一种高特异性测定CK-MM的胶乳增强免疫比浊法试剂盒及其制备方法与流程

80)、triton系列(triton x-100)、peg系列(peg2000、peg6000、peg20000)；其中，triton系列用于抗干扰、防止杂蛋白非特异性吸附干扰反应；peg系列用于促进抗原抗体反应。
14.ck-mb特异性抗体(市售均可)：浓度1-5μg/ml；加入r1后，ck-mb被ck-mb抗体提前反应掉，防止影响ck-mm的测定，从而显著提高检测灵敏度和检测范围；出于降低成本的考虑，ck-mb特异性抗体可采用多抗。
15.具体地，试剂r1中包括：5-50mmol/l tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、mops缓冲液、tricine缓冲液、mes缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种；0.5-2g/l edta-二钠；5-40g/l蔗糖、海藻糖、甘露醇中的一种；0.5-5.0g/l nacl或kcl；1.0-5.0g/l非离子型表面活性剂；ck-mb特异性抗体；ph为7.5-8.0。
16.更具体地，所述试剂r1中包括：10-50mmol/l tris-hcl缓冲液、0.2g/l nan3、纯化水、0.5-1g/l edta-二钠、20-40g/l蔗糖、2.0-5.0g/lnacl、0.5-1g/l tween-20、0.5-1g/l peg2000、3.0μg/ml ck-mb特异性抗体；ph为7.5-8.0。
17.在本发明提供的肌酸激酶同工酶检测试剂盒中，所述试剂r2中含有1.0-2.5g/l非离子表面活性剂；3.0-8.0μg/ml ck-mm特异性抗体，0.02-0.3％胶乳微球。
18.在本发明提供的肌酸激酶同工酶检测试剂盒中，所述试剂r2中包括：
19.缓冲液：5-50mmol/l tris-hcl缓冲液(ph＝7.00-9.00)、hepes缓冲液(ph＝6.80-8.20)、mops缓冲液(ph＝6.50-7.90)、tricine缓冲液(ph＝6.00-8.00)、mes缓冲液(ph＝5.00-8.00)、甘氨酸缓冲液(ph＝7.00-8.00)中的一种；
20.防腐剂：0.1-1.0g/l proclin-300、nan3、硫柳汞中的一种；
21.基质：纯化水；
22.金属离子螯合剂：0.5-2.0g/l edta-二钠；
23.稳定剂：5-30g/l蔗糖、海藻糖、甘露醇中的一种；
24.保护剂：0.5-5g/l nacl、kcl中的一种。
25.表面活性剂：1.0-2.5g/l非离子型表面活性剂，例如tween系列(tween-20、tween-80)、triton系列(triton x-100)、多元醇类(丙三醇)：起到均匀分散的目的，防止抗体微球结合物产生聚集发生沉淀；其中，triton系列用于抗干扰、防止杂蛋白非特异性吸附干扰反应。
26.ck-mm特异性抗体(市售均可)(单抗：灵敏度高)：浓度1-10μg/ml；
27.胶乳微球(市售均可)：浓度0.02％-0.3％；粒径选择50-350nm；微球种类单一，均为羧基微球(粒径越小结合的抗体越多)。
28.具体地，本发明提供的肌酸激酶同工酶检测试剂盒中，所述试剂r2中包括：10-50mmol/l tris-hcl缓冲液、0.2g/l nan3、纯化水、0.5-1.0g/l edta-二钠、20-40g/l蔗糖、2.0-5.0g/l nacl、0.5-1.0g/l tween-20、0.5-1g/l peg2000、0.5g/l丙三醇；ph为7.5-8.0；3.0-8.0μg/ml ck-mm特异性抗体，0.2-0.3％胶乳微球。
29.在本发明提供的肌酸激酶同工酶检测试剂盒中，所述肌酸激酶同工酶检测试剂盒还包括样本清洗液，所述样本清洗液中含有atp。
30.本发明提供的肌酸激酶同工酶检测试剂盒中，样本清洗液包括：
31.缓冲液：5-50mmol/l tris-hcl缓冲液(ph＝7.00-9.00)、hepes缓冲液(ph＝6.80-8.20)、mops缓冲液(ph＝6.50-7.90)、tricine缓冲液(ph＝6.00-8.00)、mes缓冲液(ph＝
5.00-8.00)、甘氨酸缓冲液(ph＝7.00-8.00)中的一种；
32.防腐剂：0.1-0.5g/l proclin-300、nan3、硫柳汞中的一种；
33.基质：纯化水；
34.金属离子螯合剂：0.2-1.0g/l edta-二钠；
35.保护剂：0.5-5g/l nacl、kcl中的一种；
36.表面活性剂：0.5-1.5g/l非离子型表面活性剂，例如tween系列(tween-20、tween-80)、triton系列(triton x-100)、peg系列(peg2000、peg6000、peg20000)；其中，triton系列用于抗干扰、防止杂蛋白非特异性吸附干扰反应；peg系列用于促进抗原抗体反应。
37.其他：20-100g/l bsa、2-10mmol/l atp，atp用于抗腺苷酸激酶(ak)的干扰。
38.具体地，所述样本清洗液包括，5-50mmol/l tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、mops缓冲液、tricine缓冲液、mes缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种；0.2-1g/l edta-二钠；0.5-5.0g/l nacl或kcl；0.5-1.5g/l非离子型表面活性剂；20-100g/l bsa、2-10mmol/l atp；ph为7.5-8.0。
39.更具体地，本发明提供的肌酸激酶同工酶检测试剂盒中，所述样本清洗液包括，10-50mmol/l tris-hcl缓冲液、0.2g/l nan3、纯化水、0.5-1.0g/l edta-二钠、0.5-2.0g/l nacl、0.5-1.0g/l tween-20、0.5-1g/l peg2000、50-100g/l bsa、5-8mmol/l atp；ph为7.5-8.0。
40.根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护，上述肌酸激酶同工酶检测试剂盒在提高样本中ck-mm检测灵敏度中，或检测样本中痕量ck-mm中的应用。
41.具体地，本发明提供的肌酸激酶同工酶检测试剂盒可检测的样本为干血滤纸片、血清或尿液。
42.第二方面，本发明提供一种检测干血样本中肌酸激酶同工酶的方法，所述方法中，干血样本洗脱液的组分为10-50mmol/l tris-hcl缓冲液、0.2g/l nan3、纯化水、0.5-1.0g/l edta-二钠、0.5-2.0g/l nacl、0.5-1.0g/l tween-20、0.5-1g/l peg2000、50-100g/l bsa、5-8mmol/latp；ph为7.5-8.0。
43.在本发明提供的方法中，向干血滤纸片样本中添加样本洗脱液，室温震荡孵育，洗脱出样本备用；采用上述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒对样本进行检测；检测仪器为全自动生化分析仪。
44.本发明的有益效果在于：
45.(1)本发明提供一种对将干血滤纸片中的血液样本进行检测的试剂盒。本发明在试剂盒中，增加处理干血滤纸片的样本清洁组件，所述样本清洁组件中添加了atp有助于特异性洗脱出肌酸激酶同工酶。
46.(2)本发明通过单克隆抗体结合一种小粒径羧基胶乳微球，开发出一种高特异性高灵敏度的可同时检测干血滤纸片、血清以及尿液中的肌酸激酶同工酶ck-mm检测试剂盒。与现有技术相比，本试剂盒具有检测灵敏度高、准确度高、特异性强、重复性好、线性范围宽等特点；可适用于新生儿进行性肌营养不良症的筛查及骨骼肌病诊断。
47.(3)本发明可适用于干血滤纸片样本，不受溶血时红细胞释放出ak的影响，使新生儿进行性肌营养不良症筛查实现普及性。本发明提供的样本清洗液将干血滤纸片中的血液样本洗脱并用于试剂盒检测，解决干血滤纸片无法利用全自动生化分析仪进行快速分析的
问题，同时减少了外界因素的干扰，提高待测物与抗体的反应特异性，提高新生儿进行性肌营养不良症的筛选速度。
48.(4)本发明的试剂盒中添加非离子型的表面活性剂，有效的抗乳糜和溶血的干扰，促进抗原抗体反应，同时r1试剂盒中的ck-mb多克隆抗体提前阻断了b亚基对m亚基检测的干扰，进一步提高检测灵敏度、反应特异性以及线性范围，充分避免假性结果的出现，提高检测结果的准确度和可靠度。
附图说明
49.图1是本发明实施例1与对比例1的试剂盒的检测结果相关性图。
50.图2是本发明实施例1与对比例2的试剂盒的检测结果相关性图。
51.图3是本发明实施例1与对比例3的试剂盒的检测结果相关性图。
52.图4是本发明实施例2与对比例3的试剂盒的检测结果相关性图。
53.图5是本发明实施例3与对比例3的试剂盒的检测结果相关性图。
具体实施方式
54.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
55.实施例1
56.本实施例提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其组成成分如下。
57.ck-mm试剂盒组成包括：样本洗脱液、r1试剂、r2试剂。
58.(1)样本清洗液组成包括：50mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、1.0g/l edta-二钠、5.0g/l nacl、1.0g/l tween-20、1.0g/l peg2000、100g/l bsa、8mmol/l atp；
59.(2)r1试剂组成包括：50mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、1.0g/l edta-二钠、40g/l蔗糖、5.0g/l nacl、1.0g/l tween-20、1.0g/l peg2000、5.0μg/ml ck-mb特异性抗体；
60.(3)r2试剂组成包括：50mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、1.0g/l edta-二钠、40g/l蔗糖、5.0g/l nacl、1.0g/l tween-20、1.0g/l peg2000、0.5g/l丙三醇、8.0μg/ml ck-mm特异性抗体；0.3％胶乳微球。
61.实施例2
62.本实施例提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其组成成分如下。
63.ck-mm试剂盒组成包括：样本洗脱液、r1试剂、r2试剂。
64.(1)样本清洗液组成包括：30mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、1.0g/l edta-二钠、2.0g/l nacl、1.0g/l tween-20、0.5g/l peg2000、50g/l bsa、5mmol/l atp；
65.(2)r1试剂组成包括：30mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、1.0g/l edta-二钠、20g/l蔗糖、2.0g/l nacl、1.0g/l tween-20、0.5g/l peg2000、5.0μg/ml ck-mb特异性抗体；
66.(3)r2试剂组成包括：30mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、1.0g/l edta-二钠、20g/l蔗糖、2.0g/l nacl、1.0g/l tween-20、0.5g/l peg2000、
0.5g/l丙三醇、5.0μg/ml ck-mm特异性抗体；0.3％胶乳微球。
67.实施例3
68.本实施例提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其组成成分如下。
69.ck-mm试剂盒组成包括：样本洗脱液、r1试剂、r2试剂。
70.(1)样本清洗液组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、2.0g/l nacl、0.5g/l tween-20、0.5g/l peg2000、50g/l bsa、5mmol/l atp；
71.(2)r1试剂组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、20g/l蔗糖、2.0g/l nacl、0.5g/l tween-20、0.5g/l peg2000、3.0μg/ml ck-mb特异性抗体；
72.(3)r2试剂组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、20g/l蔗糖、2.0g/l nacl、0.5g/l tween-20、0.5g/l peg2000、0.5g/l丙三醇、3.0μg/ml ck-mm特异性抗体；0.2％胶乳微球。
73.对比例1
74.本实施例提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其组成成分如下。
75.ck-mm试剂盒组成包括：样本洗脱液、r1试剂、r2试剂。
76.(1)样本清洗液组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、2.0g/l nacl、0.5g/l tween-20、0.5g/l peg2000、50g/l bsa；
77.(2)r1试剂组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、20g/l蔗糖、2.0g/l nacl、0.5g/l tween-20、0.5g/l peg2000、3.0μg/ml ck-mb特异性抗体；
78.(3)r2试剂组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、20g/l蔗糖、2.0g/l nacl、0.5g/l tween-20、0.5g/l peg2000、0.5g/l丙三醇、3.0μg/ml ck-mm特异性抗体；0.2％胶乳微球。
79.对比例2
80.本实施例提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其组成成分如下。
81.ck-mm试剂盒组成包括：样本洗脱液、r1试剂、r2试剂。
82.(1)样本清洗液组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、2.0g/l nacl、0.5g/l tween-20、0.5g/l peg2000、50g/l bsa；
83.(2)r1试剂组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、20g/l蔗糖、2.0g/l nacl、0.5g/l tween-20、0.5g/l peg2000；
84.(3)r2试剂组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、20g/l蔗糖、2.0g/l nacl、0.5g/l tween-20、0.5g/l peg2000、0.5g/l丙三醇、3.0μg/ml ck-mm特异性抗体；0.2％胶乳微球；
85.对比例3
86.本实施例提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其组成成分如下。
87.ck-mm试剂盒组成包括：样本洗脱液、r1试剂、r2试剂。
88.(1)样本清洗液组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph＝7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、2.0g/l nacl、50g/l bsa、5mmol/l atp；
89.(2)r1试剂组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph为7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、20g/l蔗糖、2.0g/l nacl、3.0μg/ml ck-mb特异性抗体；
90.(3)r2试剂组成包括：10mmol/l tris-hcl缓冲液，ph为7.5-8.0、0.2g/l nan3、纯化水、0.5g/l edta-二钠、20g/l蔗糖、2.0g/l nacl、3.0μg/ml ck-mm特异性抗体；0.2％胶乳微球。
91.实施例4
92.本实施例采用实施例1-3及对比例1-3的试剂盒，分别进行实验评价。
93.本实施例提供试剂r2的配制方法，如下：
94.(1)活化。活化液：5-50mmol/l mes缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，ph＝5.5-8.0；
95.活化过程：活化液、胶乳微球、edc、nhs按照顺序进行添加，搅拌均匀，活化10-30min；其中，edc的浓度为胶乳微球体积的25％-40％；nhs的浓度为胶乳微球体积的25％-80％；
96.(2)偶联。含有胶乳微球的活化液在120w超声波清洗器超声15s，重复两次；向活化液中加入ck-mm特异性抗体，搅拌均匀，37℃恒温搅拌偶联30min-200min；
97.(3)封闭。封闭液：5-50mmol/l mes缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，ph＝5.5-8.0；120-320g/l bsa；
98.过程：步骤(2)中得到的偶联液在120w超声波清洗器超声15s，重复两次；加入封闭液，搅拌封闭15-60min；
99.(4)封闭后在120w超声波清洗器超声15s，重复两次；在12000rpm离心，温度8-15℃；弃去离心上清液，加入r2试剂中的其他组分，再120w超声波清洗器超声15s，重复两次；r2试剂放置于37℃恒温箱老化10-30h；至此试剂r2配制完成。
100.本实施例采用实施例1-3及对比例1-3的试剂盒，进行干血样本的检测，步骤如下：
101.(1)向干血滤纸片样本中添加300μl样本洗脱液，室温震荡孵育120min，作为样本备用；
102.(2)所用检测仪器为日立7180全自动生化分析仪；仪器软件自动计算测定结果并形成检测报告。获得20个样本(范围：0.5ng/ml-300ng/ml)测定结果。
103.实验结果如图1-图5所示，其中，图1为实施例1与对比例1的对比数据。图1显示，在测定不同浓度的ck-mm样本时，对比例1的测定结果呈系统性偏低，且当样本值较低时，会出现零值和负值结果。
104.图2为实施例1与对比例2的相关性结果图，图2表明在测定不同浓度的ck-mm样本时，实施例1测定结果与对比例2测定结果有明显差异；对比例2的测定结果呈系统性偏低，且当样本值较低时，会出现零值和负值结果。
105.图3为实施例1与对比例3的相关性结果图，图3表明在测定不同浓度的ck-mm样本时，实施例1测定结果与对比例3测定结果有明显差异；对比例3的测定结果呈系统性偏低，且当样本值较低时，会出现零值和负值结果。
106.图4为实施例2与对比例3的相关性结果图，图4表明在测定不同浓度的ck-mm样本
时，实施例2测定结果与对比例3测定结果有明显差异；对比例3的测定结果呈系统性偏低，且当样本值较低时，会出现零值和负值结果。
107.图5为实施例3与对比例3的相关性结果图。图5表明在测定不同浓度的ck-mm样本时，实施例3测定结果与对比例3测定结果有明显差异；对比例3的测定结果呈系统性偏低，且当样本值较低时，会出现零值和负值结果。
108.本实施例还对实施例1提供检测试剂盒的检测限、最低检出限和重复性、准确度进行测试。结果显示，本发明提供的检测试剂盒的检测范围：3～5000u/l；最低检出限：0.5u/l；重复性：cv≤10％；准确度：校准品范围内，检测企业参考品的实测值与理论值偏倚在
±
5％范围内。
109.对照组1
110.本对照组提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其组成成分如下。
111.ck-mm试剂盒组成包括：样本洗脱液、r1试剂、r2试剂。样本洗脱液和r1试剂的组分与实施例1中相同，r2试剂中只改变非离子型表面活性剂的用量为0.2g/l tween-20、0.2g/l peg2000、0.2g/l丙三醇。对照组1与实施例1与对比例3的重复性检测结果见表1。
112.表1重复性检测结果
[0113][0114][0115]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。