一种用于检测抗链球菌溶血素O抗体的检测试纸条的制作方法

一种用于检测抗链球菌溶血素o抗体的检测试纸条
技术领域
1.本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地涉一种用于检测抗链球菌溶血素o抗体的检测试纸条。


背景技术：

2.抗链球菌溶血素o抗体(anti-streptolysin o，简称aso)，是a群链球菌在人体内的代谢产物之一，它是一种含有-sh基且具有溶血性质的蛋白质，aso能溶解红细胞，在空气中易于被氧化，氧化后可暂时失去溶血能力，被还原剂还原后可重新恢复溶血能力。人体感染溶血性链球菌后，血清中可出现大量抗链球菌溶血素o抗体，从而使血液中的抗链球菌溶血素o浓度升高。aso测定对于诊断a族链球菌感染很有价值，其存在及含量可反映感染的严重程度。人体受链球菌感染后，aso在链球菌感染7-10天开始升高，急性感染后2-3周达到高峰。研究结果表明aso升高会持续很长时间，83.3％的研究对象大于6个月仍有aso升高。aso阳性常见于咽炎，扁桃体炎，肺炎，急性风湿热，风湿性心脏病，链球菌感染相关肾小球肾炎及，链球菌感染后关节炎等疾病。一般来说，85-90％的受到溶血素链球菌感染的患者在感染后15-20天到病愈后的数月或一年血清中都会存在抗链球菌溶血素o，若患者血清中检测出抗链球菌溶血素o，则表明该患者近期感染过溶血性链球菌，因此抗链球菌溶血素o在临床诊断方面具有重要的意义。健康成人aso正常参考值一般为0～200iu/ml，其中少于15-20％的健康人血清中的aso含量高于200iu/ml，儿童正常值为《250iu/ml。
3.目前临床上常规的aso检测方法包括溶血抑制法、胶乳凝集法、酶联免疫法、胶乳颗粒增强免疫比浊法(petia)等。溶血抑制法由于人或动物红细胞不稳定，对溶血素敏感性也不相同，而且操作繁琐、测定结果易受影响，重复性差。胶乳凝集法采用血清和胶乳试剂相混合，根据有无凝集肉眼判断结果，此法易受人为因素和外界影响，而且只能定性检测。酶联免疫法测定过程操作复杂，耗时长，不利于临床的推广应用且不适合急诊样本及大数量样本的筛查检测。
4.因此，本领域需要开发一种快速、简单和测定结果准确度高的aso检测方法。


技术实现要素：

5.本发明的目在于提供一种快速、简单和测定结果准确度高的抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条。
6.本发明第一方面提供一种抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条，所述试纸条包括基片以及位于基片上的且沿所述试纸条近端至远端方向依次排列的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫；
7.所述结合垫包括负载链球菌溶血素o的荧光微球；
8.所述的包被膜上包括检测线和质控线，所述的检测线包括链球菌溶血素o，所述的质控线包括链球菌溶血素o。
9.在另一优选例中，所述的检测线负载链球菌溶血素o，所述的质控线负载链球菌溶
血素o。
10.在另一优选例中，所述的样品垫含有加样孔。
11.在另一优选例中，所述检测线与所述质控线平行。
12.在另一优选例中，所述检测线与所述质控线的条带平行。
13.在另一优选例中，所述检测线与质控线的平行间隔5-7mm，交较佳地6mm。
14.在另一优选例中，所述的包被膜包括硝酸纤维素膜。
15.在另一优选例中，所述检测线与质控线均与试纸条上液体流动的方向垂直。
16.在另一优选例中，所述的试纸条为长方形试纸条。
17.在另一优选例中，所述检测线与长方形试纸条的短边平行。
18.在另一优选例中，所述质控线与长方形试纸条的短边平行。
19.在另一优选例中，与所述质控线相比，所述检测线更靠近样品垫。
20.在另一优选例中，所述结合垫通过以下方法制备：
21.(1)取0.8-1.2ml荧光胶乳微粒溶液(含羧基)，加0.8-1.2ml水和1.8-2.2ml0.03-0.07m ph 6.3-6.7pbs缓冲液，超声分散微球，得到荧光微球分散液；
22.(2)取45-55μl edc加入搅拌状态下的荧光微球分散液中，在20-30℃下混匀9-11min后活化，离心得到的沉淀用0.8-1.2ml 0.03-0.07m ph 8.2-8.6pbs缓冲液分散，在超声分散微球后，加入0.7-0.8ml 2.4-2.8mg/ml链球菌溶血素o抗原水溶液，在20-30℃下搅拌11-13h后，离心得到的沉淀用0.8-1.2ml 0.03-0.07m ph7.8-8.2pbs缓冲液分散，然后在超声分散微球，再加1.5-2.5wt％牛血清白蛋白溶液进行封闭，得到荧光微球溶液；
23.(3)取880-910μl荧光微球溶液与4.8-5.2ml荧光微球稀释液，混匀，超声分散，得到负载链球菌溶血素o的荧光微球溶液；
24.(4)将负载链球菌溶血素o的荧光微球溶液以0.5-1.0μl/cm(优选地以0.7-0.9μl/cm，较佳地0.8μl/cm，)的速度划线于硝酸纤维素膜上，干燥得到结合垫。
25.在另一优选例中，所述荧光微球稀释液通过如下组分混合制得：
26.3.8-4.2wt％牛血清白蛋白、3.8-4.2wt％nacl和7.3-7.7wt％海藻糖和溶剂水。
27.在另一优选例中，所述荧光微球稀释液通过如下组分混合制得：
28.3.8-4.2wt％牛血清白蛋白、3.8-4.2wt％nacl、7.3-7.7wt％海藻糖、0.8-1.2wt％防腐剂(如18-22wt％叠氮钠水溶液)、1.8-2.2wt％色素和溶剂水。
29.在另一优选例中，所述结合垫上的划线与检测线平行。
30.在另一优选例中，所述结合垫上的划线与质控线平行。
31.在另一优选例中，所述步骤(4)中，通过喷金仪将负载链球菌溶血素o的荧光微球溶液以0.5-1.0μl/cm(优选地以0.7-0.9μl/cm，较佳地0.8μl/cm，)的速度均匀的喷在硝酸纤维素膜上。
32.在另一优选例中，所述包括链球菌溶血素o的检测线通过以下方法制备：
33.用pbs缓冲液将链球菌溶血素o稀释至1.8-2.2mg/ml，再加入等量的第一划膜稀释液混匀，在包被膜的划线浓度为0.5-1.5μl/cm，干燥得到包括链球菌溶血素o的检测线。
34.在另一优选例中，所述包括链球菌溶血素o的检测线通过以下方法制备：
35.用pbs缓冲液将链球菌溶血素o稀释至1.8-2.2mg/ml，再加入等量的第一划膜稀释液混匀，在包被膜的划线浓度为0.8-1.2μl/cm，干燥得到包括链球菌溶血素o的检测线。
36.在另一优选例中，所述第一划膜稀释液为含有1.8-2.2wt％氯化钠和0.18-0.22wt％海藻糖的pbs缓冲液。
37.在另一优选例中，所述包括链球菌溶血素o的质控线通过以下方法制备：
38.用pbs缓冲液将链球菌溶血素o稀释至550-650iu/ml，再加入等量的第二划膜稀释液混匀，在包被膜划线浓度为0.5-1.5μl/cm，干燥得到包括链球菌溶血素o的质控线。
39.在另一优选例中，所述包括链球菌溶血素o的质控线通过以下方法制备：
40.用pbs缓冲液将链球菌溶血素o稀释至580-620iu/ml，再加入等量的第二划膜稀释液混匀，在包被膜划线浓度为0.8-1.2μl/cm，干燥得到包括链球菌溶血素o的质控线。
41.在另一优选例中，所述第二划膜稀释液为含有1.8-2.2wt％氯化钠和0.18-0.22wt％蔗糖的pbs缓冲液。
42.在另一优选例中，pbs缓冲液的ph为7.0-7.4，较佳地7.2。
43.在另一优选例中，pbs缓冲液的浓度为0.08-0.12m，较佳地0.1m。
44.在另一优选例中，所述划线的速度为95-105mm/s。
45.在另一优选例中，所述的基片包括pvc底板。
46.在另一优选例中，所述样品垫位于硝酸纤维素膜上。
47.在另一优选例中，所述结合垫位于硝酸纤维素膜上。
48.在另一优选例中，所述吸水垫位于硝酸纤维素膜上。
49.在另一优选例中，所述硝酸纤维素膜位于所述基片上。
50.在另一优选例中，所述的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫依次连接。
51.在另一优选例中，液体加入样品垫后将向自动吸水垫的方向移动。
52.在另一优选例中，所述的吸水垫包括吸水纸。
53.在另一优选例中，所述的硝酸纤维素膜上的条带和所述的硝酸纤维素膜是一体的。
54.本发明第二方面，提供一种用于检测抗链球菌溶血素o抗体的试剂盒，所述的试剂盒包括：
55.如本发明第一方面所述的抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条。
56.在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书，所述的说明书记载如下信息：
57.所述的抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条用于检测样品中的抗链球菌溶血素o抗体。
58.本发明第三方面，提供一种如本发明第一方面所述的抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条的用途，用于制备检测样品中抗链球菌溶血素o抗体的检测试剂盒。
59.在另一优选例中，所述的样品包括待测样品。
60.在另一优选例中，所述的样品为血液、血清或血浆。
61.在另一优选例中，所述的样品来源于人。
62.在另一优选例中，所述的检测为体外检测。
63.在另一优选例中，所述的检测为辅助性检测。
64.在另一优选例中，所述的检测为非诊断和非治疗性检测。
65.在另一优选例中，所述的检测为定性和/或定量检测。
66.在另一优选例中，所述的检测为固相双抗原夹心法检测。
67.在另一优选例中，所述的检测通过荧光免疫分析仪进行检测。
68.在另一优选例中，所述检测包括步骤：
69.将待测样品加入到样品垫后，测定检测线(t)和质控线(c)的荧光信号强度，计算检测线(t)与质控线(c)的荧光强度比值(t/c值)，根据t/c值与抗链球菌溶血素o抗体浓度关系对待测样品中的抗链球菌溶血素o抗体浓度进行检测。
70.在另一优选例中，所述的检测为定性或定量检测。
71.在另一优选例中，所述的定量检测包括标准曲线法检测。
72.在另一优选例中，所述的标准曲线法检测包括根据抗链球菌溶血素o抗体标准品浓度与检测线(t)与质控线(c)的荧光强度比值(t/c值)绘制标准曲线。
73.在另一优选例中，所述标准曲线的横坐标为抗链球菌溶血素o抗体标准品浓度，纵坐标为检测线(t)与质控线(c)的荧光强度比值(t/c值)。
74.在另一优选例中，将待测样品中的检测线(t)与质控线(c)的荧光强度比值(t/c值)代入标准曲线中，计算得到待测样品中的抗链球菌溶血素o抗体的含量。
75.本发明第四方面，提供一种检测样品中抗链球菌溶血素o抗体的方法，所述的方法包括用如本发明第一方面所述的抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条检测样品中抗链球菌溶血素o抗体。
76.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
77.图1为免疫层析试纸条的结构示意图；其中，1、样品垫；2、结合垫；3、包被膜；4、检测线；5、质控线；6、吸水纸；7、底板。
78.图2为荧光免疫分析仪和生化分析仪测定血清样本中的aso浓度的对比。
具体实施方式
79.本发明开发了一种抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条，所述试纸条的包被膜上包括检测线和质控线，所述的检测线包括链球菌溶血素o，所述的质控线包括链球菌溶血素o。所述的检测试纸条能够快速、简单检测待测样品中的抗链球菌溶血素o抗体条，所述的检测试纸条用于检测待测样品中的抗链球菌溶血素o抗体的方法省时省力、可直接在荧光免疫分析仪进行操作，方便快捷，测定结果准确度高、能够用于定性和定量检测，能够适用于大批量样本的快速检测。
80.术语
81.除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
82.如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由
……
构成”、“基本上由
……
构成”。
83.如本文所用，术语“slo”是指链球菌溶血素o(streptolysin o)。
84.如本文所用，术语“aso”是指抗链球菌溶血素o抗体(anti-streptolysin o)。
85.如本文所用，术语“edc”是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
86.如本文所用，术语“pbs”、“pbs缓冲液”和“pbs缓冲水溶液”可互换使用。
87.检测试纸条
88.本发明提供一种抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条，所述试纸条包括基片以及位于基片上的且沿所述试纸条近端至远端方向依次排列的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫；
89.所述结合垫包括负载链球菌溶血素o的荧光微球；
90.所述的包被膜上包括检测线和质控线，所述的检测线包括链球菌溶血素o，所述的质控线包括链球菌溶血素o。
91.在本发明的一个优选例中，所述检测线与所述质控线平行。
92.在另一优选例中，所述检测线与所述质控线的条带平行。
93.在本发明的一个优选例中，所述检测线与质控线的平行间隔5-7mm，交较佳地6mm。
94.本发明所述的包被膜可以为硝酸纤维素膜。
95.在本发明的一个优选例中，所述结合垫通过以下方法制备：
96.(1)取0.8-1.2ml荧光胶乳微粒溶液(含羧基)，加0.8-1.2ml水和1.8-2.2ml 0.03-0.07m ph 6.3-6.7 pbs缓冲液，超声分散微球，得到荧光微球分散液；
97.(2)取45-55μl edc加入搅拌状态下的荧光微球分散液中，在20-30℃下混匀9-11min后活化，离心得到的沉淀用0.8-1.2ml 0.03-0.07m ph 8.2-8.6 pbs缓冲液分散，在超声分散微球后，加入0.7-0.8ml 2.4-2.8mg/ml链球菌溶血素o抗原水溶液，在20-30℃下搅拌11-13h后，离心得到的沉淀用0.8-1.2ml 0.03-0.07m ph 7.8-8.2 pbs缓冲液分散，然后在超声分散微球，再加1.5-2.5wt％牛血清白蛋白溶液进行封闭，得到荧光微球溶液；
98.(3)取880-910μl荧光微球溶液与4.8-5.2ml荧光微球稀释液，混匀，超声分散，得到负载链球菌溶血素o的荧光微球溶液；
99.(4)将负载链球菌溶血素o的荧光微球溶液以0.5-1.0μl/cm(优选地以0.7-0.9μl/cm，较佳地0.8μl/cm)的速度划线于硝酸纤维素膜上，干燥得到结合垫。
100.在本发明的一个优选例中，所述荧光微球稀释液通过如下组分混合制得：
101.3.8-4.2wt％牛血清白蛋白、3.8-4.2wt％nacl和7.3-7.7wt％海藻糖和溶剂水。
102.在另一优选例中，所述荧光微球稀释液通过如下组分混合制得：
103.3.8-4.2wt％牛血清白蛋白、3.8-4.2wt％nacl、7.3-7.7wt％海藻糖、0.8-1.2wt％防腐剂(如18-22wt％叠氮钠水溶液)、1.8-2.2wt％色素和溶剂水。
104.在本发明的一个优选例中，所述结合垫上的划线与检测线平行。
105.在本发明的一个优选例中，所述包括链球菌溶血素o的检测线通过以下方法制备：
106.用pbs缓冲液将链球菌溶血素o稀释至1.8-2.2mg/ml，再加入等量的第一划膜稀释液混匀，在包被膜的划线浓度为0.5-1.5μl/cm，干燥得到包括链球菌溶血素o的检测线。
107.在另一优选例中，所述包括链球菌溶血素o的检测线通过以下方法制备：
108.用pbs缓冲液将链球菌溶血素o稀释至1.8-2.2mg/ml，再加入等量的第一划膜稀释液混匀，在包被膜的划线浓度为0.8-1.2μl/cm，干燥得到包括链球菌溶血素o的检测线。
109.在另一优选例中，所述第一划膜稀释液为含有1.8-2.2wt％氯化钠和0.18-0.22wt％海藻糖的pbs缓冲液。
110.在本发明的一个优选例中，所述包括链球菌溶血素o的质控线通过以下方法制备：
111.用pbs缓冲液将链球菌溶血素o稀释至550-650iu/ml，再加入等量的第二划膜稀释液混匀，在包被膜划线浓度为0.5-1.5μl/cm，干燥得到包括链球菌溶血素o的质控线。
112.在另一优选例中，所述包括链球菌溶血素o的质控线通过以下方法制备：
113.用pbs缓冲液将链球菌溶血素o稀释至580-620iu/ml，再加入等量的第二划膜稀释液混匀，在包被膜划线浓度为0.8-1.2μl/cm，干燥得到包括链球菌溶血素o的质控线。
114.在另一优选例中，所述第二划膜稀释液为含有1.8-2.2wt％氯化钠和0.18-0.22wt％蔗糖的pbs缓冲液。
115.在另一优选例中，pbs缓冲液的ph为7.0-7.4，较佳地7.2。
116.在另一优选例中，pbs缓冲液的浓度为0.08-0.12m，较佳地0.1m。
117.在另一优选例中，所述划线的速度为95-105mm/s。
118.在本发明的一个优选例中，所述的基片包括pvc底板。
119.在本发明的一个优选例中，所述的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫依次连接。
120.试剂盒
121.本发明提供一种用于检测抗链球菌溶血素o抗体的试剂盒，所述的试剂盒包括：
122.如本发明所述的抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条。
123.在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书，所述的说明书记载如下信息：
124.所述的抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条用于检测样品中的抗链球菌溶血素o抗体。
125.用途和方法
126.本发明提供一种如本发明所述的抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条的用途，用于制备检测样品中抗链球菌溶血素o抗体的检测试剂盒。
127.本发明还提供一种检测样品中抗链球菌溶血素o抗体的方法，所述的方法包括用如本发明所述的抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条检测样品中抗链球菌溶血素o抗体。
128.在本发明的一个优选例中，所述的样品包括待测样品。
129.在另一优选例中，所述的样品为血液、血清或血浆。
130.在另一优选例中，所述的样品来源于人。
131.在另一优选例中，所述的检测为体外检测。
132.在另一优选例中，所述的检测为辅助性检测。
133.在另一优选例中，所述的检测为非诊断和非治疗性检测。
134.在另一优选例中，所述的检测为定性和/或定量检测。
135.在另一优选例中，所述的检测为固相双抗原夹心法检测。
136.在另一优选例中，所述的检测通过荧光免疫分析仪进行检测。
137.在另一优选例中，所述检测包括步骤：
138.将待测样品加入到样品垫后，测定检测线(t)和质控线(c)的荧光信号强度，计算检测线(t)与质控线(c)的荧光强度比值(t/c值)，根据t/c值与抗链球菌溶血素o抗体浓度关系对待测样品中的抗链球菌溶血素o抗体浓度进行检测。
139.在另一优选例中，所述的检测为定性或定量检测。
140.在另一优选例中，所述的定量检测包括标准曲线法检测。
141.在另一优选例中，所述的标准曲线法检测包括根据抗链球菌溶血素o抗体标准品浓度与检测线(t)与质控线(c)的荧光强度比值(t/c值)绘制标准曲线。
142.在另一优选例中，所述标准曲线的横坐标为抗链球菌溶血素o抗体标准品浓度，纵坐标为检测线(t)与质控线(c)的荧光强度比值(t/c值)。
143.在另一优选例中，将待测样品中的检测线(t)与质控线(c)的荧光强度比值(t/c值)代入标准曲线中，计算得到待测样品中的抗链球菌溶血素o抗体的含量。
144.本发明的主要效果包括：
145.本发明开发一种能够快速、简单检测待测样品中的抗链球菌溶血素o抗体的抗链球菌溶血素o抗体检测试纸条，所述的检测试纸条用于检测待测样品中的抗链球菌溶血素o抗体的方法省时省力、可直接在荧光免疫分析仪进行操作，方便快捷，测定结果准确度高、能够用于定性和定量检测，能够适用于大批量样本的快速检测。
146.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
147.实施例1
148.本实施例1提供一种免疫层析试纸条及其用于测定抗链球菌溶血素o抗体(aso)。
[0149]“slo”是指链球菌溶血素o(streptolysin o)。
[0150]“aso”是指抗链球菌溶血素o抗体(anti-streptolysin o)。
[0151]
1.结合垫制备：
[0152]
1.1荧光微球溶液的制备
[0153]
1.1.1取1ml荧光胶乳微粒溶液(含羧基)(上海朔元生物科技有限公司，0.07μm粒径)，加1ml水和2ml 0.05m ph 6.5 pbs缓冲液，在超声波细胞粉碎仪上超声以充分分散微球，得到荧光微球分散液。
[0154]
1.1.2取50μl edc加入搅拌状态下的荧光微球分散液中，在25℃下混匀10min后活化，离心得到的沉淀用1ml 0.05m ph 8.4 pbs缓冲液分散，在超声波细胞粉碎仪上超声以充分分散微球后，加入0.75ml 2.6mg/ml人slo抗原水溶液，在25℃下搅拌12h后，离心得到的沉淀用1ml 0.05m ph 8.0 pbs缓冲液分散，然后在超声波细胞粉碎仪上超声以充分分散微球，再加2w％牛血清白蛋白溶液进行封闭，置于磁力搅拌器上搅拌混匀封闭，封闭后置于2～8℃存放，得到荧光微球溶液。
[0155]
1.2.结合垫的制备
[0156]
1.2.1荧光微球稀释液通过如下组分混合制得：
[0157]
4wt％牛血清白蛋白、4wt％nacl、7.5wt％海藻糖、1wt％防腐剂(20％叠氮钠水溶液)、2wt％色素(染色色素，红色易于区分喷金区域颜色)和溶剂水。
[0158]
1.2.2取895μl步骤1.1.2制备的荧光微球溶液置于干净的空容器中，加入5ml荧光微球稀释液，涡旋混匀，超声波清洗仪在低于20℃条件下超声分散，得到slo荧光微球溶液；
[0159]
1.2.3将喷金仪电源打开，将喷金仪洗净后，把slo荧光微球溶液在喷金仪中混匀后以0.8μl/cm的速度均匀的喷在硝酸纤维素膜上(间隔20mm)，放于45℃鼓风干燥箱中干燥至少2h，干燥后用裁条机按操作sop进行裁切，得到结合垫，
[0160]
3.包被膜制备
[0161]
3.1检测线：用pbs缓冲液(ph7.2,0.1m)将slo抗原先稀释至2mg/ml，再加入等量的划膜稀释液(含有2wt％氯化钠和0.2wt％海藻糖的0.1m ph7.2 pbs缓冲液)涡旋充分混匀，在硝酸纤维素膜上划线浓度为1μl/cm，划线速度100mm/s。
[0162]
3.2质控线：用pbs缓冲液(ph7.2 0.1m)将slo抗原稀释至600iu/ml，再加入等量的划膜稀释液(含有2wt％氯化钠和0.2wt％蔗糖的0.1m ph7.2 pbs缓冲液)涡旋充分混匀，在硝酸纤维素膜上划线浓度为1μl/cm，划线速度100mm/s；
[0163]
3.3检测线和控制线平行且平行间隔6mm，包被膜划好后放入37℃烘箱，干燥8小时。
[0164]
4.免疫层析试纸条的制备
[0165]
4.1在pvc底板上依次粘贴准备好的样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，如图1所示，检测线、控制线与结合垫上的划线平行，检测线、质控线和结合垫上的划线均与长方形的免疫层析试纸条的短边平行，结合垫和吸水纸搭接在硝酸纤维素膜上，并且紧密相连。在湿度《30％条件下37℃烘24h后，制成免疫层析试纸条，待测样品(如血清)稀释后加入样品垫的样品孔中，在毛细管作用下样品将向吸水纸的方向移动。
[0166]
4.2用切条机将制备好的免疫层析试纸条纵向切成3.85mm宽，将每一试纸条装入塑料卡内，将每一试剂置于铝膜袋中，并加入1g干燥剂1包，热合封口。
[0167]
5.待测样本稀释液的配制
[0168]
称取硼酸1.7g，四硼酸钠2.1g加水溶解，搅拌均匀，加入20g nacl、5ml曲拉通x-405和1ml 20wt％叠氮钠水溶液混匀，用2m盐酸溶液调节ph至8.4，得到待测样本稀释液。
[0169]
6.样本检测
[0170]
取待检测的血清样品加入至待测样品稀释液中，待混合均匀后加入至免疫层析试纸条上进行免疫层析反应，反应10min后在荧光检测器下采用与荧光胶乳微粒相对应的615nm发射光波长进行荧光检测。
[0171]
检测原理
[0172]
采用固相双抗原夹心法免疫试验，质控线线为aso样本高值，检测线为slo抗原，当待检测样本通过加样孔加入之后，待测样本中所含有的aso首先与结合垫上的slo-荧光胶乳微球结合，通过层析作用被固定在硝酸纤维素膜上的slo(即检测线)捕获。
[0173]
7.实验结果
[0174]
7.1标准曲线的制备
[0175]
将人aso校准品依次用人空白血清稀释至0,50iu/ml，100iu/ml,200iu/ml，400iu/ml,和800iu/ml，用稀释液100倍稀释，取100ul滴加于样品垫的加样孔中，每个浓度点设3个重复(检测结果取3次重复的平均值)，膜层析10min之后，使用荧光免疫分析仪通过采集检测线(t)和质控线(c)条带荧光信号强度，计算检测线(t)与质控线(c)的荧光强度比值(t/c值)，建立aso定标曲线，其中y轴为t/c值，x值为aso校准品浓度值，结果如表1所示，线性关系的相关系数r2＝0.9974。
[0176]
表1人血清中的aso浓度与t/c值的线性关系
[0177][0178][0179]
从表1中可以看出，人血清中的aso浓度与检测线(t)与质控线(c)的荧光强度比值(t/c值)具有良好的线性关系，因此，免疫层析试纸条能够准确用于血清中的aso的定量测定。
[0180]
7.2空白限
[0181]
测定空白的待测样本稀释液20次，考察空白限是否满足要求，结果如表2所示。
[0182]
表2空白限
[0183][0184]
从表2中可以看出，空白限符合质量要求。
[0185]
7.3重复性
[0186]
按照“7.1标准曲线的制备”的方法，分别测aso校准品浓度为80iu/ml和300iu/ml样本的t/c值，每个浓度点各测10个重复，将t/c值代入标准曲线计算测定aso浓度，计算两个浓度下试剂的重复性，结果见下表3(技术要求cv《15％)。
[0187]
表3重复性测定
[0188][0189][0190]
从表3中可以看出，高低值两个样本重复性均小于10％，优于市面上的15％的要求，因此，免疫层析试纸条测定aso浓度具有优异的重复性。
[0191]
7.4准确度
[0192]
选用外购朗道质控水平，检测免疫层析试纸条测定的准确度，质控水平68911，68912和68913，取装好的免疫层析试纸条，分别测质控水平68911，68912和68913，每个浓度点各测5个重复，100ul滴于样品垫上，膜层析10分钟之后，使用荧光免疫分析仪通过采集检测线(t)和质控线(c)条带荧光信号强度，将t/c值代入“7.1标准曲线的制备”的标准曲线计算测定浓度，结果见下表4所示(技术要求和靶值的偏差在15％之内单位iu/ml)
[0193]
表4准确度测定
[0194] 12345靶值均值偏差6891182.4283.5282.1485.381.6284.483-1.7％68912146.8155.5145.7139.8143.2146146.20.13％68913292.3289.8310.1305.8290.6288297.23.2％
[0195]
从表4中可以看出，通过和外购布朗道质控的对比，可以看出免疫层析试纸条测定的实验结果具有优异的准确度。
[0196]
7.5临床样本比对
[0197]
比对20个临床血清样本，按照“7.1标准曲线的制备”的方法，使用荧光免疫分析仪通过采集免疫层析试纸条的检测线(t)和质控线(c)条带荧光信号强度，将t/c值代入标准曲线计算测定aso浓度，并与医院生化分析仪测定的aso浓度对比，设定cutoff值200iu/ml，结果见下表5和图2所示，
[0198]
表5荧光免疫分析仪和生化分析仪测定血清样本中的aso浓度的对比
[0199][0200]
从表5和图2中可以看出，采用免疫层析试纸条的荧光免疫分析仪测定的血清样本中的aso浓度与生化分析仪(作为黄金对照)测定的的血清样本中的aso浓度具有高度相关性，表明采用免疫层析试纸条的荧光免疫分析仪能够准确测定样品中的aso浓度。
[0201]
对比例1
[0202]
对比例1采用的免疫层析试纸条同实施例1的免疫层析试纸条，不同点在于使用传统的假c线(羊抗鸡igy)做质控线。
[0203]
采用如实施例1中“7.1标准曲线的制备”的方法测定人血清中的aso浓度与t/c值的线性关系，结果如表6所示。
[0204]
表6 aso浓度与t/c值的关系
[0205][0206]
可以看出，表6中的各个浓度点之间的反差显著小于表1中的各个浓度点之间的反差，尤其是在高aso浓度点，传统的假c线(羊抗鸡igy)做质控线的线性范围不好，尤其是高值点的反差拉不开，显著差于实施例1的免疫层析试纸条的荧光免疫仪分析。
[0207]
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