一种d-生物素的HPLC检测方法与流程

一种d-生物素的hplc检测方法
技术领域
1.本发明属于化学分析领域，具体涉及d-生物素的hplc检测方法。


背景技术：

2.d-生物素(d-biotin)化学式为c
10h16
o3n2s，分子量244，在自然界中分布广泛，是生物生命活动中必须的维生素之一，对动物生理具有不可替代的作用，参与生物体内羧化及脱羧反应，并在代谢过程中的脂肪酸和嘌呤的合成，以及脂肪酸的代谢中起到重要作用，已大量应用于医药、检测等方面。
3.生物素与亲和素之间非常稳定的、非共价作用在化学和生物学领域是最常运用的工具之一。生物素与亲和素、链霉亲和素等均有较高亲和性和结合力，其结合力是已知自然界中最强的非共价作用(kd＝10-15m)。在多肽蛋白药物领域，已广泛利用生物素与亲和素之间的相互作用，进行蛋白纯化、检测、固化、药物导向、蛋白质结构分析等多种用途。
4.随着d-生物素在检测及结构分析方面的应用越来越广，生物素的纯度检测方法的开发日益重要，方法除要求准确易行外，要尽可能提高生物素的检测灵敏度。
5.由于生物素分子带有羧基，是弱酸性化合物，在中性溶液中部分以离子形式存在，极性较强，因此在反相色谱柱上几乎无保留，仅用乙腈-水体系作流动相，无论何种比例的乙腈-水，生物素都在3min之前出峰，几乎没有保留，且峰形前伸并展宽。cn101504393b通过选择一定量的三氟乙酸作为离子对试剂的乙腈和水体系作为流动相，对生物素在柱中的保留和改善峰形拖尾方面，具有一定作用，但仍不能满足灵敏度的要求。
6.鉴于此，提出本技术。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明的目的是提供一种生物素的hplc检测方法，主要解决hplc方法下高灵敏的d-生物素纯度检测。
8.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种d-生物素的hplc检测方法，以常规键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，以乙腈-水体系为流动相，同时添加三氟乙酸和磷酸双离子对试剂进行hplc检测。
9.优选地，选用质量浓度为0.05％的三氟乙酸水溶液-乙腈-磷酸作为流动相。
10.具体地，流动相中三氟乙酸水溶液、乙腈与磷酸的体积比为60-80：40-20：0.5-1，流速0.8-1.2ml/min。
11.优选地，检测波长210-220nm，等度洗脱，进样体积为10μl，柱温为30-40℃。
12.在一个优选的实施方式中，以常规键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，选用质量浓度为0.05％的三氟乙酸水溶液-乙腈-磷酸作为流动相，流动相中三氟乙酸水溶液、乙腈与磷酸的体积比为60-80：40-20：0.05-0.1，流速0.8-1.2ml/min，检测波长210-220nm，等度洗脱，进样体积为10μl，柱温为30-40℃。
13.优选地，流动相中三氟乙酸水溶液、乙腈与磷酸的体积比为75：25：0.1。
14.优选地，流速1.0ml/min，检测波长210nm，等度洗脱，进样体积为10μl，柱温为35℃。
15.在一个优选的实施方式中，流动相中三氟乙酸水溶液、乙腈与磷酸的体积比为75：25：0.1；流速1.0ml/min，检测波长210nm，等度洗脱，进样体积为10μl，柱温为35℃。
16.有益效果：本发明通过选用三氟乙酸及磷酸双离子对试剂的乙腈和水体系作流动相，获得了更为良好的峰型及检测灵敏度，对生物素色谱的保留起到增强作用，为d-生物素的hplc检测标准提供更为良好峰型、高检测灵敏度，及增强保留作用的方法，对于使用d-生物素的实验提供质控标准参考。
附图说明
17.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
18.图1为色谱柱柱效验证分析图；
19.图2为:0.05％tfa水溶液和乙腈(75：25)流动相条件下，0.5mg/ml浓度生物素分析图；
20.图3为0.05％tfa水溶液和乙腈(75：25)流动相条件下，0.1mg/ml浓度生物素分析图；
21.图4为0.05％tfa水溶液和乙腈(75：25)流动相条件下，0.05mg/ml浓度生物素分析图；
22.图5为0.05％tfa水溶液、磷酸和乙腈(75：0.1：25)流动相条件下，0.5mg/ml浓度生物素分析图；
23.图6为0.05％tfa水溶液、磷酸和乙腈(75：0.1：25)流动相条件下，0.1mg/ml浓度生物素分析图；
24.图7为0.05％tfa水溶液、磷酸和乙腈(75：0.1：25)流动相条件下，0.05mg/ml浓度生物素分析图；
25.图8为0.05％tfa水溶液、磷酸和乙腈(75：0.05：25)流动相条件下，0.5mg/ml浓度生物素分析图；
26.图9为0.05％tfa水溶液、磷酸和乙腈(75：0.05：25)流动相条件下，0.05mg/ml浓度生物素分析图。
具体实施方式
27.仪器与试药：
28.高效液相色谱仪(agilent 1260)，色谱柱为ultimate lp-c18-5um，4.6*250mm。
29.乙腈、磷酸及tfa为色谱纯,乙醇为分析纯，水为纯化水，生物素为阿拉丁公司销售产品(货号b105434)。
30.色谱柱柱效实验：
31.取混合系统稳定性实验标准品进样检测，测定柱效及分离度，结果如图1显示，理论塔板数5000以上，分离度符合要求。
32.取0.5mg/ml及0.05mg/ml浓度生物素样本，分别放置2h及4h后进样检测，结果表明
色谱峰各峰峰面积及百分比均无明显变化，rsd均在1％以内。
33.实施例
34.生物素为无色针状结晶体，微溶于冷水，能溶于乙醇，在酸性溶液中能耐高压加热，在碱性溶液中加热容易破坏，它易被氧化而失去生理活性。故准确称取生物素，加入少量乙醇后用纯净水溶解并定容至1.0mg/ml，40℃水浴加热溶解生物素，用0.22um滤膜过滤后，纯水稀释至0.5mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，待测。
35.将上面相同溶解溶剂作对照液，将0.5mg/ml生物素样本，用紫外分光光度计(波长为190～300nm)进行扫描，确定生物素最佳紫外检测波长。经扫描，结合乙腈紫外吸收限值，在保证最大吸收值情况下，最终选择210nm作为最适紫外检测波长。
36.将0.5mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml三浓度样本，分别用agilent 1260ⅱ反相高效液相色谱分析仪进行检测，检测器为紫外，等度洗脱；流动相质量百分比0.05％tfa水溶液和乙腈(75：25)，等度洗脱，检测波长为210nm，流速为1.0ml/min，进样体积为20ul，柱温为35℃。分析结果见图2-图4。
37.将0.5mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml三浓度样本，分别用agilent 1260ⅱ反相高效液相色谱分析仪进行检测，流动相为质量百分比0.05％tfa水溶液、磷酸和乙腈(75：0.1：25)，等度洗脱，检测波长为210nm，流速为1.0ml/min，进样体积为20μl，柱温为35℃。分析结果见图5，图6及图7。
38.将0.5mg/ml，0.05mg/ml两浓度样本，分别用agilent 1260ⅱ反相高效液相色谱分析仪进行检测，流动相为质量百分比0.05％tfa水溶液、磷酸和乙腈(75：0.05：25)，等度洗脱，检测波长为210nm，流速为1.0ml/min，进样体积为20μl，柱温为35℃。分析结果见图8，图9。
39.从各谱图结果可以看出，含0.05％或0.1％磷酸的tfa乙腈水溶液的流动相，其生物素检测保留时间明显优于未含磷酸的流动相，便于生物素结合反应时，对其他反应底物、反应产物的同步检测监控，同时，双离子对试剂下，生物素的整体峰面积均明显高于只用tfa做离子对试剂的条件，灵敏度更高，更加利于相关反应监测。
40.添加0.1％的磷酸的流动相，生物素峰面积略优于0.05％，说明流动相中加入0.1％磷酸后，生物素的检测灵敏度略高于0.05％磷酸浓度。含0.05％tfa及0.1％磷酸的水溶液，其ph值已接近于1.5，考虑到色谱柱耐受ph范围，未尝试0.1％磷酸以上质量浓度的磷酸加入实验。
41.本发明通过在弱酸性介质的流动相中抑制生物素的电离，使生物素以分子形式存在，降低极性，延长生物素分子在反相柱上的保留时间，并改善生物素流出峰的形状。
42.本发明提供了一种d-生物素的hplc的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。