一种棘球蚴抗体免疫层析试纸条和检测卡的制作方法

1.本发明涉及一种医学检测装置，具体涉及一种棘球蚴抗体免疫层析试纸条和检测卡。


背景技术：

2.棘球蚴病(也叫包虫病)是由棘球绦虫及其幼虫(棘球蚴)寄生于人、兽体内引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病。目前已知的棘球蚴病中，对人体和社会经济危害最严重的是细粒棘球蚴病(cystic echinococcosis，ce)和多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis，ae)。该病在我国青藏高原地区高度流行，是国家重点防治的寄生虫病。流行区普遍存在经济欠发达，自然条件恶劣，交通不便，工作成本高，卫生专业技术人员匮乏的问题。亟需提高防治的技术水平和工作效率。
3.棘球蚴在人体呈封闭性寄生，类“肿瘤”样生长，主要侵染肝脏(约占临床病例70％)。目前的首选诊断方法是医学影像法，以b超应用最为广泛。但该方法对检验人员的技术水平及经验要求高，且对于小于2cm的或非典型性包囊的临床误诊率高，需要采用免疫学方法进行辅助诊断。免疫学检测的敏感性和特异性对患者的及时发现与治疗后随访也起到了重要作用；对流行区的流行病学调查、防治规划的制定及防治效果的考核免疫学诊断更具有重要的参考价值。目前的棘球蚴抗体检测试剂以elisa法最为常用且较敏感，但该方法需要2～3小时才能得出检测结果，用时较长，还需要配有一定的实验设备和实验技能人员进行操作，用于边远地区的包虫病现场调查有一定困难。而免疫层析快检试纸条法比elisa法更实用，不但具有较好的敏感度和特异度，而且操作更为简便、快速，无需特殊仪器设备，结果判读容易，特别适合基层临床检测和流行病学调查。
4.目前，市场上销售的棘球蚴抗体诊断试剂中多数使用的是天然虫体抗原，天然材料的获得不够便利，且很难进行标准化，导致试剂的批间差异较大，且与囊虫病等其他寄生虫病存在较高交叉反应，诊断特异性和稳定性欠佳。有研究尝试采用重组抗原来代替天然抗原，但往往检测敏感性低，这是因为在检测中只采用单一抗原进行检测，导致检测灵敏度差，容易漏检。因此，导致这些报道的重组抗原未能实际应用于棘球蚴病的检测；或者必须与天然抗原结合，共同应用才能进行检测。


技术实现要素：

5.为了提升包虫病的检测准确度，本发明公开了一种棘球蚴抗体免疫层析试纸条，包括硝酸纤维素膜；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线组和质控线；所述检测线组包括分别包被不同重组棘球蚴抗原的t1检测线、t2检测线和t3检测线；结果判定规则为：
①
质控线和任意2条或以上检测线都显色，判定结果为阳性；
②
质控线显色而检测线均不显色，或者质控线显色而检测线仅一条显色，判定结果为阴性；
③
质控线不显色，无论检测线是否显色，均表示所述棘球蚴抗体免疫层析试纸条失效，应该重新检测。
6.在一些实施方案中，还包括金标垫；所述金标垫是玻璃纤维膜，其上固定有胶体金
标记的链球菌g蛋白或胶体金标记的金黄色葡萄球菌蛋白a；当所述金标垫上固定的是胶体金标记的链球菌g蛋白时，所述质控线上包被的是金黄色葡萄球菌蛋白a；当所述金标垫上固定的是胶体金标记的金黄色葡萄球菌蛋白a时，所述质控线上包被的是链球菌g蛋白；所述金标垫与所述硝酸纤维素膜端部重叠连接；所述重组棘球蚴抗原包括重组棘球蚴抗原em18(参考文献：jiang l,xu xn,li x,xue hc,feng z.identification of the immunodominant regions of the em18antigen and improved serodiagnostic specificity for alveolar echinococcosis[j].parasite immunol，2004，26(10)：377-85)、重组棘球蚴抗原egcystatin(一种细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(echinococcus granulosus cystatin，授权专利：一种新的棘球蚴病诊断抗原及其应用；2016-2-4,中国,zl201610081438.6)和重组棘球蚴抗原agb1(参考文献：rott mb,fern
á
ndez v,farias s,ceni j,ferreira hb,haag kl,zaha a.comparative analysis of two different subunits of antigen b from echinococcus granulosus:gene sequences,expression in escherichia coli and serological evaluation[j].acta trop.2000，75(3)：331-40)。
[0007]
在一些实施方案中，还包括样品垫、吸水垫和底板；所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸水垫依次端部重叠连接在所述底板上，其中所述硝酸纤维素膜的两端在重叠连接中均设置的紧贴所述底板的位置；所述检测线组到所述金标垫的距离短于所述质控线到所述金标垫的距离；所述样品垫为滤血膜；检测的样本选自血清、血浆、全血、组织液、尿液、唾液、粪便中的一种或多种。
[0008]
另一方面，本发明还公开了一种棘球蚴抗体免疫层析检测卡，包括壳体和如上所述的棘球蚴抗体免疫层析试纸条；所述壳体上依次设置有：
[0009]
登记记录区，用于记录信息，所述信息包括样本信息、检测日期和检测结果；
[0010]
观察窗口，用于观察设置在所述壳体内的试纸条的免疫层析情况；
[0011]
加样孔，用于加样到设置在所述壳体内的试纸条上。
[0012]
进一步地，所述登记记录区上设置有镂空孔。
[0013]
在一些实施方案中，所述壳体上还设置有凸起点区，用于握持所述免疫层析检测装置；所述壳体包括第一端部和第二端部；在所述第一端部和所述第二端部之间依次设置有所述凸起点区、所述登记记录区、所述观察窗口和所述加样孔。
[0014]
在一些实施方案中，所述壳体内表面的底部设置有试纸条定位板和试纸条侧面定位柱；所述试纸条侧面定位柱设置在所述试纸条定位板的两侧；所述壳体内表面的顶部设置有试纸条顶部定位柱，使得所述试纸条顶部定位柱能够压在所述试纸条定位板上的试纸条上。
[0015]
在一些实施方案中，所述试纸条侧面定位柱的数量为4～10根，平分成2列设置在所述试纸条定位板的两侧。
[0016]
优选地，试纸条侧面定位柱的数量为6根，平分成2列设置在试纸条定位板的两侧。
[0017]
进一步地，壳体包括：闭合形态，用于检测和运输；开启形态，用于取放试纸条。
[0018]
在一些实施方案中，所述壳体包括上壳体和下壳体；所述上壳体的内表面上设置有卡壳定位柱；所述下壳体的内表面上匹配设置有卡壳定位孔，用于插入所述卡壳定位柱，连接所述上壳体和所述下壳体，使得所述壳体呈闭合形态。当卡壳定位柱从卡壳定位孔中
抽离时，使得壳体呈开启形态。
[0019]
在一个或多个具体实施方式中，壳体包括上壳体和下壳体；上壳体的一侧通过铰链与下壳体的一侧连接，上壳体盖合在下壳体上，使得壳体呈闭合形态。
[0020]
在一些实施方案中，所述卡壳定位孔和所述卡壳定位柱的数量相同，均为4～12个。优选地，卡壳定位孔和卡壳定位柱的数量相同，均为8个。
[0021]
在一些实施方案中，所述加样孔呈上宽下窄的漏斗状，正对设置在所述壳体内的试纸条的样品垫。
[0022]
在一些实施方案中，所述检测线和所述质控线能够通过所述观察窗口观察到。样本信息包括样本名称、样本来源和样本编号中的一种或者多种。检测窗口上设置有透明板。
[0023]
进一步地，镂空孔排列成两行，将登记记录区分隔成三行，分别用于记录样本信息、检测日期和检测结果。
[0024]
进一步地，凸起点区位于壳体上表面的左上角，呈1/4圆弧状。
[0025]
本发明通过采用3种重组棘球蚴抗原进行检测试纸条的制备，稳定了诊断试剂的质量。分别采用商品化elisa包虫病抗体检测试剂盒和本发明的棘球蚴抗体免疫层析检测卡检测囊虫病人血清，elisa试剂盒与囊虫病的交叉反应为67％(18/27)，而本发明未检测到任何交叉反应(0/20)，因此采用重组棘球蚴抗原可以降低与囊虫病等其他寄生虫病的交叉反应，提高试剂的诊断效能和标准化。通过三个抗原的联合检测，采用新的检测结果判定规则，提高了检测的准确度。同时，检测时间仅需不超过30分钟，且对全血，血清，血浆样本均可以进行检测，大大提高了诊断效率，便利了检测操作。
[0026]
本发明由于在检测中使用了3个检测抗原(即检测线)，并规定其中任意2条或以上检测线都显色，判定为阳性。该判定方法与单一重组抗原检测相比，提高了检测结果的准确度，敏感性和特异性均存在统计学差异(χ
敏感性2
＝10.714，p《0.05；χ
特异性2
＝4.138，p《0.05)。本发明检测时操作更为简便、快速，无需特殊仪器设备，结果判读容易。
[0027]
本发明提供了一种棘球蚴抗体免疫层析检测卡，单份试纸条采用独立包装的规格，有利于包虫病抗体检测试纸条单份独立包装并长期保存；通过采用多种重组抗原代替天然抗原进行包虫病抗体检测，抗原生产制备简便，易于质量控制，生产成本低，有利于提高试剂的诊断效能和标准化；同时记录样本信息和检测结果，有利于图文信息存档，便于查找；观察窗口的设置，有利于观察检测结果；漏斗状加样孔的设置，有利于样本和缓冲液集中汇集于样品垫而不侧漏；上壳体和下壳体匹配设置，有利于试纸条单份独立包装并长期保存；试纸条定位板、试纸条侧面定位柱和试纸条顶部定位柱，有利于固定试纸条，避免运输过程中试纸条上下左右晃动，偏离；镂空孔可将试纸条吸水垫与外界空气相通，有利于与硝酸纤维素膜同步水分挥发，避免吸水垫上的液体回流至硝酸纤维素膜而导致试纸条检测区域(检测线所在区域)背景颜色变红。
[0028]
本发明的棘球蚴抗体免疫层析试纸条和检测卡用于包虫病人血清抗体检测试剂盒，包被多种重组抗原进行包虫病抗体检测。本发明结构简单合理，易于包虫病抗体检测试纸条批量生产、独立包装和长期保存，适合包虫病流行区现场快速诊断，检测准确度高，检测成本低，有利于大规模人群包虫病抗体筛查。使用本发明时，采用多种重组抗原代替天然抗原，稳定了诊断试剂的质量，降低了与囊虫病等其他寄生虫病的交叉反应，提高试剂的诊断效能和标准化。同时，检测时间在30分钟以内，大大提高了诊断效率。
[0029]
本发明收到以下基金的资助：国家重点研发计划项目(no.2021yfc2300800,2021yfc2300803)，国家卫生健康委包虫病防治研究重点实验室(no.2021wzk1003)，上海市卫健委面上项目(no.201840133,no.201940302)。
[0030]
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
[0031]
图1是棘球蚴抗体免疫层析试纸条俯视图及侧视图。
[0032]
图2是棘球蚴抗体免疫层析试纸条结构示意图。
[0033]
图3是棘球蚴抗体免疫层析检测卡内部整体结构示意图。
[0034]
图4是棘球蚴抗体免疫层析检测卡装配示意图。
[0035]
图5是棘球蚴抗体免疫层析检测卡上、下壳体示意图。
[0036]
图6是棘球蚴抗体免疫层析检测卡立体图。
[0037]
其中，1-试纸条；2-壳体；3-硝酸纤维素膜；4-样品垫；5-吸水垫；6-底板；7-金标垫；8-检测线组；9-质控线；10-下壳体；11-上壳体；12-观察窗口；13-加样孔；14-卡壳定位柱；15-卡壳定位孔；16-试纸条侧面定位柱；17-镂空孔；18-试纸条定位板；19-登记记录区；20-凸起点区；21-第一端部；22-第二端部；23-试纸条顶部定位柱。
具体实施方式
[0038]
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
[0039]
须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
[0040]
实施例1棘球蚴抗体免疫层析试纸条
[0041]
图1和2示出了本发明棘球蚴抗体免疫层析试纸条的一个具体实施例，在该实施例中，该棘球蚴抗体免疫层析试纸条，包括底板6和依次端部重叠连接在底板6上的样品垫4、金标垫7、硝酸纤维素膜3、吸水垫5。其中硝酸纤维素膜3的两端在重叠连接中均设置的紧贴底板6的位置，即金标垫7的一端和吸水垫5的一端分别压在硝酸纤维素膜3的两端(如图1所示)。
[0042]
金标垫7是玻璃纤维膜，其上固定有胶体金标记的链球菌g蛋白或胶体金标记的金黄色葡萄球菌蛋白a。
[0043]
硝酸纤维素膜3上设置有检测线组8和质控线9。检测线组8到金标垫7的距离短于质控线9到金标垫7的距离。
[0044]
检测线组8包括分别包被不同重组棘球蚴抗原的t1检测线、t2检测线和t3检测线。该重组棘球蚴抗原包括重组棘球蚴抗原em18、重组棘球蚴抗原egcystatin和重组棘球蚴抗原agb1。重组棘球蚴抗原em18、重组棘球蚴抗原egcystatin和重组棘球蚴抗原agb1与t1检
测线、t2检测线和t3检测线任意匹配对应。即可以有6种组合：1)t1检测线、t2检测线和t3检测线分别包被重组棘球蚴抗原em18、重组棘球蚴抗原egcystatin和重组棘球蚴抗原agb1；
[0045]
2)t1检测线、t2检测线和t3检测线分别包被重组棘球蚴抗原agb1、重组棘球蚴抗原em18和重组棘球蚴抗原egcystatin；
[0046]
3)t1检测线、t2检测线和t3检测线分别包被重组棘球蚴抗原egcystatin、重组棘球蚴抗原agb1和重组棘球蚴抗原em18；
[0047]
4)t1检测线、t2检测线和t3检测线分别包被重组棘球蚴抗原egcystatin、重组棘球蚴抗原em18和重组棘球蚴抗原agb1；
[0048]
5)t1检测线、t2检测线和t3检测线分别包被重组棘球蚴抗原em18、重组棘球蚴抗原agb1和重组棘球蚴抗原egcystatin；
[0049]
6)t1检测线、t2检测线和t3检测线分别包被重组棘球蚴抗原agb1、重组棘球蚴抗原egcystatin和重组棘球蚴抗原em18；
[0050]
当金标垫7上固定的是胶体金标记的链球菌g蛋白时，质控线9上包被的是金黄色葡萄球菌蛋白a；当金标垫7上固定的是胶体金标记的金黄色葡萄球菌蛋白a时，质控线9上包被的是链球菌g蛋白。
[0051]
样品垫4为滤血膜。检测的样本可以为血清、血浆和全血。
[0052]
实施例2棘球蚴抗体免疫层析检测卡
[0053]
图3～6示出了本发明的一个具体实施例，在该实施例中，棘球蚴抗体免疫层析检测卡包括壳体2和试纸条1。壳体2包括第一端部21和第二端部22。在第一端部21和第二端部22之间，壳体2上依次设置有：凸起点区20，用于握持免疫层析检测装置；登记记录区19，用于记录信息，所述信息包括样本信息、检测日期和检测结果；观察窗口12，用于观察设置在壳体2内的试纸条1的免疫层析情况；加样孔13，用于加样到设置在壳体2内的试纸条1上。
[0054]
凸起点区20位于壳体2上表面的左上角，呈1/4圆弧状。
[0055]
登记记录区19上设置有镂空孔17。镂空孔17排列成两行，将登记记录区19分隔成三行，分别用于记录样本信息、检测日期和检测结果。
[0056]
加样孔13呈上宽下窄的漏斗状，正对设置在壳体2内的试纸条1的样品垫4。
[0057]
壳体2内表面的底部设置有试纸条定位板18和试纸条侧面定位柱16；试纸条侧面定位柱16设置在试纸条定位板18的两侧；壳体2内表面的顶部设置有试纸条顶部定位柱23，使得试纸条顶部定位柱23能够压在试纸条定位板18上的试纸条1上。试纸条侧面定位柱16的数量为6根，平分成2列设置在试纸条定位板18的两侧。
[0058]
壳体2包括：闭合形态(如图3所示)，用于检测和运输；开启形态(如图1和2所示)，用于取放试纸条。壳体2包括上壳体11和下壳体10；上壳体11的内表面上设置有卡壳定位柱14；下壳体10的内表面上匹配设置有卡壳定位孔15，用于插入卡壳定位柱14，连接上壳体11和下壳体10，使得壳体2呈闭合形态。当卡壳定位柱14从卡壳定位孔15中抽离时，使得壳体2呈开启形态。卡壳定位孔15和卡壳定位柱14的数量相同，均为8个。
[0059]
试纸条1为实施例1中的棘球蚴抗体免疫层析试纸条。
[0060]
实施例3
[0061]
在该实施例中，试纸条侧面定位柱的数量为4根，平分成2列设置在试纸条定位板的两侧。卡壳定位孔和卡壳定位柱的数量相同，均为4个。其余与实施例2同。
[0062]
实施例4
[0063]
在该实施例中，试纸条侧面定位柱的数量为10根，平分成2列设置在试纸条定位板的两侧。卡壳定位孔和卡壳定位柱的数量相同，均为12个。其余与实施例2同。
[0064]
实施例5
[0065]
在该实施例中，壳体包括上壳体和下壳体；上壳体的一侧通过铰链与下壳体的一侧连接，上壳体盖合在下壳体上，使得壳体呈闭合形态。其余与实施例2同。
[0066]
棘球蚴抗体免疫层析检测卡的制备：
[0067]
如实施例1所述，试纸条由底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫构成。将处理好的样品垫、吸水垫、硝酸纤维素膜、金标结合垫粘在底板(pvc胶板)上，将3种重组抗原和金黄色葡萄球菌蛋白a(protein a，spa)用喷膜仪分别固定于硝酸纤维素膜的检测线(t1-t3线)和质控线(c线)区带，并用试纸条切割机将其切成4mm宽的试纸条，将试纸条装入预制的壳体中，将装配好的检测卡放入含有干燥剂的密封袋内，密封后室温保存备用，有效期长达2年。
[0068]
检测时，拆开棘球蚴抗体免疫层析检测卡独立包装，向加样孔13中滴加样本(如血清、血浆或全血)后，样本进入样品垫4，由于层析作用，样本将沿着试纸条1向吸水垫5方向移动。当样本移动至金标垫7时，样本中的抗体与金标垫7上的胶体金结合。结合后的复合物继续向吸水垫5方向移动。到检测线组8区域时，样本中相应的抗体与该区域的对应重组抗原发生特异性结合，使该区域显示红颜色，从而实现特异性的免疫诊断。检测时间在30分钟以内，甚至可以在15分钟左右。
[0069]
滴加样本前，可在登记记录区19记录样本来源、编号等样本信息；样本及缓冲液经加样孔13滴至试纸条1的样品垫4上；带有样本的液体流至金标垫7上与胶体金反应，再流至硝酸纤维素膜3上，依次与检测线8和质控线9反应；检测人员通过观察窗口12，观察和记录检测线8和质控线9的反应变化。
[0070]
具体地，检测人员可手持凸起点区20移动用于包虫病抗体检测的免疫层析检测装置，通过上壳体11的观察窗口12，观察检测线组8和质控线9上的颜色变化，以此判定检测样本是否呈阳性反应，在登记记录区19记录检测结果，拍摄图文信息并存档。
[0071]
判定结果规则如下：
①
阳性反应：质控线和任意2条或以上检测线都显色。
②
阴性反应：质控线显色而检测线不显色，或者质控线显色而检测线仅一条显色。
③
质控线不显色，无论检测线是否显色，均表示试条失效，应该重新检测。
[0072]
试验例1敏感性和特异性检测
[0073]
本发明中所涉及的重组棘球蚴抗原不限于em18、egcystatin和agb1，还可以是其他重组棘球蚴抗原。这里只是以这3种重组棘球蚴抗原为例，对本发明进行说明，以便于理解本发明结果判定规则带来的有益效果。
[0074]
为评价本发明中筛检方法，采用60份血清样本进行检测，结果如表1所示。此次共采集60份人血清，其中b超确诊的棘球蚴病人血清30份、健康人血清30份，样本均来源于四川省甘孜州。t1、t2和t3分别代表3种重组抗原(在本试验例中为em18、egcystatin和agb1)，其检测敏感性分别为(76.67％，33.33％，86.67％)，特异性分别为(90.00％，100.00％，83.33％)。第一种筛检方法是以任意1条t线显色即判定为阳性反应，该判定方法的敏感性、特异性和正确指数分别为(93.33％，80.00％，0.73)。第二种筛检方法(即本发明筛检方法)
是以至少2条检测线(t线)显色才判定为阳性反应，该判定方法的敏感性、特异性和正确指数分别为(83.33％，96.67％，0.80)。经卡方比较分析，两种筛检方法之间的敏感性和特异性均存在统计学差异(χ
敏感性2
＝10.714，p《0.05；χ
特异性2
＝4.138，p《0.05)，说明第二种筛检方法效能更优。
[0075]
表1 不同检测线及判定方法的比较
[0076][0077]
注：*表示第一种筛检方法；**表示第二种筛检方法。
[0078]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。