荧光纳米颗粒、蛋白复合物和免疫检测试纸条

1.本技术涉及免疫检测技术领域，尤其是涉及荧光纳米颗粒、蛋白复合物和免疫检测试纸条。


背景技术：

2.现有的荧光免疫检测试纸条多数都基于量子点、荧光染料标记ps微球、胶束或sio2球等，其面临的关键问题在于整体制备工艺复杂，特别是抗体标记步骤繁琐、效率较低，成本高，这限制了其灵敏度的进一步提升，同时也存在稳定性差(如量子点易失活、荧光染料易漂白，微球、胶束易聚集)等问题。其中，抗体标记往往需要预先对其进行羧基或者胺基功能化修饰，以便后续共价偶联抗体蛋白，其技术路线往往是通过羧基或者胺基功能化的聚合物包覆标记颗粒，然后通过酰胺反应共价偶联抗体蛋白，整体工艺复杂、繁琐，抗体蛋白偶联效率不高或过高导致失活。


技术实现要素：

3.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种荧光纳米颗粒，利用这种荧光纳米颗粒可以得到工艺简单、偶联后不易失活的蛋白复合物、蛋白标记以及利用这种蛋白复合物构建的免疫检测试纸条。
4.本技术的第一方面，提供一种荧光纳米颗粒，荧光纳米颗粒包括aie配体和配位金属离子。
5.根据本技术实施例的荧光纳米颗粒，至少具有如下有益效果：
6.对于由aie配体和配位金属离子形成的荧光纳米颗粒，在标记蛋白时，蛋白能够在静电作用和范德华力的作用下直接与荧光纳米颗粒发生吸附从而结合到其表面，避免了现有技术中繁琐的标记步骤，同时有效提高了检测灵敏度。
7.其中，aie配体是指具有聚集诱导发光(aie)性质的分子，其可能的发光机理包括分子内运动受限(rim)、分子内旋转(rir)、振动受限(riv)等。aie分子目前大致可以分为仅含碳氢的化合物、含有杂原子的物质和金属复合物。在本技术实施例的方案中，aie分子作为配体与配位金属离子发生螯合形成荧光纳米颗粒从而作为指示物对吸附于其上的蛋白进行标记。
8.在本技术的一些实施方式中，aie配体上具有羧基、吡啶基、咪唑基，aie配体通过这些基团与配位金属离子形成荧光纳米颗粒。
9.在本技术的一些实施方式中，aie配体为具有以下结构的分子中的至少一种：
[0010][0011]
其中，x具有c＝c、c-n中的至少一种；
[0012]
y为n、p中的任一种；
[0013]
r1～r4分别独立选自氢原子、羧基、4-羧基苯基、吡啶基、咪唑基中的任一种，且至少两个不为氢原子；
[0014]
r5～r7分别独立选自羧基、4-羧基苯基、吡啶基、咪唑基中的任一种。
[0015]
在本技术的一些实施方式中，r1～r4分别独立选自氢原子、羧基、4-羧基苯基、4-吡啶基、咪唑基中的任一种，且至少两个不为氢原子；r5～r7分别独立选自羧基、4-羧基苯基、4-吡啶基、咪唑基中的任一种。
[0016]
在本技术的一些实施方式中，r1～r4分别独立选自羧基、4-羧基苯基、4-吡啶基、咪唑基中的任一种。
[0017]
在本技术的一些实施方式中，aie配体为具有以下结构的分子中的任一种：
[0018][0019]
在本技术的一些实施方式中，aie配体为具有以下结构的分子中的任一种：
[0020][0021]
其中，r1～r4分别独立选自氢原子、羧基、4-羧基苯基、吡啶基、咪唑基中的任一种，
且至少两个不为氢原子；
[0022]
r5～r7分别独立选自羧基、4-羧基苯基、吡啶基、咪唑基中的任一种。
[0023]
在本技术的一些实施方式中，r1～r4同时选自羧基、4-羧基苯基、吡啶基、咪唑基中的任一种；
[0024]
r5～r7同时选自羧基、4-羧基苯基、吡啶基、咪唑基中的任一种。
[0025]
在本技术的一些实施方式中，aie配体选自以下的至少一种：
[0026][0027][0028]
通过对aie结构的调整可以改变其荧光波长，以上述式(ⅰ)中的化合物为例，该aie
配体得到的荧光纳米颗粒具有蓝色荧光，而在其r1～r4中额外引入苯基后形成的式(ⅱ)的化合物最终得到的荧光纳米颗粒具有黄色荧光。
[0029]
在本技术的一些实施方式中，金属离子为第二副族元素以及其他具有稳定d轨道的金属元素的离子。
[0030]
在本技术的一些实施方式中，金属离子选自锌离子、锆离子、铪离子、镓离子、铟离子、锡离子和铋离子中的至少一种。
[0031]
在本技术的一些实施方式中，荧光纳米颗粒的粒径为50～1000nm。优选的，荧光纳米颗粒的粒径为50～500nm，50～200nm，150nm。通过调节荧光纳米颗粒的粒径，提高荧光纳米颗粒上蛋白的吸附量，从而进一步提高检测灵敏度。
[0032]
本技术的第二方面，提供一种蛋白复合物，该蛋白复合物包括前述的荧光纳米颗粒和吸附在荧光纳米颗粒上的蛋白。
[0033]
利用上述的荧光纳米颗粒对蛋白进行标记时，可以在静电作用和范德华力的作用下直接将其与荧光纳米颗粒发生吸附从而结合到荧光纳米颗粒表面，避免了现有技术中繁琐的标记步骤，同时有效提高了检测灵敏度。
[0034]
另一方面，采用这种方式得到的蛋白复合物可以在室温下放置一年以上而荧光强度不发生明显变化，具有良好的稳定性，不易失活。
[0035]
本技术的第三方面，提供一种蛋白标记方法，包括以下步骤：将荧光纳米颗粒与待标记的蛋白混合孵育1～5h，得到蛋白复合物；荧光纳米颗粒包括aie配体和配位金属离子。
[0036]
该标记方法直接将荧光纳米颗粒与待标记的蛋白孵育，即可将蛋白通过静电作用和范德华力吸附到荧光纳米颗粒上完成标记，整个过程步骤简单，标记效率高。
[0037]
在本技术的一些实施方式中，荧光纳米颗粒和待标记的蛋白混合孵育后，加入封闭液继续孵育，离心去除上清后，得到蛋白复合物。加入封闭液后继续孵育的时间可选0.1～2h，优选为1h。
[0038]
在本技术的一些实施方式中，荧光纳米颗粒的制备方法按如下：将aie配体、金属离子在70～120℃条件下混合反应，得到荧光纳米颗粒。
[0039]
在本技术的一些实施方式中，aie配体、金属离子的质量比为(1～10)：1。
[0040]
在本技术的一些实施方式中，金属离子的原料为金属盐，进一步以溶液形式参与反应，金属盐包括但不限于卤素盐、碳酸盐、硝酸盐、乙酸盐和硫酸盐等。
[0041]
本技术的第四方面，提供一种免疫检测试纸条，该免疫检测试纸条包括一抗，一抗包括前述的蛋白复合物，一抗用于特异性结合待测物。
[0042]
在本技术的一些实施方式中，还包括二抗和抗抗体，二抗用于特异性结合待测物；抗抗体用于特异性结合一抗。可以理解的是，为了形成二抗-待测物-一抗的复合体，二抗和一抗的结合位点不同。
[0043]
在本技术的一些实施方式中，免疫检测试纸条上限定出依次相连的样品区、结合区、检测区、吸附区。其中，样品区用于滴加待测物，结合区上包被有一抗，检测区内设有检测线(t线)和质控线(c线)，二抗包被于检测线上，抗抗体包被于质控线上。
[0044]
在本技术的一些实施方式中，免疫检测试纸条包括底板，底板上包括依次相连的样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫。
[0045]
在本技术的一些实施方式中，底板为聚合物薄膜，例如聚氯乙烯膜。样品垫为处理
液处理后的玻纤，处理液可以是含有triton x-100和防腐剂的磷酸盐缓冲液。标记垫为玻纤。层析膜为孔径在3～15μm的硝酸纤维素膜(nc膜)，优选为8μm孔径的nc膜。吸水垫为滤纸。
[0046]
在本技术的一些实施方式中，免疫检测试纸条的大小为(40～100)
×
(1～10)mm。
[0047]
在本技术的一些实施方式中，层析膜上间隔5～10mm划线标记有检测线和质控线。
[0048]
在本技术的一些实施方式中，免疫检测试纸条的使用方法为：将待测样品施加到免疫检测试纸条的样品区，确定免疫检测试纸条的荧光信号，根据荧光信号确定待测样品中的待测物含量。
[0049]
在本技术的一些实施方式中，免疫检测试纸条的使用方法为：将待测样品施加到免疫检测试纸条的样品区，再取工作缓冲液施加到样品区，进行层析，层析结束后确定免疫检测试纸条的荧光信号，根据荧光信号确定待测样品中的待测物含量。
[0050]
在本技术的一些实施方式中，根据荧光信号确定待测样品中的待测物含量的方法为：确定检测线和质控线的荧光信号，根据检测线的荧光信号与质控线的荧光信号的比值，确定待测样品中待测物的含量。
[0051]
本技术的第五方面，提供一种试剂盒，该试剂盒包括前述的蛋白复合物。
[0052]
本技术的第六方面，提供一种非诊断目的的检测方法，该检测方法使用前述的蛋白复合物，或前述的免疫检测试纸条，或前述的试剂盒进行检测。
[0053]
本技术还包括前述的蛋白复合物，或前述的免疫检测试纸条，或前述的试剂盒在进行非诊断目的的检测过程中的应用。
[0054]
本技术通过设计合成荧光量子产率高、对蛋白具有较强吸附作用的荧光纳米颗粒，简化了整体制备工艺，在标记过程中，蛋白与荧光纳米颗粒之间无需进行复杂的额外功能化修饰，两者混合均匀后直接摇床孵育，即可将蛋白通过静电作用以及范德华力作用吸附到荧光纳米颗粒表面。通过这种方式增加了蛋白在荧光纳米颗粒上的吸附量，使得最终的检测灵敏度有了显著的提升，其检测限相比于常规的荧光检测试纸条可以低一到两个数量级。
[0055]
本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明
[0056]
图1是本技术的实施例1制备得到的荧光纳米颗粒在不同尺度下的电镜图，从左到右的标尺分别为1μm、200nm和200nm。
具体实施方式
[0057]
以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。
[0058]
下面详细描述本技术的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
[0059]
在本技术的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
[0060]
本技术的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0061]
实施例1
[0062]
本实施例提供一种荧光纳米颗粒，该荧光纳米颗粒的制备方法如下：
[0063]
取质量比1：1的aie配体和氯化锆混合，80℃水浴反应5小时后离心，无水乙醇洗涤2次，去离子水重悬，得到荧光纳米颗粒的分散液。
[0064]
其中，aie配体选择式(ⅰ)所示的4,4',4”,4”'-(乙烯-1,1,2,2-四基)四苯甲酸，结构式如下：
[0065][0066]
该荧光纳米颗粒在紫外灯照射下可见强烈蓝色荧光(470nm)。参考图1，是该方法制备得到的荧光纳米颗粒的电镜图，其粒径在50nm～1μm不等，利用该荧光纳米颗粒可以直接与蛋白孵育完成标记，避免现有技术中繁琐的标记步骤。
[0067]
实施例2
[0068]
本实施例提供一种免疫检测试纸条，该免疫检测试纸条为甲胎蛋白(afp)检测试纸条，其制备原料以体积份计如下表1所示：
[0069]
表1.免疫检测试纸条制备原料
[0070][0071]
[0072]
其中，荧光纳米颗粒为实施例1中制备得到的荧光纳米颗粒，封闭液和重悬液为含有1w/v％bsa(牛血清蛋白)的0.02m磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.0)，工作缓冲液为含有0.1w/v％triton x-100的0.02m磷酸盐缓冲液。
[0073]
该免疫检测试纸条的具体制备过程如下：
[0074]
(1)将一抗蛋白afp-ab1与荧光纳米颗粒直接混合，置于摇床孵育3h后，加入封闭液继续孵育1h，经8000rpm离心10min后去除上清液，用重悬液重悬，得到吸附在荧光纳米颗粒上的一抗蛋白afp-ab1的一抗溶液，即对一抗蛋白完成标记，得到一抗蛋白对应的蛋白复合物的溶液。
[0075]
(2)将一抗溶液喷涂于标记垫，烘干备用；分别取二抗蛋白anti-afp-ab1和抗抗体afp-ab2划线于层析膜，形成t线和c线，烘干备用；样品垫经0.02m pbs处理液(2w/v％triton x-100，0.03wt％nan3，ph＝7.0)预处理后，将其与标记垫、层析膜、吸水垫、聚氯乙烯底板组装成免疫检测层析板，随后切割成60
×
3mm的免疫检测试纸条，置于干燥封闭的铝箔袋中备用。
[0076]
使用该免疫检测试纸条进行检测的方法如下：
[0077]
(1)标准曲线绘制：
[0078]
分别取0pg/ml、0.2pg/ml、0.5pg/ml、1pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、的甲胎蛋白标准品溶液滴加于样品垫，再取相应工作缓冲液滴加于样品垫，在紫外灯照射下观察层析结束至c线/t线稳定显色，荧光分析仪收集t线和c线的荧光信号，得到t线/c线的荧光信号的比值，根据不同标准品的荧光信号与浓度值之间的关系做曲线拟合，得到甲胎蛋白的标准曲线。
[0079]
(2)样品检测
[0080]
取待测样品按照步骤(1)的方法得到对应的t线/c线的荧光信号的比值，根据其标准曲线得出待测样品中甲胎蛋白的浓度。
[0081]
本实施例3次重复中最低在0.5pg/ml浓度的标准品滴加后均可以观察到t线/c线有明显蓝色荧光的阳性结果，因此，利用该免疫检测试纸条对甲胎蛋白的检测限《1pg/ml。
[0082]
对比例1
[0083]
本对比例提供一种甲胎蛋白(afp)检测试纸条，与实施例2的区别在于，标记垫上包被的是一抗蛋白afp-ab1、多壁碳纳米管以及水溶性量子点cdte形成的蛋白复合物。该蛋白复合物的具体制备方法如下：
[0084]
将0.02g氨基化碳纳米管用pbs(ph＝7.4)溶液分散，用0.1ml edc与0.15ml nhs活化10min后，加入100mg一抗蛋白afp-ab1，37℃孵育1h，离心去除上清后pbs复溶，再用0.1ml edc与0.15ml nhs活化10min后，加入5ml羧基包覆的cdte量子点，37℃孵育1h，离心去除上清后pbs复溶，得到蛋白复合物的分散液。
[0085]
按照实施例2中的方法分别取不同浓度的标准品进行检测，重复3次，结果表明该甲胎蛋白免疫检测试纸条的最低检测限为20pg/ml。
[0086]
与实施例2相比可以看出，本技术实施例所提供的一抗的标记方法更加简便，通过直接孵育而不需额外的功能化修饰，大大节约了人力、物力成本，不使用有剧烈毒性的cd镉离子，而且免疫检测试纸条的灵敏度大大提升。
[0087]
实施例3
[0088]
本实施例提供一种免疫检测试纸条，与实施例2的区别在于，标记一抗的荧光纳米颗粒采用式(ⅱ)所示的aie配体与硫酸锌反应得到，检测时分析黄光波段的荧光信号，与实施例2具有类似的检测限。
[0089]
实施例4
[0090]
本实施例提供一种免疫检测试纸条，与实施例2的区别在于，标记一抗的荧光纳米颗粒采用式(ⅲ)所示的aie配体与硝酸镓反应得到，与实施例2具有类似的检测限。
[0091]
实施例5
[0092]
本实施例提供一种免疫检测试纸条，与实施例2的区别在于，标记一抗的荧光纳米颗粒采用式(ⅳ)所示的aie配体与硫酸铋反应得到，与实施例2具有类似的检测限。
[0093]
实施例6
[0094]
本实施例提供一种免疫检测试纸条，与实施例2的区别在于，标记一抗的荧光纳米颗粒采用式(
ⅴ
)所示的aie配体与乙酸锡(iv)反应得到，与实施例2具有类似的检测限。
[0095]
上面结合实施例对本技术作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。