CXCL14作为生物标志物在结核病诊断中的用途

cxcl14作为生物标志物在结核病诊断中的用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及cxcl14作为生物标志物在诊断结核病中的用途。


背景技术：

2.结核病(tuberculosis,tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,mtb)感染引起的慢性传染性疾病，目前全球mtb感染者占总人口的四分之一。2020年who tb report报道，全球估计每年约1000万人感染mtb，140万人死于tb。中国是30个高负担结核病国家之一，结核病发病率高。因此，必须控制结核病的进展，并进行早期预防、诊断和治疗。
3.如果诊断正确及时，结核病是一种可治愈的感染。但是，延迟诊断或不当治疗，则可能导致复发或升级为耐多药/广泛耐药结核。
4.肺外结核病(包括肠结核、骨结核、关节结核、脑结核、结核性脑膜炎、肾结核、淋巴结核等)，由于症状不典型，不易收集组织标本进行检测，易误诊，延误治疗。此外，结核病与艾滋病合并感染，很难通过常规方法进行诊断；儿童结核病的检测也有其自身的一系列问题，不易诊断。因此，亟需研发新型的结核诊断生物标志物。
5.目前，结核病诊断的主要依据是临床表现和实验室检查。临床体征和症状仅在5-10％的感染个体中发展。结核病主要累及下呼吸道系统，但也可以侵犯肺外组织，包括淋巴结、肾脏、骨骼、关节、中枢神经系统等或导致播散性疾病。影像学检查是一种筛查工具，但只能作为结核病诊断辅助工具，不能提供任何病因学诊断。实验室检查方面，痰涂片抗酸染色，是一种广泛使用的检测抗酸分枝杆菌方法，然而，该方法无法将结核分枝杆菌与其他抗酸杆菌区分开来，并且敏感性低，需要提高痰液中的分枝杆菌含量(5000-10000cfu/ml)。分离培养方法，灵敏度高，但培养周期长，从而延误治疗。2007年，世卫组织批准了液体培养系统用于结核病的鉴定和药敏试验，其检测分枝杆菌及其抗细菌药物的耐药性方面与传统的l-j培养方法一样有效，但该方法仅限于分枝杆菌的初期识别，并且需要额外的测试来鉴定结核分枝杆菌。结核菌素皮肤试验(tst)，也称为mantoux 试验或纯化蛋白衍生物(ppd)试验，原理是依赖于人体对结核菌素抗原产生细胞免疫从而介导的迟发性超敏反应，通过在注射区域48至72小时后测量硬结(≥ 5mm被认为是阳性)，通过硬结直径来检测个体的免疫反应。由于ppd包含多种结核分枝杆菌抗原的复杂混合物，而这些抗原并非结核分枝杆菌的特异性，有些甚至由卡介苗(bcg)疫苗株和非结核分枝杆菌表达，因此该试验的特异性较差。 quantiferon-tb gold(qft)或igra是一种γ干扰素(ifn-γ)释放试验，用于测量细胞介导的免疫反应，igra检测的是之前对结核分枝杆菌抗原的免疫敏感性，并不直接表明宿主中生物体的存在或生存能力，不能预测疾病进展。在过去的几十年里，已经提出了许多分子方法，目前正在使用核酸探针和基因扩增技术诊断分枝杆菌疾病，即:聚合酶链反应(pcr)、链位移扩增(sda)、转录介导扩增 (tma)、分支杆菌噬菌体报告系统、寡核苷酸连接扩增、q-β复制酶扩增。虽其特异性强，灵敏度高，快速简便，但其影响因素很多，容易造成假阳性和假阴性。目前，许多结核分枝杆菌感染病例在临床上仍未得到诊断或被延迟诊断，在
这种情况下，迫切需要我们去寻找更加灵敏特异的诊断标志物。
6.外周血中含有一系列与免疫相关的细胞，如t细胞、b细胞、单核细胞、巨噬细胞等，血浆内蕴含着丰富的蛋白质，通过血液循环到达全身各组织、参与生命过程。在外周血单个核细胞和血浆中筛选出结核病中异常表达的分子，作为生物标志物，并研制相应的辅助诊断试剂盒，将有力推动结核病的早期诊断、监测复发等，具有重要的临床应用价值。


技术实现要素：

7.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供cxcl14作为生物标志物在诊断结核病中的应用，用于解决现有技术中结核病诊断方法敏感性不高、特异性不高或耗时等问题。
8.cxcl14(c-x-c motif chemokine ligand 14)，即趋化因子(c-x-c motif) 配体14，位于人染色体5q31上，分子量为9.4kda，pi＝9.90。
9.可选地，根据受试者体内cxcl14蛋白的表达水平评估结核分枝杆菌感染的严重程度。
10.可选地，受试者体内cxcl14蛋白的表达水平与结核病的存在和/或严重程度正相关。
11.本发明还提供检测cxcl14蛋白的试剂在制备用于诊断或监测结核病的药剂中的用途。
12.可选地，所述试剂通过酶联免疫吸附试验(elisa法)、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法中的至少一种检测cxcl14蛋白的表达量，优选为elisa法。
13.可选地，检测受试者体内cxcl14蛋白的表达水平时，体液样品选自血清、血浆、血液、脑脊液中的至少一种。
附图说明
14.图一显示为本发明实施例1中结核病患者(包括活动性结核病和非活动性结核病患者)和健康体检者血清中cxcl14的表达水平散点图。
15.图二显示为本发明实施例2中根据cxcl14在结核病患者中(包括活动性结核病和非活动性结核病患者)的诊断价值所作的受试者roc曲线，横坐标为 1-特异度，纵坐标为灵敏度。
16.图三显示为本发明实施例3中结核分枝杆菌感染thp-1细胞后cxcl14测定结果图。
具体实施方式
17.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
18.数千年来，结核分枝杆菌折磨着人类，并与人类共同进化。这种病原体成功的部分原因是它能够在宿主体内长期潜伏，并在几个月甚至几十年后重新激活为活动性结核病，因此，临床上常将结核病划分为活动性结核病和非活动性结核病。根据世界卫生组织(who)
指南，活动性结核病是指存在临床症状和体征，以及当前病理、细菌学和/或放射学发现的结核病证据。它由以下一种或多种诊断方法定义：(1)从任何临床标本中如支气管肺泡灌洗、痰液、气管内抽吸物、胸腔积液的培养中鉴定或检测出抗酸杆菌；(2)标本组织学检查为干酪性肉芽肿；(3)使用pcr检测出结核分枝杆菌dna；(4)胸部x线检查结合临床症状。非活动性结核病为tst试验或igra检测阳性的曾经患过结核病的或稳定的影像学异常结果的个体，没有细菌学依据，没有临床症状和(或)放射学证据。
19.本发明适用于各种临床诊断定义上的结核病。
20.本发明重点探究cxcl14在结核病中的应用价值。cxcl14是一种相对较新的趋化因子，具有不同于其他趋化因子的特性。cxcl14可以向局部环境募集各种免疫细胞，在多种肿瘤和感染性疾病中发挥作用。目前用于结核病诊断的实验室指标均存在诸多不足，本发明通过一系列的探究发现，cxcl14可作为结核病诊断的生物标记物。
21.一方面，本发明通过评价cxcl14在结核病诊断中的灵敏度、特异性、roc 曲线下面积等，表明cxcl14在结核病的应用价值；另一方面，通过分析临床活动性结核患者与非活动性结核患者体内的cxcl14浓度初步表明cxcl14在诊断结核病中的应用价值。
22.实施例1
23.结核病患者血清中cxcl14蛋白浓度检测
24.从重庆医科大学附属第一医院收集结核病患者及健康体检者血清标本，所选病例均按照最新国际结核分枝杆菌感染指南中的纳入标准，并通过了重庆医科大学附属第一医院和伦理委员会的审查，患者知情同意(包括签署成人版知情同意书)。收集20例活动性结核病患者、18例非活动性结核病患者和20例健康体检者(hc)的血清样本，将血清样本置于1400
×
g离心7min，之后冻存在﹣80℃，用cxcl14检测试剂盒(novus usa)检测血清标本中cxcl14的表达量，操作方法严格按照试剂盒所附说明书进行。用spss 19.0软件做统计学分析，graphpadprism7.0软件作图。
25.图一显示为本发明实施例1中结核病患者(包括活动性结核病和非活动性结核病患者)和健康体检者血清中cxcl14的表达水平散点图。
26.从图一可以看出，cxcl14在结核病患者血清中的表达水平较健康体检者显著升高，有显著统计学差异(p《0.001)，且cxcl14升高程度与患者疾病严重程度相关，活动性结核病患者血清中cxcl14水平较非活动性结核病患者更高 (p《0.001)。
27.同时，20例活动性结核病患者、18例非活动性结核病患者和20例健康体检者的临床特征统计信息如表1所示。血清中cxcl14表达量与结核病病情活动度的关系如表2所示。结核病患者血清中cxcl14与t-spot的关系如表3所示。
28.表1不同疾病活动度的tb患者的临床特征统计表
[0029][0030][0031][0032]
表2血清中cxcl14表达量与结核病病情活动度的关系
[0033]
表3结核病患者血清cxcl14与t-spot的关系
[0034][0035]
注:p:positive result，阳性结果；n:negative result，阴性结果
[0036]
实施例2
[0037]
roc曲线分析血清cxcl14对结核分枝杆菌感染的诊断效能
[0038]
通过检验科lis系统收集实施例1中的38例结核病患者的实验室指标 cxcl14的检测值，用相关性分析判断cxcl14在结核病患者中的诊断价值，通过 spss19.0软件以灵敏度为纵坐标，以1-特异性为横坐标来绘制受试者工作特征曲线(roc曲线)，并用medcalc 15.8软件计算roc曲线下面积(auc)，如图二所示。得出auc为0.9816(已知auc越接近1，其诊断价值越大)。上述结果说明 cxcl14可以作为结核病的诊断指标。
[0039]
实施例3
[0040]
结核分枝杆菌感染thp-1细胞后cxcl14表达水平的检测
[0041]
实验步骤(1)在超净工作台里将thp-1细胞吸到50ml离心管中，500
×
g离心10min。(2)将细胞沉淀并以细胞生长液重悬，调整密度到2.5
×
105cells/ml，加入pma 母液(使其终浓度为5ng/ml)，加至六孔板中，每孔2ml(5
×
105cells/孔)。放入37℃，5％co2的孵箱培养24h。(3)弃去细胞培养上清，用d-hanks清洗细胞两次，换成新细胞生长液。放入 37℃，5％co2的孵箱培养72h。(4)弃去细胞培养上清，用d-hanks清洗细胞两次，换成新含有结核分枝杆菌细胞生长液。(moi＝10：1)。放入37℃，5％co2的孵箱培养2h，弃去细胞培养上清，用d-hanks清洗细胞两次，换成新细胞生长液。(5)放入37℃，5％co2的孵箱培养，分别在12h、24h、48h后取样，检测cxcl14 细胞因子含量。
[0042]
从图三可以看出经h37rv感染后thp-1细胞中cxcl14表达水平较未受感染细胞显著升高，有显著统计学差异(其中12h组p《0.0001,24h组p＝0.0003,48h 组p《0.0001),并且随着培养时间的延长，thp-1细胞中cxcl14表达水平随之增加。
[0043]
综上所述，一方面，本发明发现cxcl14在结核病患者血清中的含量显著高于健康体检者，并通过roc曲线分析发现cxcl14作为分子生物标志物在结核病的诊断上具有较高的效益。细胞水平h37rv感染后thp-1细胞中cxcl14表达水平较未受感染细胞显著升高。因此，本发明提供cxcl14作为诊断结核病的指标。另一方面，本发明发现cxcl14在活动性结核
病患者血清中的含量显著高于非活动性结核病，cxcl14可作为区分活动性结核病和非活动性结核病的指标和评估结核分枝杆菌感染严重程度的指标。
[0044]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。