol/l。
[0059]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。