1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种多功能复合探针的制备方法。
背景技术：
2.乙型肝炎是乙肝病毒(hbv)所引起的一种传播快、潜伏期长、危害广的传染病，我国慢性无症状hbv感染者或慢性无症状hbv携带者已超过1.2亿，是hbv感染者中存在数量最大的群体。采用有效的指标和方法实现早期诊断和病情监测对于控制传播、判断预后和指导用药都有重要意义。目前，临床诊断乙肝的主要手段是利用抗原抗体反应和聚合物酶链反应，前者会存在一定的窗口期漏检的情况，而后者在检测的过程中又经常发生交叉污染而造成假阳性率高，上述问题限制了其应用。随着纳米材料的发展，为医学检测也提供了新的方向。因此，如何制备性能优异的纳米材料并将其与蛋白质/核酸等生物分子进行结合，对于病毒检测具有重要的意义。
技术实现要素：
3.本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种多功能复合探针的制备方法，该方法制得的复合探针稳定性好，用于检测乙肝病毒时，灵敏度高。
4.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
5.一种基于多功能复合探针的病毒检测方法，包括以下步骤：
6.(1)将甲基三辛基氯化铵、甲基丙烯酸聚乙二醇酯溶于去离子水中，然后加入2-乙烯基吡啶和二乙烯基苯，搅拌升温，之后加入偶氮二异丁基脒盐酸盐溶液，继续搅拌反应，反应结束后将反应液离心处理，离心得到的沉淀采用去离子水分散，制得乳胶粒子分散体；
7.(2)将乳胶粒子水分散体和加入氯金酸溶液搅拌混合处理，之后加入二甲胺基甲硼烷溶液搅拌还原，制得改性纳米金颗粒；
8.(3)氮气气氛下，将二氯化铁和三氯化铁溶于去离子水中，然后升温，并加入氢氧化钠溶液进行第一次搅拌反应，反应结束后冷却至室温，将反应液过滤，制得四氧化三铁纳米颗粒，将其分散在无水乙醇中，加入aptes，进行第二次搅拌反应，反应结束后，真空干燥，制得氨基化的磁性材料；
9.(4)将上述氨基化的磁性材料、改性纳米金颗粒分散在去离子水中，之后加入edc和nhs的mes缓冲液，搅拌混合处理，然后加入dna探针分散液，搅拌处理，之后加入pbs缓冲液，静置处理，之后将混合液过滤，过滤得到的固体重新分散在pbs缓冲液中，制得多功能复合探针分散液。
10.作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述偶氮二异丁基脒盐酸盐溶液的浓度为1.5wt％，所述甲基三辛基氯化铵、去离子水、甲基丙烯酸聚乙二醇酯、2-乙烯基吡啶、二乙烯基苯、偶氮二异丁基脒盐酸盐溶液的用量比为3g：300ml：(4-5)g：50g：(2-3)g：20ml。
11.作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述搅拌升温是将溶液加热至60℃后搅拌1h；所述搅拌反应的温度为60℃，搅拌反应的时间为24h。
12.作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述乳胶粒子水分散体的浓度为3wt％，氯金酸溶液的浓度为40mmol/l，二甲胺基甲硼烷溶液的浓度为13mmol/l，乳胶粒子水分散体、氯金酸溶液、二甲胺基甲硼烷溶液的用量比为(1-2)g：5ml：(14-15)ml。
13.作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述搅拌混合处理的时间为2-3h，搅拌还原处理的时间为2-3h。
14.作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，氢氧化钠溶液的浓度为1.2mmol/ml，所述二氯化铁、三氯化铁、氢氧化钠的摩尔比为(1.5-1.6)：3:13。
15.作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，所述第一次搅拌反应的温度为80-85℃，反应时间为1-2h；所述第二次搅拌反应的温度为室温，所述第二次搅拌反应的时间为7-8h。
16.作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，所述四氧化三铁纳米颗粒、aptes的用量比为(0.1-0.2)g：0.5ml。
17.作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，edc和nhs的mes缓冲液中edc的浓度为0.6-0.7mmol/ml，nhs的浓度为1.4-1.5mmol/l；dna探针分散液的质量浓度为1wt％；所述氨基化的磁性材料、改性纳米金颗粒、edc和nhs的mes缓冲液、dna探针分散液的用量比为(0.2-0.3)g：0.015g：1ml：0.5ml。
18.作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，所述搅拌混合处理的的时间为30min，静置处理的时间为48h。
19.由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
20.本发明提供的多功能复合探针是以纳米金颗粒作为基体，然后在其表面修饰乳胶纳米复合材料，杂化之后的纳米颗粒即使在分析物浓度较低的情况下，也具有很明显的颜色，从而提高复合探针的检测灵敏度。为了提高探针的可回收率，本发明将制得的四氧化三铁纳米颗粒表面进行氨基化处理，然后与乳胶颗粒杂化修饰的纳米金颗粒复配，使得乳胶颗粒/纳米金杂化颗粒稳定分散在四氧化三铁纳米颗粒表面，制得的复合探针不仅稳定性好，且检测灵敏度高。
具体实施方式
21.下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
22.实施例1
23.(1)将3g甲基三辛基氯化铵、4g甲基丙烯酸聚乙二醇酯溶于300ml去离子水中，然后加入50g2-乙烯基吡啶和2g二乙烯基苯，搅拌升温至60℃，搅拌处理1h，之后加入20ml浓度为1.5wt％偶氮二异丁基脒盐酸盐溶液，继续在60℃下搅拌反应24h，反应结束后将反应液离心处理，离心得到的沉淀采用去离子水分散，制得浓度为3wt％的乳胶粒子分散体；
24.(2)将1g乳胶粒子水分散体和5ml浓度为40mmol/l的氯金酸溶液搅拌混合处理2h，之后加入14ml浓度为13mmol/l的二甲胺基甲硼烷溶液搅拌还原2h，之后将反应液过滤，并将过滤得到的固体干燥，制得改性纳米金颗粒；
25.(3)氮气气氛下，将1.5mmol二氯化铁和3mmol三氯化铁溶于20ml去离子水中，然后升温至80℃，并加入11ml浓度为1.2mmol/ml氢氧化钠溶液进行第一次搅拌反应1h，反应结束后冷却至室温，将反应液过滤，制得四氧化三铁纳米颗粒，将1g四氧化三铁纳米颗粒分散
在200ml无水乙醇中，加入5mlaptes，室温下进行第二次搅拌反应7h，反应结束后，真空干燥，制得氨基化的磁性材料；
26.(4)将2g上述氨基化的磁性材料、0.15g改性纳米金颗粒分散在30ml去离子水中，之后加入10mledc和nhs的mes缓冲液，搅拌混合处理30min，然后加入5ml浓度为1wt％dna探针分散液，搅拌处理30min，之后加入pbs缓冲液，静置处理48h，之后将混合液过滤，过滤得到的固体重新分散在pbs缓冲液中，制得多功能复合探针分散液。
27.实施例2
28.(1)将3g甲基三辛基氯化铵、5g甲基丙烯酸聚乙二醇酯溶于300ml去离子水中，然后加入50g2-乙烯基吡啶和3g二乙烯基苯，搅拌升温至60℃，搅拌处理1h，之后加入20ml浓度为1.5wt％偶氮二异丁基脒盐酸盐溶液，继续在60℃下搅拌反应24h，反应结束后将反应液离心处理，离心得到的沉淀采用去离子水分散，制得浓度为3wt％的乳胶粒子分散体；
29.(2)将2g乳胶粒子水分散体和5ml浓度为40mmol/l的氯金酸溶液搅拌混合处理3h，之后加入15ml浓度为13mmol/l的二甲胺基甲硼烷溶液搅拌还原3h，之后将反应液过滤，并将过滤得到的固体干燥，制得改性纳米金颗粒；
30.(3)氮气气氛下，将1.6mmol二氯化铁和3mmol三氯化铁溶于20ml去离子水中，然后升温至85℃，并加入11ml浓度为1.2mmol/ml氢氧化钠溶液进行第一次搅拌反应2h，反应结束后冷却至室温，将反应液过滤，制得四氧化三铁纳米颗粒，将2g四氧化三铁纳米颗粒分散在200ml无水乙醇中，加入5mlaptes，室温下进行第二次搅拌反应8h，反应结束后，真空干燥，制得氨基化的磁性材料；
31.(4)将3g上述氨基化的磁性材料、0.15g改性纳米金颗粒分散在30ml去离子水中，之后加入10mledc和nhs的mes缓冲液，搅拌混合处理30min，然后加入5ml浓度为1wt％dna探针分散液，搅拌处理30min，之后加入pbs缓冲液，静置处理48h，之后将混合液过滤，过滤得到的固体重新分散在pbs缓冲液中，制得多功能复合探针分散液。
32.实施例3
33.(1)将3g甲基三辛基氯化铵、4g甲基丙烯酸聚乙二醇酯溶于300ml去离子水中，然后加入50g2-乙烯基吡啶和3g二乙烯基苯，搅拌升温至60℃，搅拌处理1h，之后加入20ml浓度为1.5wt％偶氮二异丁基脒盐酸盐溶液，继续在60℃下搅拌反应24h，反应结束后将反应液离心处理，离心得到的沉淀采用去离子水分散，制得浓度为3wt％的乳胶粒子分散体；
34.(2)将2g乳胶粒子水分散体和5ml浓度为40mmol/l的氯金酸溶液搅拌混合处理2h，之后加入15ml浓度为13mmol/l的二甲胺基甲硼烷溶液搅拌还原2h，之后将反应液过滤，并将过滤得到的固体干燥，制得改性纳米金颗粒；
35.(3)氮气气氛下，将1.6mmol二氯化铁和3mmol三氯化铁溶于20ml去离子水中，然后升温至80℃，并加入11ml浓度为1.2mmol/ml氢氧化钠溶液进行第一次搅拌反应2h，反应结束后冷却至室温，将反应液过滤，制得四氧化三铁纳米颗粒，将1g四氧化三铁纳米颗粒分散在200ml无水乙醇中，加入5mlaptes，室温下进行第二次搅拌反应8h，反应结束后，真空干燥，制得氨基化的磁性材料；
36.(4)将2g上述氨基化的磁性材料、0.15g改性纳米金颗粒分散在30ml去离子水中，之后加入10mledc和nhs的mes缓冲液，搅拌混合处理30min，然后加入5ml浓度为1wt％dna探针分散液，搅拌处理30min，之后加入pbs缓冲液，静置处理48h，之后将混合液过滤，过滤得
到的固体重新分散在pbs缓冲液中，制得多功能复合探针分散液。
37.实施例4
38.(1)将3g甲基三辛基氯化铵、4.5g甲基丙烯酸聚乙二醇酯溶于300ml去离子水中，然后加入50g2-乙烯基吡啶和2.5g二乙烯基苯，搅拌升温至60℃，搅拌处理1h，之后加入20ml浓度为1.5wt％偶氮二异丁基脒盐酸盐溶液，继续在60℃下搅拌反应24h，反应结束后将反应液离心处理，离心得到的沉淀采用去离子水分散，制得浓度为3wt％的乳胶粒子分散体；
39.(2)将2g乳胶粒子水分散体和5ml浓度为40mmol/l的氯金酸溶液搅拌混合处理2.5h，之后加入14ml浓度为13mmol/l的二甲胺基甲硼烷溶液搅拌还原2-3h，之后将反应液过滤，并将过滤得到的固体干燥，制得改性纳米金颗粒；
40.(3)氮气气氛下，将1.5mmol二氯化铁和3mmol三氯化铁溶于20ml去离子水中，然后升温至80℃，并加入11ml浓度为1.2mmol/ml氢氧化钠溶液进行第一次搅拌反应2h，反应结束后冷却至室温，将反应液过滤，制得四氧化三铁纳米颗粒，将1g四氧化三铁纳米颗粒分散在200ml无水乙醇中，加入5mlaptes，室温下进行第二次搅拌反应7.5h，反应结束后，真空干燥，制得氨基化的磁性材料；
41.(4)将2.5g上述氨基化的磁性材料、0.15g改性纳米金颗粒分散在30ml去离子水中，之后加入10mledc和nhs的mes缓冲液，搅拌混合处理30min，然后加入5ml浓度为1wt％dna探针分散液，搅拌处理30min，之后加入pbs缓冲液，静置处理48h，之后将混合液过滤，过滤得到的固体重新分散在pbs缓冲液中，制得多功能复合探针分散液。
42.实施例5
43.(1)将3g甲基三辛基氯化铵、5g甲基丙烯酸聚乙二醇酯溶于300ml去离子水中，然后加入50g2-乙烯基吡啶和3g二乙烯基苯，搅拌升温至60℃，搅拌处理1h，之后加入20ml浓度为1.5wt％偶氮二异丁基脒盐酸盐溶液，继续在60℃下搅拌反应24h，反应结束后将反应液离心处理，离心得到的沉淀采用去离子水分散，制得浓度为3wt％的乳胶粒子分散体；
44.(2)将1.5g乳胶粒子水分散体和5ml浓度为40mmol/l的氯金酸溶液搅拌混合处理2.5h，之后加入15ml浓度为13mmol/l的二甲胺基甲硼烷溶液搅拌还原2h，之后将反应液过滤，并将过滤得到的固体干燥，制得改性纳米金颗粒；
45.(3)氮气气氛下，将1.6mmol二氯化铁和3mmol三氯化铁溶于20ml去离子水中，然后升温至85℃，并加入11ml浓度为1.2mmol/ml氢氧化钠溶液进行第一次搅拌反应1.5h，反应结束后冷却至室温，将反应液过滤，制得四氧化三铁纳米颗粒，将2g四氧化三铁纳米颗粒分散在200ml无水乙醇中，加入5mlaptes，室温下进行第二次搅拌反应7h，反应结束后，真空干燥，制得氨基化的磁性材料；
46.(4)将2.5g上述氨基化的磁性材料、0.15g改性纳米金颗粒分散在30ml去离子水中，之后加入10mledc和nhs的mes缓冲液，搅拌混合处理30min，然后加入5ml浓度为1wt％dna探针分散液，搅拌处理30min，之后加入pbs缓冲液，静置处理48h，之后将混合液过滤，过滤得到的固体重新分散在pbs缓冲液中，制得多功能复合探针分散液。
47.将上述实施例制得的多功能复合探针用于检测乙肝病毒时，多功能复合探针的浓度为4.5nmol/l，可检测到最低浓度为3fmol/l的目标乙肝病毒dna。
48.此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作
各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。