一种基于铜纳米簇和氧化反应的特异性亚硝酸盐荧光检测方法

1.本发明属于纳米材料制备及亚硝酸盐检测技术领域，具体涉及一种基于铜纳米簇和氧化反应的特异性亚硝酸盐荧光检测方法。


背景技术：

2.亚硝酸盐是自然界中最常见的含氮化合物之一，不仅存在于自然环境中，更是在人类社会中被广泛应用于食品和化工行业，然而，亚硝酸盐因其潜在的毒性已经对人类的健康构成巨大威胁，亚硝酸盐离子已被认为是饮用水中的 a 类无机污染物：亚硝酸根离子与蛋白质相互作用后，是产生高致癌性 n-亚硝胺的重要前体；过量摄入亚硝酸盐会导致食道癌、婴儿高铁血红蛋白血症（蓝婴综合征）、自然流产、中枢神经系统先天缺陷等一系列医学问题；美国环境保护署 (epa) 规定，亚硝酸盐的最大污染物水平 (mcl) 为 1 ppm (21.7 μm)，世界卫生组织 (who) 设定的类似准则值为 3 ppm，因此，亚硝酸盐含量的测定对于饮用水水质监测和临床诊断极为重要。
3.为了控制和检测亚硝酸盐的使用，已经开发了相应的亚硝酸盐检测技术，但早期的亚硝酸盐检测方法如比色法和分光光度法的准确性容易受到样品中其他底物的影响。因此，已经开发了诸如气相色谱质谱（gc-ms）和液相色谱质谱（lc-ms）等高精度和通用性的方法来克服各种底物的干扰。然而，这些检测方法成本高、便携性差、前处理复杂，无法满足现场快速检测的要求。近年来，一些新型的亚硝酸盐传感器，如电化学传感器、荧光传感器和表面增强拉曼散射（sers）传感器，利用传感器与亚硝酸盐分子之间特定的物理和化学相互作用已经成功用于亚硝酸盐的检测，并大大推动了亚硝酸盐检测仪器的小型化。在这些传感器中，荧光传感器因其低成本、高精度和高便携性而成为应用最广泛的分析工具。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于铜纳米簇和氧化反应的特异性亚硝酸盐荧光检测方法，不仅能提高亚硝酸盐检测的灵敏度和准确性，同时该传感器具有较好的特异性。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于铜纳米簇和氧化反应的特异性亚硝酸盐荧光检测方法，包括以下步骤：（1）谷胱甘肽为稳定剂，抗坏血酸为还原剂的铜纳米簇的制备：将125 μl cucl2溶液与20ml gsh 溶液在剧烈搅拌的条件下混合5 min以形成硫醇铜络合物，此时混合溶液逐渐变得浑浊。然后，将450μl 新鲜配制的 aa 溶液加入在混合溶液中，加热至一定温度继续搅拌一段时间，在此期间，溶液逐渐变得澄清，之后将溶液在室温中冷却，得到cu ncs悬浮液，将所得的cu ncs悬浮液储存在4 ℃以备进一步使用。cu ncs的制备及应用路线如图1所示。
6.（2）cu ncs用于检测亚硝酸盐方法的构建：取不同浓度的no
2-与乙酸缓冲溶液混合放置在离心管中，然后在混合液中加入一定浓度的fe
2+
溶液，旋涡震荡使其充分混合，之后，
将200μl制备的cu ncs添加到上述溶液中，并将混合物在室温下孵育一段时间。最后，在一定激发波长下测量荧光发射光谱，检测机理如图2所示。
7.（3）亚硝酸盐检测标准曲线的建立：利用荧光光谱仪检测铜纳米簇的荧光发射峰的变化，分别将不同浓度的亚硝酸盐溶液依次加入到特异性检测体系中，建立亚硝酸盐浓度c与荧光猝灭值δf的关系，即得到亚硝酸盐检测标准曲线。
8.其中，步骤（1）所述合成铜纳米簇的谷胱甘肽（gsh）溶液浓度为0.19~0.25 mm ，优选为0.21mm；抗坏血酸（aa）浓度为80~120 mm，优选为100mm；合成时间为2~6h，优选为4h，合成温度为35~75℃，优选为65℃。
9.其中，步骤（2）所述乙酸缓冲溶液ph为3、4、5、6、7，优选为3。
10.其中，步骤（2）所述fe
2+
溶液浓度为25、50、75、100、125、150、175 um，优选150 um；其中，步骤（2）所述孵育时间为5、10、15、20、25、30、35min，优选为30min。
11.其中，步骤（3）所述测定的荧光猝灭值δf，具体是测定365nm激发光激发下432nm处无亚硝酸盐的荧光强度值及有亚硝酸盐的荧光强度值之间的荧光强度差。
12.其中，步骤（3）所述亚硝酸盐检测标准曲线，是指构建特异性检测体系的荧光猝灭值与亚硝酸盐浓度关系的标准曲线。
13.本发明的有益效果在于：（1）本发明通过谷胱甘肽为稳定剂，抗坏血酸为还原剂使用绿色的一锅法制备得到铜纳米簇，基于纳米簇及氧化反应成功实现亚硝酸盐的低成本、高灵敏和快速特异性检测。
14.（2）本发明构建的特异性检测体系为优化设计的铜纳米簇荧光纳米材料作为荧光探针实现的。在酸性条件下， no2−
的存在能使fe
2+
很容易被氧化为 fe
3+
，通过将fe
2+
/fe
3+ 氧化还原过程与 fe
3+
对 cu ncs 的荧光猝灭相结合，其产生的荧光猝灭变化量可以与亚硝酸盐浓度间荧光强度变化之间的线性关系。该检测方法对亚硝酸盐具有强的荧光响应性，对亚硝酸盐的检测具有特异性。
15.（3）本发明成功建立了亚硝酸盐的检测方法，荧光猝灭值与亚硝酸盐浓度（5
ꢀ‑ꢀ
70 um）具有良好的线性曲线（r
2 = 0.9972）。
附图说明
16.图1 为cu ncs的制备及应用路线。
17.图2为cu ncs用于亚硝酸盐检测的机理。
18.图3为不同浓度亚硝酸盐下的标准曲线。
19.图4为存在不同物质时纳米簇的荧光猝灭效果对比图。
具体实施方式
20.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
21.实施例1铜纳米簇的制备：将125 μl cucl2溶液与20ml 0.21 mm gsh 溶液在剧烈搅拌的条件下混合5 min以形成硫醇铜络合物，此时混合溶液逐渐变得浑浊。然后，将450μl 新鲜
配制的 100 mm aa 溶液加入在混合溶液中，加热至65℃继续搅拌4h，在此期间，溶液逐渐变得澄清，之后将溶液在室温中冷却，得到cu ncs悬浮液，将所得的cu ncs悬浮液储存在4 ℃以备进一步使用。cu ncs的制备及应用路线如图所1示。
22.实施例2铜纳米簇用于亚硝酸盐的检测：取no
2-与ph为3的乙酸缓冲溶液混合放置在离心管中，然后在混合液中加入浓度为150μm的fe
2+
溶液，旋涡震荡使其充分混合，之后，将200μl制备的cu ncs添加到上述溶液中，并将混合物在室温下孵育30min，其检测机理如图2所示。
23.实施例3亚硝酸盐检测标准曲线的建立：分别将不同浓度亚硝酸盐的溶液加入到特异性检测体系中，测定365nm激发光激发下432nm处的荧光强度值，记录孵育后有无亚硝酸盐的荧光强度变化值，构建检测方法中纳米簇的荧光强度猝灭量与亚硝酸盐浓度关系的标准曲线，其线性范围及标准曲线如图3所示。
24.实施例4对于适配体传感器来说，其特异性识别作用也是一个很重要的因素。因此，测试了检测方法的特异性识别功能，实验通过加入干扰阴离子来考察选择性，通过加入浓度为100μ的cl-、i-、ac-、co
32
、hco3、so
42-、hso
3-、s2o
52-、no
3-、clo
4-、po
43-、hpo
42-和h2po
4-，然后对比加入亚硝酸盐的荧光强度变化值，其结果如图4所示。从图4中可以发现，即便干扰离子的浓度高于所加入亚硝酸盐的浓度，其荧光猝灭程度均小于no
2-，这说明该检测方法具有良好的选择性。