一种基于H-rGO-PdNPs和AuNPs@rGO纳米材料检测GPC3的方法

一种基于h-rgo-pd nps和au nps@rgo纳米材料检测gpc3的方法
技术领域
1.本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米复合材料结合适配体来检测gpc3的方法。


背景技术：

2.原发性肝细胞癌（hcc）是一种在我国较为常见，容易对人们生命造成威胁的恶性肿瘤。常见的肝癌标志物有甲胎蛋白（afp）、gpc3（磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3）、高尔基体蛋白73（gp73）等。gpc3检测方法主要有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法、流式免疫分析法、电化学免疫传感器、压电免疫传感器等。公开号cn 105717104 b的发明专利，涉及一种利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血，进而检测肝细胞癌患者外周血gpc3表达情况的方法。公开号cn 105759051 b的发明专利，涉及一种以吖啶酯为发光标记物的纳米磁微球化学发光免疫分析gpc3的定量分析试剂盒。这些方法所用仪器昂贵、操作复杂、费时且技术要求较高，因此，需要建立一种快速、操作简便的gpc3检测方法。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是提供一种非诊断目的基于血红素-还原氧化石墨烯-纳米钯（h-rgo-pd nps）和纳米金@还原氧化石墨烯（au nps@rgo）的纳米材料，构建夹心型适配体电化学传感器，实现gpc3检测，最低检测限为2.12 μg/ml。
4.为解决该技术问题，利用h-rgo-pd nps纳米材料为载体，结合gpc3适配体（gpc3
apt
）制备出h-rgo-pd nps-gpc3
apt
信号探针；将au nps@rgo通过电沉积技术修饰在活化后的丝网印刷电极（spe）上，通过吸附作用将gpc3抗体（gpc3
ab
）固定在电极表面；由于gpc3与gpc3
ab
和gpc3适配体能够特异性结合形成稳定的结构，构建了h-rgo-pd nps-gpc3
apt
/gpc3/gpc3
ab
/au nps@rgo/spe夹心型适配体电化学传感器；利用h-rgo-pd nps纳米材料高效的类过氧化物酶性质催化h2o2与agno3反应，使纳米银粒子（ag）沉积于传感器表面，采用电化学工作站的微分脉冲伏安法（dpv）记录其峰电流，从而实现gpc3的检测。
5.本发明按照以下步骤进行：步骤1：h-rgo-pd nps-gpc3
apt
信号探针的制备(1)氧化石墨烯（go）溶液的制备氧化石墨烯（go）分散在纯水中，超声离心，除去go颗粒，得go溶液；(2)血红素-还原性氧化石墨烯（h-rgo）的制备将go溶液与血红素（hemin）水溶液均匀混合，加入氨水及水合肼溶液，振荡后水浴，离心、清洗，得h-rgo溶液；作为改进，还包括以下步骤：(3)h-rgo-pd nps的制备
将pdda（聚二甲基二烯丙基氯化铵）和nacl加到h-rgo溶液中搅拌，离心清洗，再加入乙二醇，用naoh调节混合溶液的ph值；离心、清洗、干燥即得h-rgo-pd nps固体；(4)h-rgo-pd nps-gpc3
apt
信号探针的制备将氨基gpc3适配体（gpc3
apt
）溶液和h-rgo-pd nps溶液超声均匀混合，孵育，离心、清洗，去除游离的适配体，即得h-rgo-pd nps-gpc3
apt
信号探针。
6.步骤2：电极的修饰与传感界面的构建(1)将丝网印刷电极（spe）放入h2so4中活化；(2)将活化好的spe置入氯金酸（haucl4）和rgo的混合溶液中，进行电沉积，得au nps@rgo/spe电极；(3)将gpc3
ab
滴加在au nps@rgo/spe电极的表面，孵育，清洗，得gpc3
ab
/au nps@rgo/spe；进一步，步骤2中所述用于沉积的haucl4溶液为0.05%，rgo溶液浓度为1.0 mg/ml，沉积电位为-0.5 v，沉积时间120 s；步骤3：gpc3工作曲线的绘制(1)将gpc3标准溶液滴加到步骤2得到的传感界面（gpc3
ab
/au nps@rgo/spe）上，孵育，清洗，得gpc3/gpc3
ab
/au nps@rgo/spe；(2)在gpc3/gpc3
ab
/au nps@rgo/spe上滴加h-rgo-pd nps-gpc3
apt
信号探针溶液，孵育，清洗，得h-rgo-pd nps-gpc3
apt
/gpc3/gpc3
ab
/au nps@rgo/spe；(3)在h-rgo-pd nps-gpc3
apt
/gpc3/gpc3
ab
/au nps@rgo/spe上滴加h2o2和agno3溶液，避光反应，清洗，得工作电极（ag/h-rgo-pd nps-gpc3
apt
/gpc3/gpc3
ab
/au nps@rgo/spe），备用；(4)将工作电极浸入到kno
3-hno3溶液中，采用电化学工作站的dpv进行扫描，记录传感器的响应电流值；(5)分别对不同浓度的gp73标准溶液进行检测，记录峰电流；根据传感器的电流响应值与gpc3浓度的关系，绘制工作曲线；计算出该方法的最低检测限。
7.步骤4：实际血清样本中gpc3的检测(1)将实际人血清样本与gp73标准溶液以1:1的比例充分混合，制成待测混合液，在步骤2制备的传感界面滴加待测混合液，孵育，清洗。而后滴加h-rgo-pd nps-gpc3
apt
检测探针，孵育，洗涤，再次滴加h2o2和agno3溶液，避光反应，清洗，得到工作电极，晾干备用；(2)用待测混合液制备的工作电极浸入到kno
3-hno3溶液中，采用电化学工作站的dpv进行扫描，记录响应电流值；(3)根据步骤3所得到的gpc3的工作曲线，计算实际血清样本中gpc3的浓度。
8.作为优选：步骤3和步骤4中所述电极的孵育温度为25
ꢀ°
c，孵育时间为1 h；步骤3和步骤4中所述kno
3-hno3溶液中kno3浓度为0.6 mol/l，hno3浓度为0.1 mol/l；步骤3和步骤4中所述的扫描范围为-0.2 v~0.4 v，扫描速率为0.1 v/s。
9.其中，步骤1制备一种具有大比表面积和高电子转移效率的h-rgo-pd nps-gpc3
apt
信号探针；步骤2构成特异性识别gpc3的生物传感界面，是步骤3和步骤4中gpc3的电化学检
rgo-pd np纳米复合材料。
17.采用jem-1200ex型透射电子显微镜（tem）对纳米材料进行表征，如图2所示。图2a为h-rgo的tem图，呈褶皱膜状结构；图2b为h-rgo-pd nps的tem图，图2b可以看到h-rgo-pd nps表面比h-rgo表面增加了许多形状较均匀的深色颗粒，即pd粒子；证明pd nps已成功附着在h-rgo表面，表明h-rgo-pd nps纳米复合材料构建成功。
18.(3)将100.0 μl的氨基gpc3适配体（gpc3
apt
，5'
‑ꢀ
nh
2-taacgctgaccttag ctgcatggctttacatgttcca-3'）溶液和200.0 μl的h-rgo-pd nps溶液混合，孵育，洗涤，除去游离的适配体，即得h-rgo-pd nps-gpc3
apt
信号探针。
19.2、电极的修饰与生物传感界面的构建(1)将活化后的电极（spe）浸入0.5 mol/l的h2so4中，在-0.4 v~1.2 v的扫描电压下以进行cv扫描20圈；将活化后的spe电极置入5.0 ml含有0.05%的haucl4溶液和1.0 mg/ml 的rgo溶液的混合液溶液中，以-0.5 v恒电位沉积，沉积完成后用纯水清洗3次，吹干，得au nps@rgo/spe。
20.(2)将1.0 μl 100.0 μg/ml的gpc3抗体溶液（gpc3
ab
）滴加在au nps@rgo/spe的表面，孵育、冲洗；在au nps@rgo/spe表面滴加6 .0μl bsa（1.0%）溶液，封闭30 min，清洗、晾干，得到gpc3
ab
/au nps@rgo/spe。
21.采用日本日立公司生产得su8020扫描电镜（sem）对电极表面不同修饰过程进行表征，如图3所示。图3a为裸电极，表面形状较平整；图3b为au nps@rgo/spe的sem图，表面存在一种颜色较深和另一种较闪亮的两种均匀颗粒，说明au和rgo成功沉积到裸电极上；图3c为gpc3
ab
/au nps@rgo/spe的sem图，表面增加了一些白色膜状物，说明gpc3
ab
已成功修饰到电极上。
22.3、gpc3工作曲线的绘制(1)在步骤（2）构建的gpc3
ab
/au nps@rgo/spe传感界面上滴加3.0 μl gpc3标准溶液（不同浓度），孵育，洗涤，晾干，得到gpc3/gpc3
ab
/au nps@rgo/spe。
23.(2)滴加4.0 μl的h-rgo-pd nps-gpc3
apt
检测探针溶液，孵育1 h后，滴加6.0
ꢀµ
l h2o2和3.0
ꢀµ
l agno3溶液，室温下避光反应30 min，洗涤，晾干，得工作电极ag/h-rgo-pd nps-gpc3
apt
/gpc3/gpc3
ab
/au nps@rgo/spe。
24.图3d电极表面增加了一些白色球状物，说明gpc3已经孵育到电极上。图3e中电极表面较为平整，可见褶皱膜状物，说明h-rgo-pd nps-gpc3
apt
已经成功孵育到电极上。图3f为ag/h-rgo-pd nps/gpc3
apt
/gpc3/gpc3
ab
/au nps@rgo/spe，电极表面呈现褶皱膜状物，且覆盖有银白色闪亮颗粒，即大量银粒子沉积到电极表面。通过以上结果可说明，au nps@rgo、gpc3
ab
、gpc3、h-rgo-pd nps-gpc3
apt
和ag皆逐一修饰到了电极表面。
25.(3)将上述的工作电极浸入到0.6 mol/l kno3和0.1 mol/l hno3的kno
3-hno3溶液中，采用chi660e电化学工作站中的差分脉冲伏安法(dpv)扫描，记录其峰电流，不同浓度gpc3的dpv图谱如图4a所示，由图4a可知，随着gpc3浓度的增加，传感器的相应电流增大。当gpc3浓度在10.0μg/ml-100.0μg/ml范围内，gpc3浓度（x）与传感器响应电流（y）呈线性相关（见图4b），工作曲线方程为 y=0.12775x+23.89707，相关系数(r
²
)为0.98293。通过公式c
lod
=3sb/b计算得到传感器的检测限为2.12 μg/ml。
26.4、实际血清样本中gpc3的检测
(1)分别取三份正常人血清和50.0 μg/ml，80.0 μg/ml，100.0 μg/ml三种不同浓度的gpc3标准溶液进行等比例均匀混合，配制成待测混合液。
27.(2)在步骤2构建的电化学生物传感界面上滴加3.0 μl待测混合液，而后滴加4.0 μl的h-rgo-pd nps-gpc3
apt
检测探针溶液，孵育1 h后，滴加6.0
ꢀµ
l h2o2和3.0
ꢀµ
l agno3溶液，室温下避光反应30 min，清洗，得工作电极，晾干备用。
28.(3)使用电化学工作站用dpv对工作电极测量3次并记录电流值。
29.(4)根据步骤3的工作曲线方程y=0.12775x+23.89707，计算可得到对应的实际血清样本中gpc3的浓度，检测结果见表1。其回收率在103.78-106.52%，相对标准偏差为1.89-8.81%。这些结果表明，所开发的gpc3夹心型电化学传感器具有较好的应用前景，可望用于实际临床血清样品的gpc3检测。
30.表1 实际血清样本中gpc3的浓度（注：实际人血清样本由中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院提供）。