动物组织中颠茄类生物碱的检测方法

1.本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种动物组织中颠茄类生物碱的检测方法。


背景技术：

2.曼陀罗、天仙子、颠茄等有毒茄科植物中含有多种有毒生物碱，如莨菪碱、阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱、樟柳碱等。这些生物碱统称为颠茄生物碱(belladonna alkaloids)，也称莨菪烷生物碱(tropane alkaloids)。颠茄生物碱能干扰大脑皮层，产生中枢抑制，能竞争性阻断m胆碱受体对呼吸中枢具有的兴奋作用，会引起口干、瞳孔扩散、声音嘶哑、心跳加速、血管扩张、间歇抽搐或痉挛等现象，导致中枢系统产生紊乱，狂躁、眩晕、幻觉、一般剂量可使人感觉疲倦，进入无梦之睡眠，服用者如果过量使用，会产生精神错乱、意识恍惚，并伴有幻觉，昏迷等症状，最终出现呼吸衰竭而死亡。山莨菪碱和阿托品能使延髓和大脑兴奋，服用者表现得十分狂躁，并伴有胡言乱语的症状，也会出现抑制症状，使服用者出现昏迷，抑制其呼吸，严重者则会死亡。近年来被发现除临床治疗用外的一些特殊效用：如改善肉类品质(类“瘦肉精”)协同注水等。此类药物及其代谢物不可避免地会残留于猪体内，而该类药物残留通过食物链进入人体达到一定浓度会出现恶心、呕吐、头晕、无力、四肢及口舌麻木等症状,严重者出现呼吸衰竭而死亡。
3.综上，建立高效可靠的上述药物检测方法，对于发现颠茄类生物碱原药与代谢物的潜在风险以及开展有关研究具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种动物组织中颠茄类生物碱的检测方法，以解决现有技术中存在的不足。
5.为实现上述目的，本发明提出一种动物组织中颠茄类生物碱的检测方法，包括：
6.样品制备，解冻后的待测动物组织清洗后，切块、捣碎，分装样品容器中，保存备用；
7.样品提取，称取样品5g试样，精确至0.01g，于50ml离心管中，加入50μl内标工作液涡旋混匀30s，并静止10min，加入15ml酸化乙腈旋涡混匀1min后，旋涡混匀1min后， 35℃～55℃超声提取10min，取出冷却至室温，4500r/min离心5min，上清液转移至100ml 鸡心瓶中；
8.将所述离心管内的去除上清液后的固体进行二次提取，得到第二次的上清液，将两次的上清液合并，45℃，旋转蒸发至近干，得到残渣；
9.样品净化，向所述残渣内加入50μl甲醇，水，溶解残渣，转移至2ml离心管中，用水定容至1.0ml，加入吸附剂，涡旋振荡30s，加入1ml正己烷，涡旋振荡10s，12000r/min 离心5min，弃去上层油脂层，重复净化一次，至-20℃冷冻30min，12000r/min离心5min，下层清液经过滤后供液质使用；
10.样品检测，将所述过滤后的下层清液上机检测，检测条件包括：
11.色谱柱：infinitylabporoshell120hph-c18(2.1mm
×
100mm，1.9μm)；流速：0.2 ml/min；流动相：a相为5mm甲酸铵+0.1％甲酸；b相为甲醇，梯度洗脱；柱温：40℃，进样量：10μl；内外标法定量；
12.质谱离子源:esi；离子源温度:100℃；干燥气流量:10l/h；毛细管电压:4000v；气流温度:350℃；雾化气压力:40psi；碰撞气类型:氮气；扫描方式:正离子；检测方式:mrm。
13.根据本发明的一个实施例，所述吸附剂包括10mgpsa,10mg nh2、20mg中性氧化铝。
14.根据本发明的一个实施例，所述梯度洗脱条件以体积分数计，流速为0.2ml/min；在0～ 1min，流动相a相为95％，流动相b相为5％；在2～4min，流动相a相为90％，流动相b相为10％；在5min，流动相a相为50％，流动相b相为50％；在10min，流动相a相为20％，流动相b相为50％；在10～15min，流动相a相为95％，流动相b相为5％。
15.根据本发明的一个实施例，将所述离心管内的去除上清液后的固体进行二次提取，包括：震散固体，加入15ml酸化乙腈，手摇上下震荡30s后，旋涡混匀加超声，得到第二次的上清液。
16.根据本发明的一个实施例，所述下层清液过滤，包括：将所述下层清液经0.22μm滤膜过滤。
17.根据本发明的一个实施例，所述动物组织包括：动物肌肉、肉、心、肝、肾、肺中的一种或多种。
18.根据本发明的一个实施例，检测方法还包括：
19.标准储备液：分别称量适量山莨菪碱、消旋山莨菪碱、氢溴酸樟柳碱、硫酸阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、氢溴酸后马托品、托品酸、去甲阿托品经折算后的山莨菪碱、消旋山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、后马托品、托品酸、去甲阿托品含量均为 10mg，用甲醇定容至10ml棕色容量瓶中，制备为质量浓度为1000μg/ml标准储备液；
20.移取山莨菪碱、消旋山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、后马托品、托品酸、去甲阿托品标准溶液，用甲醇定容于10ml棕色容量瓶中,制备为质量浓度为 1000ng/ml混合中间液；
21.在空白基质中分别加入10ng/ml混合标准溶液20μl、50μl、100μl、0.5ml、2ml，加入1000ng/ml混合标准溶液50μl、100μl、200μl，按照与样品相同提取与净化步骤进行处理，制备8个质量浓度标准溶液为0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、20 ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml，后马托品为内标，内标法绘制工作曲线。
22.本发明实施例的检测方法至少具有以下有益效果：
23.根据本发明实施例的动物组织中颠茄类生物碱的检测方法，能够精准的测出动物组织中的颠茄类生物碱，测定结果准确可靠，为颠茄类生物碱的测量提供了可靠的数据，具有显著的经济效益，具有广阔的市场前景。对于指导药物残留的测量具有很好的参考价值。
附图说明
24.图1是本发明的猪肉基质中山莨菪碱特征离子质量相关谱图；
25.图2是本发明的猪肉基质中消旋山莨菪碱特征离子质量相关谱图；
26.图3是本发明的猪肉基质中樟柳碱特征离子质量相关谱图；
27.图4是本发明的猪肉基质中去甲阿托品特征离子质量相关谱图；
28.图5是本发明的猪肉基质中阿托品特征离子质量相关谱图；
29.图6是本发明的猪肉基质中后马托品特征离子质量相关谱图；
30.图7是本发明的猪肉基质中莨菪碱特征离子质量相关谱图；
31.图8是本发明的猪肉基质中东莨菪碱特征离子质量相关谱图；
32.图9是本发明的猪肉基质中skf-525a特征离子质量相关谱图；
33.图10是本发明的猪肉基质中托品酸特征离子质量相关谱图；
34.图11是本发明的猪肉基质中目标化合物特征离子叠加质谱图。
具体实施方式
35.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
36.本发明的仪器和设备：
37.6410b液相色谱-串联四极杆质谱连用仪，美国agilent公司；
38.xs205分析天平，瑞士mettler公司；
39.te212-l电子天平德国sartorius公司；
40.可调量程移液器，德国vitlab公司；
41.tdl-40b台式离心机，上海安亭科学仪器厂。
42.本发明的材料为：
43.表1标准物质一览表
44.标准物质名称cas号标准值生产厂家山莨菪碱55869-99-310mg，≥99.5％德国hpc-681205消旋山莨菪碱17659-49-3100mg，≥99.8％中检所100249-201303氢溴酸樟柳碱76822-34-9100mg，≥99.8％中检所100399硫酸阿托品5908-99-6100mg，≥99.6％坛墨质检75801-100mg莨菪碱101-31-520mg，≥99.5％美国catoccpe901375东莨菪碱51-34-350mg，≥98.6％美国catoccpe901273托品酸529-64-6,50mg，≥99.0％中国食品药品检定研究去甲阿托品16839-98-85mg，≥99.8％美国panphy氢溴酸后马托品51-56-950mg，≥99.7％加拿大trc
45.乙腈、甲醇、正己烷均为色谱纯，美国fisher公司；
46.甲酸(lc/ms)，美国fisher公司；
47.甲酸铵(lc/ms)，美国sigma-aldrich；
48.amino(nh2)spe散装吸附剂，美国agilent；
49.bondesil-psa散装吸附剂(40um)，美国agilent；
50.试验用水均符合gb/t 6682一级水的要求，其余试剂均为国产分析纯。
51.下面结合具体实施例描述本发明中关于参数及技术指标的选择以及检测过程。
52.(一)标准储备液制备
53.标准储备液：分别称量适量山莨菪碱、消旋山莨菪碱、氢溴酸樟柳碱、硫酸阿托品、
莨菪碱、东莨菪碱、氢溴酸后马托品、托品酸、去甲阿托品经折算后山莨菪碱、消旋山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、后马托品、托品酸、去甲阿托品含量均为10mg，用甲醇定容至10ml棕色容量瓶中，制备为质量浓度为1000μg/ml标准储备液。
54.移取山莨菪碱、消旋山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、后马托品、托品酸、去甲阿托品标准溶液，用甲醇定容于10ml棕色容量瓶中,制备为质量浓度为 1000ng/ml混合中间液，避光-16～20℃冷冻保存。使用时用甲醇逐级稀释至100ng/ml、10ng/ml所用浓度，现用现配。
55.在空白基质中分别加入10ng/ml混合标准溶液20μl、50μl、100μl、0.5ml、2ml，加入1000ng/ml混合标准溶液50μl、100μl、200μl，按照与样品相同提取与净化步骤进行处理，制备8个不同质量浓度标准溶液(0.2、0.5、1、5、20、50、100、200ng/ml)，后马托品为内标，内标法绘制工作曲线。
56.(二)样品制备
57.冷鲜畜禽肌肉产品清洗后，剔去毛、皮、淤血、筋腱、骨，待制备。冷冻畜禽肉在室温下解冻，样品稍微解冻变软，内部刚解冻且冻水未流出时，剔去毛、皮、筋腱、骨，待制备，猪心、肝、肾、肺等副产品用实验用水清洗干净后制备。将样品切细至1cm
×
1cm小块，混匀，四分法缩分至500g后，用捣碎机将其捣碎，混匀，分装入若干样品容器中备用。畜禽内脏预处理后的，切丁或切细，用捣碎机捣碎，混匀，分装入样品容器中。鱼类样品清洗干净后，去鳞取可食皮及肉，切细至1cm
×
1cm小块，四分法缩分至500g后，捣碎匀浆，混匀后分装备用。
58.(三)样品保存
59.试样制备后，如不能及时检测应立即冷冻保存，确保检测前不能融解、变质。当天检测的试样可暂时冷藏保存，不超过8h。冷冻样品应在45℃以下不超过15min，或2-5℃不超过18h解冻后进行检验。
60.(四)提取
61.称取样品5g试样，精确至0.01g，于50ml离心管中，加入50μl内标工作液涡旋混匀 30s，并静止10min，加入15ml酸化乙腈旋涡混匀1min后，旋涡混匀1min后，35℃～ 55℃超声提取10min，取出冷却至室温，4500r/min离心5min，上清液转移至100ml鸡心瓶中。震散固体，加入15ml酸化乙腈，手摇上下震荡30s后，旋涡混匀加超声重复提取1 次，合并两次上清液；45℃，旋转蒸发至近干。
62.(五)净化
63.加入50μl甲醇，少量水，溶解残渣，转移至2ml离心管中，用水定容至1.0ml，加入吸附剂(10mgpsa,10mg nh2、20mg中性氧化铝)，涡旋振荡30s，加入1ml正己烷，涡旋振荡10s，12000r/min离心5min，弃去上层油脂层，重复净化一次，至-20℃冷冻30min， 12000r/min离心5min，下层清液经0.22μm滤膜过滤后供液质使用。
64.(六)上机检测
65.采用6410b液相色谱-串联四极杆质谱连用仪，美国agilent公司，检测条件：
66.色谱柱：infinity lab poroshell120hph-c18(2.1mm
×
100mm，1.9μm)；流速：0.2 ml/min；流动相：a相为5mm甲酸铵+0.1％甲酸；b相为甲醇，梯度洗脱，具体设定条件见表1；柱温：40℃；进样量：10μl；内外标法定量。
67.表2流动相梯度洗脱条件
[0068][0069][0070]
质谱离子源：质谱离子源:esi离子源温度:100℃；干燥气流量:10l/h；毛细管电压:4000v；气流温度:350℃；雾化气压力:40psi；碰撞气类型:氮气；扫描方式:正离子；检测方式:mrm。其中，质谱采集参数条件详见表3。
[0071]
表3质谱采集参数条件
[0072][0073]
(七)结果与分析
[0074]
在试验过程中，为了得到最佳实验结果，对提取剂的选择、提取方式、料液比提取时间等进行了大量的试验和对比，并对结果进行分析。下面具体描述结果的分析过程：
[0075]
1.谱图分析
[0076]
拟分析目标化合物山莨菪碱、消旋山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、托品酸、去甲阿托品按色谱条件进行分析，山莨菪碱与消旋山莨菪碱可有效分离，但阿托品与莨菪碱不能分离，其他6种目标化合物与干扰物质完全分离，峰形良好，详见表4、附图1～11。鉴于莨菪碱为左旋体，阿托品为混旋体，莨菪碱正常条件下经一段时间后会发生变化，产生旋光体，从而转变为阿托品，故选择阿托品为目标化合物；山莨菪碱是从我国特有植物唐古特山莨菪中提取的生物碱，为左旋天然产物，消旋山莨菪碱为人工合成的两对对映异构体并存的外消旋体，山莨菪碱与消旋山莨菪碱分离即右旋体与左旋体有效分离，鉴于两者相关药理作用有显著区别，故有效分离在实际应用中具有十分重要的意义，例如分析目标化合物的来源途径等。因此选择山莨菪碱、消旋山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、东莨菪碱、托
品酸、去甲阿托品为目标化合物。
[0077]
表4目标化合物保留时间及次强碎片离子相对丰度
[0078]
目标化合物保留时间min次强碎片离子相对丰度％山莨菪碱8.92255消旋山莨菪碱9.27843樟柳碱7.55836去甲阿托品9.45859阿托品9.15251后马托品9.02467莨菪碱9.08853东莨菪碱9.07445skf-525a9.04740托品酸4.62430
[0079]
2.前处理条件优化
[0080]
(1)提取剂的选择
[0081]
分别考察了丙酮、甲醇、乙腈、酸化乙腈(0.1％甲酸)对7种目标化合物的提取效果，经比较丙酮提取干扰较多不利于后续上机分离，甲醇、乙腈、酸化乙腈对目标化合物的加标回收率没有明显影响，但经酸化乙腈提取后，各目标化合物特征离子碎片峰面积响应值明显高于其他提取剂，绝对回收率高于其他试剂，分析回收率无明显影响主要原因为内标法抵消了提取过程种的损失，故优选酸化乙腈为提取剂。
[0082]
3.提取方式、时间及温度的选择
[0083]
肉、肝、心、肺、肾各样品复杂程度不同，所含组织体液成份及比例不同，故经比较用无水硫酸钠、无水硫酸镁除水，经比较猪肝与猪肺需要较多无水硫酸钠或无水硫酸镁，无水硫酸镁除水效果优于无水硫酸钠，所需质量较少，但对目标化合物有一定的吸附作用。但经反复试验，同一基质的不同样品中水分含量仍存有差异，个别样品经除水后仍可能存有少量水分，且为旋蒸蒸干耗时较长。鉴于试验过程中除水主要目的为统一各样品最终上机的水相与有机相比例，减少溶剂效应，经综合考量后，采用不添加除水剂，旋蒸至近干时，转移后定容的方式统一最终上机水相及有机相比例。
[0084]
猪肉、猪肝、猪心、猪肺、猪肾在提取过程中，结块及挂壁附着程度不同，通过大量试验比较手摇式震荡、涡旋混匀、回旋式震荡、超声波提取等方式，发现涡旋混匀与超声结合的提取方式可充分提取目标化合物，样品经第一次提取离心后易结块及挂壁，直接加入提取剂后涡旋及超声不能有效分散样品，从而影响提取效率，但在加入试剂前采用简单机械震荡方式便可分散样品，在加入试剂后，上下手摇方式可有效改善猪肺、猪肝、猪肾样品挂壁的情况。综合考虑提取效果和工作效率，选择涡旋1min，超声10min的提取方式。此外，适当温度可有效加速蛋白变质提高净化效率，但温度太高易造成目标化合物分解，经大量试验后选择35℃～55℃为超声温度。
[0085]
4.浓缩方式的选择
[0086]
考察氮吹及旋转蒸发两种试样浓缩方式，因提取溶剂较多优先选择旋转蒸发。试验过程中发现由于猪肉、猪肝、猪心、猪肺、猪肾样品基质不同，旋蒸所需压力及时间存在很
大差异，需要根据不同基质随时调整，耗费较多人力，且考虑到样品快要蒸发近干时易发生爆沸，故通过旋蒸至4～5ml加入5ml异丙醇，改善上述问题，并使试样减少爆沸并易蒸发近干。
[0087]
5.净化条件的选择
[0088]
考察了c
18
、psa、中性氧化铝、gbc、硅藻土、nh2等吸附净化剂对猪肉、猪肝、猪心、猪肺、猪肾等不同基质样品的净化效果，经考察因使用内标法定量各吸附剂对样品加标回收率没有明显影响，但对目标化合物的信号响应值及特征离子干扰有重要影响，其中gbc 对各目标化合物的吸附率在70％～95％，c18对阿托品、东莨菪碱有一定吸附作用，硅藻土对阿托品有一定吸附作用，psa、nh
2、
中性氧化铝对目标化合物吸附较小，对样品均有明显净化效果，但如使用量较多时会对目标化合物有一定程度的吸附，经试验后，优选10mgpsa、 10mgnh2、20mg中性氧化铝进行净化，并加入1ml正己烷并冷冻去脂。
[0089]
6.检测条件的选择
[0090]
(1)液相分离条件
[0091]
考察了有机相为甲醇、乙腈，水相为水、0.1％甲酸、5mmol乙酸铵(0.1％甲酸水)溶液、5mmol甲酸铵(0.1％甲酸水)溶液0.01％氨水～0.1％氨水等多种流动相配比，经大量试验发现，有机相为甲醇时各目标化合物分离效果均优于乙腈，水相选择水、0.1％甲酸、5mmol 乙酸铵(0.1％甲酸水)溶液时，东莨菪碱信号响应低，仅在较高浓度时有响应。水相为氨水时，东莨菪碱响应良好，但托品酸响应低，且流动相不稳定，其中氨水较易挥发，造成测试体系不稳定，目标化合物出峰时间及峰型易发生变化，不利于高通量分析。经综合比较5mmol甲酸铵(0.1％甲酸水)7种目标化合物响应值相对较好，且峰型良好，无干扰影响。通过调整梯度洗脱条件试验，实现了山莨菪碱与其右旋体分离，所有目标化合物均在 10min内出峰，满足快速高效的测试要求。
[0092]
(2)质谱条件
[0093]
通过大量试验，调谐各种质谱参数，综合比较各碎片离子响应程度，确定质谱离子源条件及碎裂电压、碰撞电压及定性、定量离子如表2。
[0094]
7.内标物的选择
[0095]
考察了后马托品、skf-525a对目标化合物的同步响应程度，经比对，后马托品在不同基质中对7种化合物均有较好的同步响应，可选为参考内标，skf-525a极性较低，出峰时间较长对托品酸、去甲阿托品同步相应较好，其他目标化合物存在一定偏差，故未选为内标物。
[0096]
8.方法的验证
[0097]
(1)基质效应评价
[0098]
由于基质常常对目标分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。采用提取后添加法(matuszewski等提出)，通过计算溶剂中目标化合物和基质提取液中目标化合物的离子响应强度考察目标化合物在猪肉、猪肝、猪心、猪肺、猪肾空白基质中添加后的基质效应，基质效应的计算方法如公式(1)所示。
[0099][0100]
式中：a为在动物可食组织基质中目标物的响应值；b为在试剂中目标物的响应值。
若 a/b＞1，则表示基质对分析物的响应产生增强效应；若a/b＜1则表示基质对分析物的响应产生抑制效应；若a/b＝1，则表示不存在基质效应。当a/b介于0.8～1.2时，基质干扰程度较低；当0.5＜a/b＜0.8或1.2＜a/b＜1.5时，表现为中等程度的基质干扰效应；当a/b ＜0.5或a/b＞1.5，表示基质效应的干扰强烈。
[0101]
以50ng/ml待测浓度为例，基质效应评价结果表明猪肝、猪肺、猪肾基质对7种目标化合物具有较强的基质增强效应，检测过程中需要采取措施减少基质效应影响。本方法中采用提高净化效率，使用内标法和配制基质标准溶液的方法来改善基质效应。
[0102]
(2)相对基质效应评价
[0103]
分别使用内标法绘制溶剂标准溶液工作曲线和不同基质溶液加标工作曲线，按照公式 2考察溶剂内标法与基质内标法之间的相对基质效应。
[0104][0105]
式中，sm和ss分别表示基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线的斜率。负的结果表示基质抑制效应，正的结果表示基质增强效应。当me为-20％～20％时为弱基质效应；me 为-50％～-20％或20％～50％时为中等基质效应；当me＜-50％或＞50％时为强基质效应。
[0106]
经计算，采用内标法后，各种基质对目标化合物的基质效应有不同程度改善，以中弱或中强增强效应为主，其中托品酸、去甲阿托品、阿托品、樟柳碱基质效应明显，仍对检测结果造成影响，因此在检测过程中有必要使用基质溶液标准工作曲线。考虑到实际测试中，同时绘制多种基质溶液标准工作曲线会显著增加测试工作量，不利于实际操作，故考虑使用有代表性的基质绘制曲线。经考察，使用猪心为基质绘制工作曲线时，各种其他基质的7种目标化合物相对基质效应基本保持在弱基质效应水平，在兼顾基质效应的同时，使方法简单易操作，可满足实际需要。
[0107]
(3)线性范围、检出限和定量限
[0108]
在空白基质中分别加入10ng/ml混合标准溶液50μl、100μl、0.5ml、1ml，加入 1000ng/ml混合标准溶液50μl、100μl、200μl，按照上述样品提取与净化步骤进行处理，制备7个不同质量浓度标准溶液(0.5、1、5、10、50、100、200ng/ml)，内标法绘制工作曲线。测定标准品及加标样品，通过对加入最低可接受浓度0.1μg/kg样品测定7次，计算7种目标化合物测定结果的标准偏差，按lod＝0+3s计算得方法检出限，按loq＝0+10s计算得方法的定量限。线性回归方程及线性相关性如表5、表6所示，方法检出限、定量限如表7所示。
[0109]
表5 7种目标化合物5种基质中线性回归方程
[0110]
[0111]
表6 7种目标化合物5种基质中线性相关系数
[0112]
目标化合心肝肺肾肉去甲阿托0.999893010.999893010.999893010.99912170.99937346樟柳碱0.999247510.999247510.999247510.999494680.9992622山莨菪碱0.999807990.999807990.999807990.999603880.99933294消旋山莨0.999576010.999312700.999382990.999517460.99926444托品酸0.999525510.999525510.999525510.999781110.9997966东莨菪碱0.999636980.999636980.999636980.999470540.99935892阿托品0.999660660.999660660.999660660.999483790.99948448
[0113]
表7 7种目标化合物5种基质检出限、定量限
[0114][0115]
(4)方法精密度和回收率
[0116]
分别测试猪肉、猪肝、猪肾、猪心、猪肺、羊腿肉、鸡胸肉、牛肉、鱼肉等不同动物可食组织中添加10.0μg/kg浓度水平阳性样品各3份,上机测试浓度为50ng/ml。去甲阿托品在不同组织中的回收率为81.6％～107％，对应的平均相对标准偏差为2.11～9.51％；樟柳碱在不同组织中的回收率为80.2％～119％，对应的平均相对标准偏差为1.39～12.7％；山莨菪碱在不同组织中的回收率为80.2％～119％，对应的平均相对标准偏差为1.57～ 14.5％；消旋山莨菪碱在不同组织中的回收率为87.8％～115％，对应的平均相对标准偏差为 1.50～6.95％；托品酸在不同组织中的回收率为80.8％～118％，对应的平均相对标准偏差为1.13～9.01％；东莨菪碱在不同组织中的回收率为90.0％～119％，对应的平均相对标准偏差为1.17～11.3％；阿托品在不同组织中的回收率为82.6％～111％，对应的平均相对标准偏差为2.95～7.08％，详见表8～9。
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表8 7种目标化合物在不同基质样品中的回收率试验结果回收率％
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表9 7种目标化合物在不同基质样品中的精密度试验结果rsd％
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(5)稳定性
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同一加标浓度水平(10.0μg/kg)猪肉样品，分别由不同操作人员分别间隔0日、10 日、30日测定，计算3次平均测定的结果rsd，5种不同基质中8种目标化合物的方法重现性为3.92％～11.3％，均《15％，结果表明方法可靠，可稳定重现，详见表10。
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表10猪肉样品回收率和精密度试验结果
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本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。