一种醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质的检测方法与流程

1.本发明涉及医药检测领域，具体涉及一种醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质的检测方法。


背景技术：

2.醋酸泼尼松龙滴眼液是一种抗炎药物，它属于一种激素类的滴眼液，一般来说主要是用于眼部的炎症患者，比如虹膜睫状体炎，还有眼部的葡萄膜炎也可以使用这类滴眼液，激素对于眼部的炎症控制有较好的效果。
3.根据ep(欧洲药典)及成品工艺短期稳定性研究确定的降解杂质有3个，分别是ep杂质a、ep杂质b、ep杂质c，工艺杂质有两个，分别是ep杂质d、ep杂质e。
[0004][0005]
ep(欧洲药典)和usp(美国药典)中，仅给出api(原料药)的有关物质检测方法，方法复杂且成品中的辅料具有一定干扰，峰纯度不足，给有关物质检测带来相当大的难度。项竞佐等，rp—hplc法测定帕利百中醋酸泼尼松龙的含量及其有关物质[j],药学服务与研究，2003，3(2)，提供了一种醋酸泼尼松龙眼用制剂中杂质的检测方法，经试验发现，该方法得到的色谱图中ep杂质a的峰纯度角(purityangle)大于纯度阈值(puritythreshold)，即峰纯度不足，致使不能准确测定醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质的含量。


技术实现要素：

[0006]
为解决上述问题，本发明提供了一种醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，具体步骤如下：
[0007]
a、供试品溶液制备：取待测醋酸泼尼松龙滴眼液，加稀释剂溶解，即得；
[0008]
b、对照品溶液制备：取醋酸泼尼松龙对照品，加稀释剂溶解，即得；
[0009]
b、分别取对照品溶液和供试品溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
[0010]
色谱柱：以3.5μm的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
[0011]
流动相：体积比70：30的水-乙腈；
[0012]
流速：0.8ml/min；
[0013]
所述稀释剂为30％，v/v乙腈水溶液。
[0014]
进一步地，步骤a)所述醋酸泼尼松龙滴眼液与稀释剂的体积比为0.5～2.5：10ml。
[0015]
进一步地，步骤b)所述对照品溶液中醋酸泼尼松龙的浓度为1～5μg/ml。
[0016]
进一步地，所述色谱柱为xterrams c18，规格150
×
4.6mm，3.5μm。
[0017]
进一步地，步骤c)所述色谱条件中进样量10μl，波长为254nm，柱温为35℃，样品温度：5℃。
[0018]
进一步地，所述供试品溶液的色谱图中有关物质色谱峰与醋酸泼尼松龙色谱峰的相对保留时间分别为ep杂质a 1.08、ep杂质b 0.35、ep杂质c 2.03、ep杂质d 0.66、ep杂质e 2.11。
[0019]
本发明还提供了一种醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质的含量测定方法，具体操作步骤如下：
[0020]
1)取待测样品，按前述方法检测；
[0021]
2)按如下公式计算有关物质的含量：
[0022][0023]
其中，aspl为供试品溶液中醋酸泼尼松龙峰面积；astd为六针对照品溶液中醋酸泼尼松龙平均峰面积；wstd为对照品溶液中醋酸泼尼松龙称样量；dstd为对照品溶液稀释倍数；l为待测样品中醋酸泼尼松龙的标示量；dspl为待测样品稀释倍数；p为醋酸泼尼松龙对照品的纯度；rrf为杂质的相对响应因子。
[0024]
进一步地，所述杂质的相对响应因子分别为：ep杂质a 1.02，ep杂质b 1.12，ep杂质c 0.87，ep杂质d 1.17，ep杂质e 0.88，其余杂质1。
[0025]
本发明提供的检测方法采用特定的色谱柱及色谱条件，能够同时准确测定醋酸泼尼松龙滴眼液中ep杂质a、ep杂质b、ep杂质c，ep杂质d和ep杂质e，从而解决醋酸泼尼松龙眼用混悬剂的质量控制问题，有利于对醋酸泼尼松龙眼用混悬剂进行质量管控。
[0026]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0027]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0028]
图1参考文献对照品及各杂质混合溶液
[0029]
图2参考文献中空白溶液
[0030]
图3参考文献样品溶液
[0031]
图4参考文献酸破坏溶液
[0032]
图5参考文献酸空白
[0033]
图6参考文献碱破坏溶液-1
[0034]
图7参考文献碱破坏溶液-2
[0035]
图8参考文献碱空白
[0036]
图9参考文献氧化破坏溶液
[0037]
图10参考文献氧化空白
[0038]
图11参考文献高温破坏溶液-1
[0039]
图12参考文献高温破坏溶液-2
[0040]
图13线性考察结果
[0041]
图14空白溶液
[0042]
图15对照品溶液
[0043]
图16对照品及各杂质混合溶液
[0044]
图17placebo溶液
[0045]
图18loq信噪比溶液
[0046]
图19正常样品图谱
[0047]
图20酸破坏图谱
[0048]
图21碱空白图谱
[0049]
图22碱破坏图谱-1
[0050]
图23碱破坏图谱-2
[0051]
图24氧化空白图谱
[0052]
图25氧化破坏图谱
[0053]
图26高温破坏图谱
具体实施方式
[0054]
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0055]
实施例1醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质检测
[0056]
a、供试品溶液制备：精密移取醋酸泼尼松龙滴眼液，加稀释剂稀释10倍v/v，ml/ml，混合均匀；
[0057]
b、对照品溶液制备：
[0058]
对照品储备溶液的制备：称取醋酸泼尼松龙对照品，加稀释剂溶解稀释至醋酸泼尼松龙浓度2μg/ml，即得；
[0059]
其中稀释剂为30％乙腈水溶液；
[0060]
c、分别吸取供试品溶液和混对照品溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
[0061]
流动相：纯化水：乙腈＝70:30(v:v)；
[0062]
检测波长：254nm；
[0063]
色谱柱：xterrams c18,3.5μm,150x 4.6mm or equivalent；
[0064]
流速：0.8ml/min；
[0065]
进样量：10μl
[0066]
柱温：35℃
[0067]
样品温度：5℃；
[0068]
运行时间：40min
[0069]
d、供试品溶液的色谱图中与醋酸泼尼松龙色谱峰的相对保留时间分别为1.08、0.35、2.03、0.66、2.11处有色谱峰，判定醋酸泼尼松龙滴眼液中存在ep杂质a ep杂质b、ep杂质c、ep杂质d、ep杂质e。
[0070]
实施例2醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质含量测定
[0071]
a、供试品溶液制备：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至10ml容量瓶中，加稀释剂稀释到刻度，混合均匀；
[0072]
b、对照品溶液制备：
[0073]
对照品储备溶液的制备：称取10.0mg醋酸泼尼松龙对照品，精密称量，至50ml容量瓶中，加稀释剂，并振摇使其溶解，定容到刻度，摇匀；再取上述溶液4ml至20ml容量瓶中，用稀释剂定容，混匀。(对照品储备溶液浓度：40μg/ml)；
[0074]
对照品溶液制备：精密移取对照品储备溶液0.5ml至10ml容量瓶中，加稀释剂稀释到刻度，振摇，混合均匀，最终对照品溶液浓度：2μg/ml；
[0075]
其中稀释剂为30％乙腈水溶液；
[0076]
c、分别吸取供试品溶液和对照品溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
[0077]
流动相：纯化水：乙腈＝70:30(v:v)；
[0078]
检测波长：254nm；
[0079]
色谱柱：xterra ms c18,3.5μm,150x 4.6mm or equivalent；
[0080]
流速：0.8ml/min；
[0081]
进样量：10μl
[0082]
柱温：35℃
[0083]
样品温度：5℃；
[0084]
运行时间：40min
[0085]
d、按如下公式计算有关物质的含量：
[0086][0087]
其中，aspl为供试品溶液中醋酸泼尼松龙峰面积；astd为六针对照品溶液中醋酸泼尼松龙平均峰面积；wstd为对照品溶液中醋酸泼尼松龙称样量，mg；dstd为对照品溶液稀释倍数；l为待测样品中醋酸泼尼松龙的标示量，10.0mg/ml；dspl为待测样品稀释倍数；p为醋酸泼尼松龙对照品的纯度，以mg/mg计；rrf为杂质的相对响应因子，非特定杂质rrf＝1；特定杂质rrf分别为：ep杂质a 1.02，ep杂质b 1.12，ep杂质c 0.87，ep杂质d 1.17，ep杂质e 0.88，
[0088]
以下通过试验例的方式进一步说明本发明的有益效果：
[0089]
试验例1醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质研究
[0090]
参考《rp—hplc法测定帕利百中醋酸泼尼松龙的含量及其有关物质》方法检测醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质
[0091]
1、方法
[0092]
1.1溶液配制
[0093]
稀释剂：乙腈
[0094]
对照品及各杂质混合溶液：称取醋酸泼尼松龙标准品，加稀释剂溶解稀释成浓度为0.4μg/ml的对照品溶液，备用；分别称取ep杂质a、b、c、d、e，加乙腈溶解，再吸取各杂质单一溶液，混合后加稀释剂稀释成各杂质浓度为0.04mg/ml的杂质混合溶液；最后分别吸取0.5ml对照品溶液和杂质混合溶液，混合后用稀释剂定容为各物质浓度为2μg/ml的对照品及各杂质混合溶液。
[0095]
样品溶液：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至15ml离心管中，加入2.0ml乙腈，闭塞、振摇、离心，取上清液进样；
[0096]
空白溶液：稀释剂
[0097]
碱破坏样品溶液：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至15ml离心管中，加入0.1ml 1n氢氧化钠溶液，闭塞、混匀，室温放置16h，再加入0.1ml1n盐酸溶液和2.0ml乙腈，闭塞、振摇、离心，取上清液进样；
[0098]
碱空白溶液：精密移取0.1ml 1n氢氧化钠溶液至15ml离心管中，闭塞、混匀，室温放置16h，再加入0.1ml 1n盐酸溶液和2.0ml乙腈，闭塞、振摇、离心，取上清液进样；
[0099]
酸破坏样品溶液：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至15ml离心管中，加入0.1ml 1n盐酸溶液，闭塞、混匀，室温放置16h，再加入0.1ml 1n氢氧化钠溶液和2.0ml乙腈，闭塞、振摇、离心，取上清液进样；
[0100]
酸空白溶液：精密移取0.1ml 1n盐酸溶液至15ml离心管中，闭塞、混匀，室温放置16h，再加入0.1ml 1n氢氧化钠溶液和2.0ml乙腈，闭塞、振摇、离心，取上清液进样；
[0101]
氧化破坏样品溶液：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至15ml离心管中，加入2滴30％过氧化氢，闭塞、混匀，室温放置16h，再加入2.0ml乙腈，闭塞、振摇、离心，取上清液进样；
[0102]
氧化空白溶液：取两滴30％过氧化氢至15ml离心管中，闭塞、混匀，室温放置16h，再加入2.0ml乙腈，闭塞、振摇、离心，取上清液进样；
[0103]
高温破坏样品溶液：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至15ml离心管中，置80℃水浴5h，再加入2.0ml乙腈，闭塞、振摇、离心，取上清液进样。
[0104]
1.2色谱条件
[0105]
流动相：纯化水：乙腈＝69:31(v:v)
[0106]
检测波长：254nm
[0107]
色谱柱：100rp-185μm,250x4mm or equivalent
[0108]
流速：1.0ml/min
[0109]
进样量：20μl
[0110]
柱温：30℃
[0111]
样品温度：25℃
[0112]
稀释溶剂：乙腈
[0113]
运行时间：60min
[0114]
2、结果
[0115]
2.1对照品及各杂质混合溶液出峰结果见图1和表1。
[0116]
表1各杂质的出峰时间
[0117]
化合物名称保留时间min相对保留时间namertrrtep impurity b6.880.32ep impurity d13.910.65prednisolone acetate21.54-ep impurity a23.441.09ep impurity c42.681.98ep impurity e47.142.19
[0118]
2.2强制降解色谱图结果
[0119]
表2强降解实验结果
[0120][0121][0122]
从结果可见：参考方法中正常状态下的样品和酸、碱、氧化、高温破坏的样品的色谱图中ep杂质a的峰纯度角(purity angle)大于纯度阈值(purity threshold)，即峰纯度不足，致使其方法不足以能够准确定量检测出所有杂质。
[0123]
通过对样品溶剂、色谱柱、流动相洗脱程序、流速的进一步大量筛选，发现液相色谱图中醋酸泼尼松龙和ep杂质a的色谱峰紧紧相邻，分离度很难达达到药典规定，即使分离度符合预期，但醋酸泼尼松龙色谱峰尾部依然对ep杂质a色谱峰起始部位存在影响，进而干扰到ep杂质a的准确定量测定。
[0124]
本发明经不断尝试测试，发现色谱柱和流动相能显著的影响到醋酸泼尼松龙和ep杂质a的色谱行为，当样品经特定的溶剂稀释后，在特定的色谱柱和流速的作用下，能实现ep杂质a的准确定量，并经反复试验确定了醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质的测定方法及计算公式，具体如下：
[0125]
1)供试品溶液制备：精密移取醋酸泼尼松龙滴眼液，加稀释剂稀释10倍，混合均匀；
[0126]
2)对照溶液制备
[0127]
对照品溶液制备：
[0128]
对照品储备溶液的制备：称取醋酸泼尼松龙对照品，精密称量，加30％乙腈水溶液溶解稀释成浓度为40μg/ml的对照品储备溶液；
[0129]
对照品溶液的制备：精密移取对照品储备溶液，加30％乙腈水溶液稀释成最终浓度2μg/ml的对照品溶液；
[0130]
3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液注入色谱仪，色谱条件如下：
[0131]
流动相：纯化水：乙腈＝70:30(v:v)；
[0132]
检测波长：254nm；
[0133]
色谱柱：xterra ms c18,3.5μm,150x 4.6mm or equivalent；
[0134]
流速：0.8ml/min；
[0135]
进样量：10μl
[0136]
柱温：35℃
[0137]
样品温度：5℃；
[0138]
运行时间：40min
[0139]
4)供试品溶液的色谱图中与醋酸泼尼松龙色谱峰的相对保留时间分别为1.08、0.35、2.03、0.66、2.11处有色谱峰，判定醋酸泼尼松龙滴眼液中存在ep杂质a ep杂质b、ep杂质c、ep杂质d、ep杂质e。
[0140]
并按如下公式计算有关物质的含量：
[0141][0142]
其中，aspl为供试品溶液中醋酸泼尼松龙峰面积；astd为六针对照品溶液中醋酸泼尼松龙平均峰面积；wstd为对照品溶液中醋酸泼尼松龙称样量，mg；dstd为对照品溶液稀释倍数；l为待测样品中醋酸泼尼松龙的标示量，10.0mg/ml；dspl为待测样品稀释倍数；p为醋酸泼尼松龙对照品的纯度，以mg/mg计；rrf为杂质的相对响应因子，非特定杂质rrf＝1；特定杂质rrf分别为：ep杂质a 1.02，ep杂质b 1.12，ep杂质c 0.87，ep杂质d 1.17，ep杂质e 0.88。
[0143]
试验例2——方法学研究
[0144]
1、线性考察
[0145]
1.1溶液配制：
[0146]
chk储备溶液：称取醋酸泼尼松龙标准品10.36mg至50ml容量瓶，用稀释剂溶解定容；再取溶液4ml至20ml容量瓶，用稀释剂定容，混匀。
[0147]
杂质混合储备溶液：分别取2mg ep杂质a、b、c、d、e至五个5ml容量瓶中，用乙腈溶解定容；再分别取1ml各杂质单一溶液至同一10ml容量瓶中，用稀释剂定容，混匀。
[0148]
分别按表3配比吸取chk储备溶液、杂质混合储备溶液、稀释剂，
[0149]
配制系列浓度的待测溶液。
[0150]
表3线性溶液配制表
[0151]
levell1(loq)l2l3l4l5l6chk储备溶液(ml)0.10.30.512.53
杂质混合储备溶液(ml)0.10.30.512.53最终定容体积(ml)101010101010浓度(μg/ml)0.41.2241012
[0152]
同时配制空白溶液、醋酸泼尼松龙对照品溶液，以空白溶液、醋酸泼尼松龙对照品溶液作为参比：
[0153]
空白溶液：稀释剂
[0154]
醋酸泼尼松龙对照品溶液：精密称量醋酸泼尼松龙对照品，加30％乙腈水溶液溶解稀释成浓度为2μg/ml的对照品溶液；
[0155]
1.2检测结果
[0156]
取上述系列浓度的待测溶液、空白溶液、醋酸泼尼松龙对照品溶液按试验例1中最终确定的色谱条件检测，具体结果见表4和图13～16，从结果可见：醋酸泼尼松龙和特定杂质的分离度良好，不存在相互干扰，且当醋酸泼尼松龙和特定杂质在浓度0.4μg/ml(loq)至12μg/ml浓度范围，各组分r均大于0.99，线性关系良好，符合可接受标准。
[0157]
表4线性范围考察结果
[0158][0159]
2、准确度和重复性考察
[0160]
2.1溶液配制
[0161]
chk储备溶液：称取醋酸泼尼松龙标准品10.36mg至50ml容量瓶，用稀释剂溶解定容；再去上述溶液4ml至20ml容量瓶，用稀释剂定容，混匀。
[0162]
杂质混合储备溶液：分别取2mg ep杂质a、b、c、d、e至五个5ml容量瓶中，用乙腈溶解定容；再分别取1ml各杂质单一溶液至同一10ml容量瓶中，用稀释剂定容，混匀。
[0163]
placebo：按照市售品配方组分，用除开原料药的其他组分配置而成。
[0164]
分别按表5配比吸取placebo、chk储备溶液、杂质混合储备溶液，稀释剂配制三个浓度水平的待测溶液。
[0165]
表5准确度溶液配制表
[0166]
levela1(loq)a-0.2％a-1.2％placebo(ml)110.5chk储备溶液(ml)0.10.51.5杂质混合储备溶液(ml)0.10.51.5最终定容体积(ml)10105浓度(μg/ml)0.4212
[0167]
2.2检测结果
[0168]
取上述待测溶液和placebo溶液按试验例1中最终确定的色谱条件检测，并计算平
行配制三个浓度水平的含量的回收率，具体结果见表6～表11，图17。
[0169]
从结果可见：安慰剂中未检出特定杂质，结果均符合可接受标准(l-0.04回收率在70％～130％；其余两个水平回收率在80％～120％)；重复性以每个杂质的三个浓度水平9针回收率的％rsd计，均符合可接受标准(％rsd≤15％)。
[0170]
表6 ep杂质b准确度结果
[0171][0172]
表7 ep杂质d准确度结果
[0173][0174]
表8 ep杂质a准确度结果
[0175]
[0176][0177]
表9 ep杂质c准确度结果
[0178][0179]
表10 ep杂质e准确度结果
[0180][0181]
表11非特定杂质准确度结果
[0182][0183]
3、定量限(0.04％)
[0184]
溶液参照线性溶液l1(loq)，连续进样6针，按试验例1中最终确定的色谱条件检测，结果见表12，图18。
[0185]
从结果可见：6针溶液的峰面积rsd％均小于可接受标准10％，且信噪比大于10，符合要求。
[0186]
表12 loq结果表
[0187][0188]
4、溶液稳定性
[0189]
4.1标准溶液
[0190]
标准溶液(使用试验例1中最终确定的对照品溶液制备方法制备而成)在室温避光条件下保存，期间在0h、47h、67h取样，按试验例1中最终确定的色谱条件检测，结果见表13。
[0191]
表13标准溶液稳定性
[0192][0193]
从结果可见：在室温避光条件下标准溶液能稳定67小时。
[0194]
4.2样品溶液
[0195]
样品溶液(使用试验例1中最终确定的供试品溶液制备方法制备而成)在室温避光条件下保存，期间在0h、7h、25h、45h取样，按试验例1最终确定的色谱条件检测，结果见表14。
[0196]
表14样品溶液稳定性
[0197][0198]
从结果可见：样品溶液在室温避光条件下稳定7小时。
[0199]
5、强制降解
[0200]
5.1溶液配置
[0201]
正常样品溶液：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至10ml容量瓶中，加稀释剂稀释到刻度，混合均匀；
[0202]
碱破坏样品溶液：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至10ml容量瓶中，加入0.5ml 1n氢氧化钠溶液，轻摇，室温放置0.5h，再加入0.5ml 1n盐酸溶液，用稀释剂定容，混匀。
[0203]
碱空白溶液：精密移取0.5ml 1n氢氧化钠溶液至10ml容量瓶中，加入，轻摇，室温
放置0.5h，再加入0.5ml 1n盐酸溶液，用稀释剂定容，混匀。
[0204]
酸破坏样品溶液：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至10ml容量瓶中，加入0.5ml 1n盐酸溶液，轻摇，室温放置1h，再加入0.5ml 1n氢氧化钠溶液，用稀释剂定容，混匀。
[0205]
氧化破坏样品溶液：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至10ml容量瓶中，加入0.5ml30％过氧化氢，轻摇，水浴70℃放置1h，用稀释剂定容，混匀。
[0206]
氧化空白溶液：取两滴30％过氧化氢至10ml容量瓶中，轻摇，水浴70℃放置1h，用稀释剂定容，混匀。
[0207]
高温破坏样品溶液：精密移取1.0ml醋酸泼尼松龙滴眼液至10ml容量瓶中，置70℃水浴2h，用稀释剂定容，混匀。
[0208]
5.2检测结果
[0209]
取强制降解后的溶液，按试验例1中最终确定的色谱条件检测，结果见表15。
[0210]
表15强降解实验条件及结果
[0211] 强度时间温度链接图谱编号正常样品nana室温图19酸1n hcl(0.5ml)1h室温图20碱空白1n naoh(0.5ml)0.5h室温图21碱1n naoh(0.5ml)0.5h室温图22和图23氧化空白30％h2o2(0.5ml)1h70℃图24氧化30％h2o2(0.5ml)1h70℃图25高温na2h70℃图26
[0212]
从每个实验条件的图谱可见：样品中的稀释剂和安慰剂在醋酸泼尼松龙和特定杂质峰位置无干扰；样品对酸，氧化，高温稳定，未产生干扰峰，在碱条件下不稳定，但是降解出的杂质对主成分和其他特定杂质的测定无干扰。
[0213]
综上，本发明醋酸泼尼松龙滴眼液有关物质的检测方法，能够同时准确测定醋酸泼尼松龙滴眼液中ep杂质a、ep杂质b、ep杂质c，ep杂质d和ep杂质e，从而解决醋酸泼尼松龙眼用混悬剂的质量控制问题，有利于对醋酸泼尼松龙眼用混悬剂进行质量管控，具备实际应用推广价值。