一种逍遥丸UPLC指纹图谱的构建方法及其应用

一种逍遥丸uplc指纹图谱的构建方法及其应用
技术领域
1.本发明属于中药质量分析领域，具体涉及一种逍遥丸uplc指纹图谱的构建方法及其应用。


背景技术：

2.逍遥丸源自宋代《太平惠民和剂局方》中具有“疏肝（解郁）、健脾（养血）”功效的重要经典方剂逍遥散，是由柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、炙甘草、生姜和薄荷共8味中药制得的中成药制剂，能有效的治疗用于肝郁脾虚所致的郁闷不舒、胸胁胀痛、头晕目眩、食欲减退、月经不调等症，临床疗效确切。
3.逍遥丸在现行2020年版《中国药典》的质量标准中仅以芍药苷为含量测定指标，缺乏能表征其化学轮廓特征的指纹图谱相关“鉴别项”，因而无法反映该中成药制剂的整体质量。在已有文献报道的质控方法中建立的逍遥丸hplc指纹图谱，17个共有峰仅有6个经对照品准确化学指认，且分析时间长（70 min）、分离效果不理想，难以实现逍遥丸的整体质量评价。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有技术关于逍遥丸指纹图谱研究存在分析时间长、分离效果不理想、难以实现逍遥丸整体质量评价的实际问题，从而提供了一种基于uplc-pda的逍遥丸指纹图谱的构建方法和应用，所述指纹图谱可更为全面地反映逍遥丸化学轮廓特征，极大提升现有分析方法对逍遥丸化学物质基础的认识，具备绿色环保、快速高效等特点，实现了对多厂家多批次逍遥丸市售中成药制剂的质量一致性分析和质量差异评价。
5.为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
6.本发明第一方面提供了一种逍遥丸指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：（1）制备逍遥丸的供试品溶液；（2）制备混合对照品溶液；（3）制备阴性对照溶液；（4）采用超高效液相色谱仪进行uplc-pda的色谱分析，分别记录逍遥丸的供试品溶液、混合对照品溶液和阴性对照溶液色谱图。通过供试品溶液与混合对照品比较，明确逍遥丸指纹图谱中色谱峰的化学信息；通过供试品溶液与阴性对照溶液比较，表征逍遥丸指纹图谱中色谱峰的药味归属。
7.作为优选地，步骤（1）中所述供试品溶液的制备方法具体为：将逍遥丸研成粉末加入到体积分数为70%甲醇中，经超声处理、放冷后定容、高速离心后取上清液，制备成浓度为0.02 g/ml的溶液供试品溶液。
8.作为优选地，步骤（2）中所述混合对照品溶液的制备方法具体为：精密称取对照品溶解于纯甲醇中，得到一定浓度的对照品储备液；分别精密量取一定量所述对照品储备液加溶剂稀释，得混合对照溶液。
9.作为优选地，所述对照品包括没食子酸、绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、五没食子酰葡萄糖、洋川芎内酯i、洋川芎内酯h、甘草素、苯甲酰芍药苷、甘草酸、异甘草素、甘草香豆素、藁本内酯、欧当归内酯a。
10.作为优选地，步骤（3）中所述阴性对照溶液制备方法具体为：将阴性对照品研成粉末加入到体积分数为70%甲醇中，经超声处理、放冷后定容、高速离心后取上清液，制备成浓度为0.02 g/ml的溶液阴性对照溶液。
11.作为优选地，所述阴性对照选自柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、甘草、姜、薄荷中的一种或多种。
12.作为优选地，步骤（4）中所述超高效液相色谱仪的色谱条件为：采用acquity uplc hss t3柱（2.1
×
100 mm，1.8 μm）作为固定相；以乙腈（b）-水（a）（各含体积分数为0.1%的甲酸）作为流动相进行梯度洗脱；流速为0.3 ml/min；以pda作为检测器进行分段变波长检测，柱温为40
ꢀ°
c。
13.作为优选地，所述梯度洗脱参数为0-4.0 min，5-14%b；4.0-7.0 min，14-25%b；7.0-8.5 min，25-35%b；8.5-10.0 min，35-80%b；10.0-11.0 min，80-100%b；11.0-12.0 min，100%b；12.0-12.5 min，100-5%b；12.5-13.0 min，5%b。
14.作为优选地，所述分段变波长检测参数为：0-5.6 min，280 nm；5.6-6.6 min，252 nm，6.6-9.6 min，280 nm；9.6-13.0 min，260 nm。
15.作为优选地，步骤（4）中进行uplc-pda色谱分析的进样量为1-5 μl；最优选为2 μl。
16.本发明第二方面提供了根据上述构建方法获得逍遥丸指纹图谱。
17.作为优选地，所述指纹图谱包含32个色谱共有峰，其中第1号峰为没食子酸、第6号峰为绿原酸、第9号峰为芍药内酯苷、第10号峰为芍药苷、第13号峰为芹糖甘草苷、第14号峰为甘草苷、第15号峰为五没食子酰葡萄糖、第20号峰为洋川芎内酯i、第21号峰为洋川芎内酯h、第22号峰为甘草素、第24号峰为苯甲酰芍药苷、第26号峰为甘草酸、第27号峰为异甘草素、第28号峰为甘草香豆素、第30号峰为藁本内酯、第32号峰为欧当归内酯a。
18.本发明第三方面提供了一种逍遥丸质量控制的方法，包括如下步骤：（1）取逍遥丸受试品进行逍遥丸对照指纹图谱的构建；（2）将经步骤（1）构建获得的逍遥丸对照指纹图谱与逍遥丸指纹图谱进行相似度分析，以完成逍遥丸受试品质量一致性评价，进而通过化学计量学分析明晰引起多厂家多批次间市售产品质量差异的关键成分。
19.作为优选地，所述逍遥丸对照指纹图谱采用上述逍遥丸指纹图谱的构建方法进行构建。
20.作为优选地，所述逍遥丸受试品为市售获得。
21.本发明相对于现有技术具有如下技术效果：（1）本发明采用超高效液相色谱仪对逍遥丸进行色谱分析，所建立的uplc-pda指纹图谱，在13 min内实现逍遥丸的整体化学轮廓的表征，能够显著降低现有技术中hplc指纹图谱分析时间，具备绿色环保、快速高效等特点。
22.（2）本发明构建的逍遥丸指纹图谱，实现了32个色谱共有峰的表征，并对其中16个主要色谱峰进行了明确的化学指认，覆盖芍药、薄荷、白术、当归、甘草5个组方药味，能够极
大的提升现有分析方法对逍遥丸化学物质基础的认识。
23.（3）本发明样本前处理快捷、简单，对所构建的指纹图谱方法进行方法学考察，包括仪器精密度试验、方法重复性试验、样品稳定性试验，各试验结果的相似度值均高于0.99，表明该方法重现性好，可信度高，能够满足大批量样本分析测试需求，为逍遥丸临床应用与质量控制提供技术支持与理论参考。
附图说明
24.图1为逍遥丸供试品溶液pda全波长（240 nm-400 nm）扫描的uplc-3d图谱。
25.图2为不同柱温考察的uplc色谱叠加图。
26.图3为不同流速考察的uplc色谱叠加图。
27.图4为不同提取溶剂比例考察的uplc色谱叠加图。
28.图5为不同提取时间考察的uplc叠加色谱图。
29.图6为8个阴性对照药材色谱图。
30.图7为精密度考察的uplc叠加色谱图（n=6）。
31.图8为重复性考察的uplc叠加色谱图（n=6）。
32.图9为稳定性考察的uplc叠加色谱图（n=6）。
33.图10为40批市售逍遥丸制剂uplc指纹图谱（n=40）。
34.图11为市售逍遥丸制剂uplc对照指纹图谱（共有模式，n=40）。
35.图12为16个化合物混合对照品溶液色谱图。
36.图13为16个对照化合物的结构式。
37.图14为40批逍遥丸制剂pca得分图。
38.图15为40批逍遥丸制剂opls-da得分图。
39.图16为opls-da模型验证图。
40.图17为多批次逍遥丸差异成分的vip图。
具体实施方式
41.为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
42.实施例1 uplc色谱条件优化1、梯度洗脱洗脱程序的优化通过采用acquity uplc hss t3柱（2.1
×
100 mm，1.8 μm）作为固定相；以乙腈（b）-水（a）,各含体积分数为0.1%的甲酸作为流动,考察不同的洗脱程序，最终确定能使化合物具有较好分离度及较佳出峰时间的梯度洗脱程如下：0.0-4.0 min，5-14%b；4.0-7.0 min，14-25%b；7.0-8.5 min，25-35%b；8.5-10.0 min，35-80%b；10.0-11.0 min，80-100%b；11.0-12.0 min，100%b；12.0-12.5 min，100-5%b；12.5-13.0 min，5%b。
43.2、检测波长的选择采用二级管阵列检测器（pda）在200-400 nm对逍遥丸供试品溶液中待测成分进行了全波长扫描，结果如图1所示。结果显示，逍遥丸中级性较大的化合物在280 nm下出峰较
多且峰形加好，中等极性黄酮类成分在280 nm左右紫外吸收较好，芍药苷类成分在230-260 nm都有较强的紫外吸收，9.6-13.0 min内采集的化合物在260 nm波长下出峰较多，综合以上信息，本发明最终采用分段变波长的采集方式：0-5.6 min，280 nm；5.6-6.6 min，252 nm，6.6-9.6 min，28 nm；9.6-13 min，260 nm。
44.3、考察不同柱温分别考察30
°
c，35
°
c，40
°
c三种不同的色谱柱柱温对供试品溶液中各色谱峰分离度和峰形的影响，结果如图2所示，可以看出柱温为40
°
c时，色谱峰的分离度要优于其他柱温，因此选择40
°
c作为逍遥丸指纹图谱分析用柱温。
45.4、考察不同流速分别考察0.2 ml/min，0.3 ml/min，0.4 ml/min三种不同的流速对对供试品溶液中各色谱峰分离度和峰形的影响，结果如图3所示，发现各色谱峰在三个流速下分离度基本相同，但当流速为0.3 ml/min时色谱峰峰形和分离度最优，因此选择0.3 ml/min作为逍遥丸指纹图谱分析用流速。
46.因此最终确定逍遥丸指纹图谱的色谱条件为：采用acquity uplc hss t3柱（2.1
×
100 mm，1.8 μm）；以乙腈（b）-水（a）,各含体积分数为0.1%的甲酸作为流动相进行梯度洗脱：0.0-4.0 min，5-14%b；4.0-7.0 min，14-25%b；7.0-8.5 min，25-35%b；8.5-10.0 min，35-80%b；10.0-11.0 min，80-100%b；11.0-12.0 min，100%b；12.0-12.5 min，100-5%b；12.5-13.0 min，5%b；流速为0.3 ml/min；检测波长0-3.5 min为260 nm；3.5-4.0 min为252 nm；4.0-12 min为260 nm，色谱柱柱温为40
°
c；进样量2 μl。
47.实施例2 样品的前处理方法考察1、考察不同比例的提取溶剂取逍遥丸（九芝堂股份有限公司，批号为202007023）粉末10份，每份约0.2 g，精密称定，置于10 ml 容量瓶中，精密分别加入不同的提取溶剂（纯水、30%甲醇-水（v/v）、50%甲醇-水（v/v）、70%乙醇-水（v/v）和纯甲醇）8 ml，每种提取溶剂平行2份，经超声(功率250 w，频率100 khz)提取15 min。取出，放冷至室温，分别用相应的溶剂定容至刻度线。摇匀后置于离心管中，14000 rpm离心10 min，取上清液经uplc分析，测试图谱如图4所示。
48.表1 不同比例提取溶剂的考察
通过比较纯水、30%甲醇-水（v/v）、50%甲醇-水（v/v）、70%乙醇-水（v/v）和纯甲醇作为提取溶剂时的 uplc色谱图和主要色谱峰峰面积，发现用70%甲醇-水（v/v）为提取溶剂时能够兼顾不同极性成分的提取，故最终选择70%甲醇-水（v/v）为供试品溶液制备的提取溶剂。
49.2、考察不同超声时间取逍遥丸（九芝堂股份有限公司，批号为202007023）粉末6份，每份约0.2 g，精密称定，置于10 ml容量瓶中，加入70%甲醇-水（v/v）8 ml分别经超声（功率 250 w，频率100 khz）提取15 min，30 min，45 min，每个提取时间下平行2份，取出，放冷至室温，再用70%甲醇-水定容至刻度线。摇匀后置于离心管中，14000 rpm离心10 min，取上清液经uplc分析，测试图谱如图5所示。
50.表2 不同超声时间考察
通过比较逍遥丸以70%甲醇-水（v/v）超声提取15 min、30 min、45 min后的uplc图谱，发现当超声时间达到15 min时主要色谱峰的就已能够较完整的展示逍遥丸的指纹图谱信息，因此选择15 min为制备供试品溶液的超声时间。
51.综上所述，确定样品的前处理方式为以70%甲醇-水（v/v）作为提取溶剂超声提取15 min。
52.实施例3 供试品溶液的制备取逍遥丸（九芝堂股份有限公司，批号为202007023）研成粉末，取粉末约0.2 g，精密称定，置10 ml容量瓶中，加入70%甲醇－水(v/v) 8 ml，超声（功率250w，频率100khz）处理15 min，取出，放冷至室温，用70%甲醇－水(v/v)定容至刻线，摇匀后置于离心管中，14000 rpm离心10 min，取上清液即得。
53.实施例4 对照品溶液的制备精密称取没食子酸、绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、五没食子酰葡萄糖、洋川芎内酯i、洋川芎内酯h、甘草素、苯甲酰芍药苷、甘草酸、异甘草素、甘草香豆素、藁本内酯、欧当归内酯a溶解于纯甲醇中，得到一定浓度的对照品储备液，分别精密量取一定量所述对照品储备液加70%甲醇－水(v/v)溶剂稀释，制得混合对照品溶液。
54.实施例5 阴性对照溶液取柴胡（广州南北行中药饮片有限公司，批号：200901）、当归（广东时珍制药有限公司，批号：200801）、白芍（广州南北行中药饮片有限公司，批号：200201）、白术（广州南北行中药饮片有限公司，批号：200401）、茯苓（广东时珍制药有限公司，批号：201001）、炙甘草（广州南北行中药饮片有限公司，批号：200403）、姜（广州南北行中药饮片有限公司，批号：200401）和薄荷（广东时珍制药有限公司，批号：190601）各逍遥丸的单味药材研成粉末，取粉末约0.2 g，精密称定，置10 ml容量瓶中，加入70%甲醇－水(v/v) 8 ml，超声（功率250 w，频率100 khz）处理15 min，取出，放冷至室温，用70%甲醇－水(v/v)定容至刻线，摇匀后置于离心管中，14000 rpm离心10 min，取上清液即得。上述8个阴性对照药材色谱图如图6所示。
55.实施例6 逍遥丸uplc指纹图谱分析方法的确证1、仪器精密度试验取同一批次的逍遥丸（九芝堂股份有限公司，批号为202007023）粉末，按实施例2
配制供试品溶液，实施例1中色谱条件连续进样6次记录色谱图。将生成的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2012a版”生成对照指纹图谱并计算各色谱图与对照图谱的相似度值；以芍药苷（8）为内参，分别计算18个主要色谱峰的相对保留时间与相对峰面积rsd%。结果如图7所示，结果显示，各色谱图与对照图谱的相似度值≧0.999，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd%小于3.10%，表明本仪器的精密度良好。
56.2、方法重复性试验取同一批次的逍遥丸（九芝堂股份有限公司，批号为202007023）粉末，按实施例2平行配制供试品溶液6份，实施例1中色谱条件分别进样分析，记录色谱图。将生成的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2012a版”生成对照指纹图谱并计算各色谱图与对照图谱的相似度值；以芍药苷（8）为内参，分别计算18个主要色谱峰的相对保留时间与相对峰面积rsd%。结果如图8所示，结果显示，各色谱图与对照图谱的相似度值大于等于0.999，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd%小于3.74%，表明该方法重复性良好。
57.3、样品稳定性试验取同一批次的逍遥丸（九芝堂股份有限公司，批号为202007023）粉末，按实施例2配制供试品溶液，室温下放置，实施例1色谱条件于0、2、4、8、12、24 h进样分析记录色谱图。将生成的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2012a 版”生成对照指纹图谱并计算各色谱图与对照图谱的相似度值；以芍药苷（8）为内参，分别计算18个主要色谱峰的相对保留时间与相对峰面积rsd%。结果如图9所示，结果显示，各色谱图与对照图谱的相似度值大于等于0.993，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd%小于4.72%，表明供试品溶液24h稳定性良好。
58.具体试验结果参见下表3。
59.表3 精密度、重复性、稳定性考察结果
对精密度、重复性及稳定性相似度考察结果如下表4所示。
60.表4 精密度、重复性、稳定性考察相似度值结果
综上，该方法仪器精密度良好，重现性好，供试品溶液在24h内稳定性良好，能够满足多批次逍遥丸指纹图谱的测试需求。
61.实施例7 多厂家多批次逍遥丸uplc指纹图谱的建立与应用逍遥丸（浓缩丸）为市售制剂（九芝堂股份有限公司s1:202006079、s2:202007023、s3:202008001、s4:202002013、s5:202007016、s6:202007074、s7:202006066、s8:202006050、s9:202006010、s10:202005079，仲景宛西制药股份有限公司：s11:200111、s12:200201、s13:200621、s14:200303、s15:200715、s16:200209、s17:200632、s18:191216、s19:191003、s20:200211，兰州佛慈制药股份有限公司：s21:19k123、s22:19l166、s23:20c60、s24:19k121、s25:19j92、s26:19k133、s27:19l161、s28:18k168、s29:19f49、s30:20c33，湖北瑞华制药有限责任公司：s31:190928、s32:200822、s33:190426、s34:200431、s35:190630、s36:191203、s37:200532、s38:190813、s39:200704、s40:190933）取40批逍遥丸粉末按实施例2平行配制供试品溶液并按实施例1中色谱条件分别进样分析，将生成的40批逍遥丸的色谱图以aia的格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2012a版”，生成对照指纹图谱，该40批市售逍遥丸制剂uplc-pda指纹图谱如图10所示，同时计算各批次逍遥丸指纹图谱的相似度值，具体如下表5所示。
62.表5 多批次逍遥丸相似度评价结果
结果显示，40批逍遥丸与生成的对照指纹图谱的相似度值在0.821-0.961之间，并确定了32个色谱共有峰，如图11所示，以10号峰为内参物，计算得出的该对照指纹图谱共有峰的相对保留时间tr分别是0.29、0.31、0.39、0.43、0.52、0.71、0.74、0.84、0.94、1.00、1.04、1.07、1.12、1.13、1.16、1.18、1.26、1.28、1.30、1.40、1.45、1.48、1.52、1.55、1.57、1.59、1.61、1.66、1.74、1.75、1.84、1.84。
63.其中第1号峰为没食子酸，第6号峰为绿原酸，第9号峰为芍药内酯苷，第10号峰为芍药苷，第13号峰为芹糖甘草苷，第14号峰为甘草苷，第15号峰为五没食子酰葡萄糖，第20号峰为洋川芎内酯i，第21号峰为洋川芎内酯h，第22号峰为甘草素，第24号峰为苯甲酰芍药苷，第26号峰为甘草酸，第27号峰为异甘草素，第28号峰为甘草香豆素，第30号峰为藁本内酯，第32号峰为欧当归内酯a。上述16个化合物混合对照品溶液的色谱图如图12所示，结构式如图13所示。其中第1、9、10、11、12、15、16、24号峰为芍药中的成分，第6、7、17、19号峰为白术中的成分，第20、21、30、31、32为当归中的成分，第2、3、8、13、14、18、22、23、25、26、27、28、29号峰为甘草中的成分，第5、7号峰为薄荷中的成分。
64.将所得的32个共有峰的相对峰面积（以芍药苷为内参物）为变量导入simca 14.1软件对逍遥丸进行无监督的主成分分析（pca），结果如图14-17所示。其中图14显示各个厂家的逍遥丸制剂各自聚在一类，并且从总体来看s1-s30聚为一类，s31-s40聚为一类，说明逍遥丸各厂家之内制剂较稳定，厂家之间存在着微小的差别，最后一个厂家的制剂在取材和工艺上与其他厂家可能不同。
65.为了探究造成这种差异的原因，还对四个厂家的40批逍遥丸进行了监督模式下的正交偏最小二乘法判别分析（opls-da），图15为40批逍遥丸制剂opls-da得分图。从图16可以说明该模型具有良好的稳定性和预测性。
66.进一步结合变量中药性投影（vip）法筛选差异性较大的成分，以 vip＞1.0（图17）作为标准筛选出了9个造成4个厂家多批次逍遥丸制剂差异的主要化学成分，依次为3号峰（来自甘草）、1号峰（没食子酸）、15号峰（五没食子酰葡萄糖）、5号峰（来自薄荷）、30号峰（藁
本内酯）、18号峰（来自甘草）、14号峰（甘草苷）、20号峰（洋川芎内酯i）、23号峰（来自甘草），提示可以加强甘草、芍药、当归在制剂整个生产过程中的控制，有助于逍遥丸质量一致性。
67.综合上述可知，本发明采用超高效液相色谱仪对逍遥丸进行色谱分析，所建立的uplc-pda指纹图谱能够在13min内即实现32个色谱共有峰的表征，能够显著降低现有技术中hplc指纹图谱分析时间。本发明对其中16个主要色谱峰进行了明确的化学指认，覆盖芍药、薄荷、白术、当归、甘草5个组方药味，具备绿色环保、快速高效、重复性好等特点，能够满足大批量样本分析测试需求，为逍遥丸临床应用与质量控制提供技术支持与理论参考。本发明样本前处理快捷、简单，对所构建的指纹图谱方法进行方法学考察，包括仪器精密度试验、方法重复性试验、样品稳定性试验，各试验结果的相似度值均高于0.99，表明该方法能够满足供试品溶液的测试需求，重现性好，可信度高。除此以外，本发明所提供的指纹图谱以及方法能够应用于评价多厂家多批次市售制剂逍遥丸质量，即采用上述的方法建立源自多厂家多批次逍遥丸的对照指纹图谱，然后通过将逍遥丸的指纹图谱与对照指纹图谱进行相似度分析完成逍遥丸市售产品质量一致性评价，进而通过化学计量学分析明晰引起多厂家多批次间市售产品质量差异的关键成分，有助于提高产品质量。
68.以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。