一种用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置及检测系统

1.本实用新型属于质谱检测与成像及分析技术领域，特别涉及一种用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置及检测系统。


背景技术：

2.近年来，激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(laser inductively coupled plasma massspectrometry，la
‑
icp
‑
ms)得到了飞速的发展。相比较于传统的电感耦合等离子体法，激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法减少了许多样品预处理的步骤，消除了水和酸带来的多原子干扰问题。通过激光对样品表面进行高能量的剥蚀，产生气溶胶，通过载气将气溶胶运载至电感耦合等离子体中进行检测，实现定量分析。与其他技术相比较，激光剥蚀电感耦合等离子体具有实时，原位，高分辨率，低检出限和高空间分辨率等优势。
3.生物组织微区成像检测是指对生物组织的特定微小区域进行元素含量测试，并且将元素含量在样品中的分布情况利用图像进行表示。然而，常温下剥蚀有以下几点不足：
4.(1)常温下剥蚀往往会出现生物样品的激光“热效应”，从而导致剥蚀坑边缘的熔化，增加分馏效应，进而影响检测的精密度与灵敏度。
5.(2)生物样品在脱水过程中，往往会导致金属元素的流失，从而造成了激光剥蚀检测与成像的不足。所以，在常温剥蚀的基础上，对生物组织微区成像检测使用激光剥蚀冷冻样品台，保证在低温下剥蚀，以解决常温下剥蚀的不足。
6.对生物组织微区成像检测使用的激光剥蚀冷冻样品台有着降低剥蚀热效应所导致的分馏效应，实现生物样品的原始形态检测，减少传统样品制备过程对生物样品的污染等优点，成为了近些年来激光剥蚀检测必不可少的样品台。
7.虽然冷冻条件下，la
‑
icp
‑
ms可以实现更好的剥蚀效果，现有的商用激光剥蚀冷冻样品台具有稳定性好，技术成熟的优点，这项技术也受到了越来越多科学研究者的关注。但是商用的激光剥蚀冷冻样品台也存在以下问题：
8.(1)价格昂贵，价格过万。
9.(2)商用激光剥蚀冷冻样品台，其适配性差，不利于进行进一步的技术升级改装。
10.(3)不利于更换损坏的零部件。
11.对于这些问题，实验室自制的激光剥蚀冷冻样品台操作范围大，有利于进一步改进与组装，受到了一定的青睐。但是目前报道的实验室自制激光剥蚀冷冻样品台存在以下问题：
12.(1)使用液氮等作为制冷气体，操作繁琐。
13.(2)温度降低过程慢，不利于实验效率的提高。
14.(3)冷冻温度的稳定性差，温度波动较大，从而影响实验的精度。


技术实现要素：

15.针对目前已有的商用激光剥蚀冷冻样品台与实验室自制激光剥蚀冷冻样品台所
存在的问题，本实用新型提供了一种用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置及检测系统，该用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置包括自组装的激光剥蚀冷冻样品台、循环冷凝水箱和电源。在激光剥蚀冷冻样品台中水冷板和半导体制冷片作为核心部位，实现了冷冻的效果。并且自组装的激光剥蚀冷冻样品台使用拼装方式组合，因此很容易对内部遭受损害的零件进行更换。并且在自组装的激光剥蚀冷冻样品台的载物托盘上涂抹了一层导热泥，这样可以使生物样品受冷更加均匀，由于导热泥对光的反射作用较强，因此可以使生物样品视野的聚焦达到与商用常温样品台一致的效果，从而实现生物样品的精准聚焦，避免了在检测中设置激光透光孔。本实用新型的用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置最大优势是价格低廉，以本实用新型为例，自组装的激光剥蚀冷冻样品台主体费用为1700元，总体价格为4700元，大大降低了成本。并且保证了降温速度快，4min内达到
‑
20℃，温度波动低，十小时内温度波动为
±
0.1℃，保证了生物样品检测的精确度，冷冻能力强劲。
16.本实用新型的一种用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置，包括激光剥蚀冷冻样品台、循环冷凝水箱和电源；
17.激光剥蚀冷冻样品台包括前板、顶板、底板、制冷单元、载物托板和导热泥；
18.在顶板上设置有顶板卡槽，和底板设置的底板卡槽相配合，并在其前端设置有前板，形成冷却散热腔；
19.制冷单元包括半导体制冷片和水冷板；半导体制冷片和水冷板相对设置，紧密连接；并且制冷单元中水冷板的一侧设置在底板上；
20.在顶板上还设置有载物托板通孔，载物托板通过载物托板通孔设置在半导体制冷片上方，在载物托板上方涂抹有导热泥，并在导热泥中间设置沟槽，用于放置有生物样品的载玻片；
21.半导体制冷片通过电线和电源连接；水冷板通过管道和循环冷凝水箱连通。
22.进一步的，制冷单元优选为多个串联。
23.进一步的，连通水冷板和循环冷凝水箱的管道优选为硅胶管。
24.进一步的，半导体制冷片和水冷板的紧密连接，是通过在两者之间采用导热硅胶连接，保证了正常接触。
25.进一步的，半导体制冷片和载物托板之间采用导热硅胶连接，用于制冷效果均匀传导。
26.所述的半导体制冷片优选为c系列半导体制冷片，更优选为xh
‑
c1206半导体制冷片。
27.进一步的，所述的底板尺寸根据制冷单元尺寸和剥蚀池尺寸确定。
28.进一步的，在底板上还设置有固定制冷单元卡槽和放置管线导槽。
29.进一步的，顶板和底板配合后，形成管线入口和管线出口。
30.作为优选，为了方便加工安装，所述的前板包括第一前板、第二前板和第三前板，前板优选为铝制板，用于对激光剥蚀冷冻样品台固定。
31.作为优选，载物托板为传热材料载物托板，优选为铜制板。传热材料的热传导率≥ 401k(w/m.k)。
32.作为优选，顶板为保温隔冷材料顶板，优选为聚四氟乙烯顶板，用于保温隔冷。
33.作为优选，底板为保温隔冷材料底板，优选为聚四氟乙烯底板，用于保温隔冷。
34.作为优选，循环冷凝水箱型号为lx
‑
300。
35.作为优选，电源为x271制冷半导体专用电源。
36.一种用于低温下生物样品剥蚀成像的检测系统，包括上述用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置、测温装置、激光剥蚀系统和电感耦合等离子体质谱仪；
37.测温装置，用于对用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置进行测温；
38.激光剥蚀系统，用于对载玻片上的生物样品进行剥蚀；
39.电感耦合等离子体质谱仪，用于对剥蚀样品进行质谱分析和数据处理。
40.一种用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置的使用方法，包括以下步骤：
41.步骤1：组装激光剥蚀冷冻样品台后，采用密封胶密封；开启循环冷凝水箱，将循环冷凝水箱温度调至5～10℃，并稳定；
42.所述的步骤1中，循环冷凝水温度稳定为在10min以上，温度波动
±
0.05℃以内。
43.步骤2：打开电源，半导体制冷片开始工作，制冷单元降低至零下50℃～零下20℃，对载物托板测温，待温度稳定；
44.所述的步骤2中，温度稳定的时间为15～20min。
45.步骤3：将负载有生物样品切片的载玻片置于载物托板上，并将激光剥蚀冷冻样品台置于剥蚀液中，密封；
46.所述的步骤3中，为了增加密封性，使用电子密封胶涂抹于狭缝处。
47.步骤4：向剥蚀液中通入氦气，冲刷清除杂气，得到除杂后的剥蚀液；
48.步骤5：调整在线检测模式，调整气流量为50ml/min，总气流为700ml；
49.步骤6：根据检测的生物样品设置激光剥蚀参数，尤其是对应的激光能量强度，并设置等离子体质谱检测参数；
50.步骤7：开始剥蚀成像，得到生物组织微区图像。
51.本实用新型的一种用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置及检测系统，与现有激光剥蚀冷冻样品台相比，本实用新型的优势在于：
52.1、造价低廉，本实用新型总体造价低，大大降低了成本。且操作方便，易于更换因跌落，老化等原因而损坏的零件。
53.2、安全性良好，由于使用了半导体制冷片，减少了冷冻气体的释放与使用，降低了使用成本，不需要后续的冷冻气体费用。
54.3、冷冻时间短，本实用新型可在4min内温度降到
‑
20℃，减少了检测人员的等待时间，大约在15min获得稳定的冷冻温度；本实用新型可以保持非常稳定的温度，1h
‑
10h的平均温度为(
‑
26.0
±
0.1)℃。
55.4、不需要透光孔，在载物托盘表面涂抹导热泥，通过导热泥对光的反射，可以获得很好的聚焦效果。
附图说明
56.图1为用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置中激光剥蚀冷冻样品台的装配结构示意图；
57.图2为图1中用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置中激光剥蚀冷冻样品台的爆炸视图；
58.图3为用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置的结构示意图；
59.图4为激光剥蚀冷冻样品台的降温曲线；(a)为激光剥蚀冷冻样品台降温曲线图；(b)为10 小时内，激光剥蚀冷冻样品台的温度曲线图。虚线为
‑
20℃的等温线；
60.图5为商用激光剥蚀常温样品台与本实用新型的视野聚焦效果对比；(a)为对比例使用透光孔的聚焦效果图；(b)为本实用新型实施例1使用导热泥的聚焦效果图；
61.以上图中，1为测温装置；2为电源；3为循环冷凝水箱；4为硅胶管，连接循环冷凝水箱与水冷板；5为电线，连接半导体制冷片与电源；6为第一前板；7为第二前板；8为第三前板；9为底板；10为水冷板；11为顶板；12为载玻片；13为导热泥；14为半导体制冷片； 15为载物托板；16为管线出口；17为管线入口。
具体实施方式
62.下面结合附图和实施例对本实用新型的具体实施方式做详细说明。
63.以下实施例中，用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置主要与上海凯莱仪器公司 (elemental scientific)的nwr image 266nm激光剥蚀进行匹配，适用于twovol2剥蚀池，其他型号的剥蚀池可以根据其尺寸对冷冻样品台进行修改，但是内部的制冷原理是一致的，这里主要介绍本实用新型的原理与效果。本实用新型可用于冷冻条件下生物样品的剥蚀成像。
64.以下实施例中，半导体制冷片为xh
‑
c1206半导体制冷片；
65.水冷板型号：纯铝宽水冷板；
66.导热泥为导热系数为6w/m.k的导热硅胶泥。
67.实施例1
68.一种用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置，其结构示意图见图3，包括激光剥蚀冷冻样品台、循环冷凝水箱3和电源2；
69.激光剥蚀冷冻样品台的结构示意图见图1，其爆炸示意图图2，包括三块不同尺寸的前板、顶板11、底板9、制冷单元、载物托板15和导热泥13；
70.制冷单元，包括xh
‑
c1206半导体制冷片14，和设置在半导体制冷片14下方的水冷板 10，水冷板10为纯铝材质，半导体制冷片14与水冷板10之间使用导热硅胶进行紧密连接，在半导体制冷片14的上方也使用导热硅胶进行涂抹。使用硅胶管4使循环冷凝水箱3和水冷板10相连，使整个水冷板10与冷凝水的温度一致。使用电线5将半导体制冷片14和电源2 连接，在通电之后，半导体制冷片14上端和水冷板10上端之间的温差可以达到60℃，从而达到制冷的效果，这是制冷的核心部位。即如果冷凝水的温度设定在10℃，而通过半导体制冷片14的制冷转换之后，半导体制冷片14的上端温度为
‑
50℃，可以满足实验要求。
71.本实施例采用两个制冷单元，串联连接，两个制冷单元包括两件半导体制冷片14，两件水冷板10。
72.制冷单元嵌入到底板9中，底板9上设置有底板卡槽，运载循环冷凝水的硅胶管4和连接半导体制冷片的电线5都在设计的底板卡槽内，可以得到很好的保护。底板9是兼顾了 twovol2剥蚀池与内部半导体制冷片14和水冷板10的尺寸之后进行设计的，可以很好地将半导体制冷片14和水冷板10放置于其中实现固定。
73.前板，包括三张，分别为第一前板6，第二前板7和第三前板8，这三块前板是铝制
板，主要是起到了对激光剥蚀冷冻样品台进行固定的作用。
74.顶板11，起到了对生物样品的支撑与制冷作用，顶板11是聚四氟乙烯材料制成的，起到了保温隔冷的作用；
75.载物托板15为铜制品，铜的热传导率为401k(w/m.k)，具有优良的传热能力。
76.顶板11设置有载物托板通孔，用于和载物托板15相配合，载物托板15上设置有导热泥 13，导热泥中心设置有放置载玻片12的凹槽。
77.制冷单元是使用导热硅胶粘附在一起水冷板和半导体制冷片，是整个冷冻样品台的核心部位，起到了制冷的效果。
78.底板，起到了对制冷单元的固定作用，底板的材质同样为聚四氟乙烯，由于聚四氟乙烯有着较好的保温效果，使得半导体制冷片的制冷效果更加稳定。
79.图1是激光剥蚀冷冻样品台的整体全貌，中间有两个孔，分别为管线入口16和管线出口 17，主要是为了通水路与电路。
80.在使用之前，使用密封胶将激光剥蚀冷冻样品台进行密封，使其与外界隔绝，保证剥蚀池的封闭。
81.以下是激光剥蚀冷冻样品台中各个部件的尺寸：
82.整个激光剥蚀冷冻样品台的总长度为194.5mm，总宽度为155.5mm。
83.顶板11的材质为聚四氟乙烯，顶板11的长度为181mm，宽度为155.5mm，高度为14mm，内部设计了12*9mm的内部管道与41mm宽的放置制冷单元的凹槽，顶板11的表面设计了四个不含螺纹的内六角圆柱头螺钉类gb m5的通孔，侧面设计了两个gb m5的螺纹孔。
84.载物托板15是紫铜材质的，总体的尺寸为155mm
×
41mm
×
2mm，有四个2mm的圆角。载物托板15的尺寸可以和顶板11严丝合缝结合在一起，保证了冷冻效果的提升。载物托板15上设计了两个gb m5六角头螺栓的柱形沉头孔。
85.底板9的长度为181mm，155.5mm，高度为14mm，内部的孔道尺寸和位置与顶板11 的一致，主要目的是为了制冷单元的完整放置以及硅胶管4和电线5的正常通路，底板9共有六个gb m5的螺纹孔，底板9的gb m5螺纹孔与顶板11的通孔以及载物托板15的沉头孔是相互对齐的，使用gb m5的内六角圆柱头螺钉将载物托板15和底板9与顶板11紧密相连，底板9的侧面有两个gb m4的螺纹孔。
86.第一前板6是整体为155.5mm
×
36mm
×
6.5mm的铝制板，其表面有左右对称的两个六角头螺栓通孔，有左右上下对称的四个直径为5.3mm的直径孔，用于螺钉的连接，中间为85mm
×
20mm的拉伸切除。
87.第二前板7是整体为120.5mm
×
32.5mm
×
3mm的铝制板，表面有左右上下对称的四个直径为5.3mm的直径孔，用于螺钉的连接，中间为85mm
×
20mm的拉伸切除。
88.第三前板8是整体为114mm
×
26.3mm
×
4mm的铝制板，其表面有左右上下对称的四个直径为5.3mm的直径孔，用于螺钉的连接，中间为85mm
×
20mm的拉伸切除。
89.采用上述用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置，配合激光剥蚀系统和电感耦合等离子体质谱仪，形成自组装用于低温下生物样品剥蚀成像的检测系统，对动物组织进行检测，包括如下步骤：
90.步骤一，组装激光剥蚀冷冻样品台后，采用密封胶密封，打开循环冷凝水箱，温度设置为10℃，待其温度稳定(10min以上，温度波动
±
0.05℃以内)之后，进行下一步的操作。
91.步骤二，连接电源，使冷冻样品台开始工作，在4min内温度降低至
‑
20℃，15min激光剥蚀冷冻样品台温度达到稳定，稳定时，温度为
‑
26.0℃(采用外接测温装置1进行测温)。
92.步骤三，立即将有动物组织切片的载玻片放置于激光剥蚀冷冻样品台的载物托板上，使其温度稳定；
93.动物组织切片的制备方法：以小鼠为例：小鼠用药之后，处死小鼠，对其器官进行冷冻切片处理，使用冷冻切片机对器官切割为10μm的薄片后，放置于载玻片上，立刻放置于冷冻样品台上进行剥蚀成像。
94.本实施例的激光剥蚀冷冻样品台的降温曲线见图4(a)，并观察了其10小时内，激光剥蚀冷冻样品台的温度曲线图见图4(b)，说明本实用新型的激光剥蚀冷冻样品台冷冻时间短，可在4min内温度降到
‑
20℃，减少了检测人员的等待时间，大约在15min获得稳定的冷冻温度；本实用新型可以保持非常稳定的温度，1h
‑
10h的平均温度为(
‑
26.0
±
0.1)℃。
95.步骤四，将激光剥蚀冷冻样品台放置于激光剥蚀池中，用螺栓拧紧，冲刷操作以保证剥蚀池内的杂气被冲刷干净；冲刷完成后，调整为在线模式，调整气流量为50ml/min，总气流为700ml；
96.步骤五，设置激光剥蚀参数，能量强度(fluence)：2.5j/cm2；重复频率(reprate)：50hz；光斑尺寸(spotsize)：50μm；扫描速度(scanspeed)：100μm/s；线扫面线数(thenumberoflines):100；
97.步骤六，设置等离子体质谱中相关元素的参数，扫描参数(sweep)调整为1，停留时间(dwelltime)调整为50ms，元素选择为所检测的元素，构建检测方法。
98.步骤七，剥蚀检测，获得冷冻条件下的动物组织剥蚀成像，根据成像分析各个元素在生物组织中的分布情况。
99.对该实施例的用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置，进行成本核算，价格在4700元。
100.实施例2
101.一种用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置，其结构示意图见图3，包括激光剥蚀冷冻样品台、循环冷凝水箱3和电源2；
102.激光剥蚀冷冻样品台，其结构示意图见图1，爆炸视图见图2，包括前板、顶板11、底板9、制冷单元、载物托板15和导热泥13；
103.在顶板11上设置有顶板卡槽，和底板9设置的底板卡槽相配合，并在其前端设置有前板，形成冷却腔；
104.在底板9上还设置有固定制冷单元卡槽和放置管线导槽，前板上设置有管线入口17和管线出口16；
105.制冷单元包括半导体制冷片14和水冷板10；半导体制冷片14和水冷板10相对设置，紧密连接；并且设置水冷板10的一侧设置在固定制冷单元卡槽上；
106.在顶板11上还设置有载物托板通孔，载物托板15通过载物托板通孔设置在半导体制冷片14上方，在载物托板15上方涂抹有导热泥13，并在导热泥中间设置沟槽，用于放置有生物样品的载玻片12；
107.半导体制冷片14通过电线5和电源2连接；水冷板10通过硅胶管4和循环冷凝水箱3连通。
108.采用上述用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置，配合激光剥蚀系统和电感耦合等离子体质谱仪，形成自组装用于低温下生物样品剥蚀成像的检测系统，对动物组织进行检测，包括如下步骤：
109.步骤一，组装激光剥蚀冷冻样品台后，采用密封胶密封，打开循环冷凝水箱，温度设置为10℃，待其温度稳定(10min以上，温度波动
±
0.05℃以内)之后，进行下一步的操作。
110.步骤二，连接电源，使冷冻样品台开始工作，在4min内温度可以降低至
‑
20℃，15min激光剥蚀冷冻样品台温度达到稳定，稳定时，温度为
‑
26.0℃(采用外接测温装置进行测温)。
111.步骤三，立即将有植物组织切片的载玻片放置于激光剥蚀冷冻样品台的载物托板上，使其温度稳定；
112.植物组织切片的制备方法：以黄瓜植株为例：选取健壮的黄瓜组织进行外源性元素的培养，几日后，对黄瓜组织进行切片处理，在冷冻切片机上获得植物组织切片后，立刻放置于载玻片上。
113.步骤四，将激光剥蚀冷冻样品台放置于激光剥蚀池中，用螺栓拧紧，冲刷操作以保证剥蚀池内的杂气被冲刷干净；冲刷完成后，调整在线模式，调整气流量为50ml/min，总气流为700ml；
114.步骤五，设置激光剥蚀参数，能量强度(fluence)：5j/cm2；重复频率(reprate)：50hz；光斑尺寸(spotsize)：50μm；扫描速度(scanspeed)：100μm/s；线扫描线数(thenumberoflines):100；
115.步骤六，设置等离子体质谱中相关元素的参数，扫描参数(sweep)调整为1，停留时间(dwelltime)调整为50ms，元素选择为所检测的元素，构建检测方法。
116.步骤七，剥蚀检测，获得冷冻条件下的植物组织剥蚀成像，根据成像分析各个元素在生物组织中的分布情况。
117.实施例3
118.一种用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置，同实施例2。
119.采用上述用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置，配合激光剥蚀池和等离子体质谱，形成自组装激光剥蚀冷冻样品台系统，对单细胞进行检测，包括如下步骤：
120.步骤一，组装激光剥蚀冷冻样品台后，采用密封胶密封，打开循环冷凝水箱，温度设置为10℃，待其温度稳定(10min以上，温度波动
±
0.05℃以内)之后，进行下一步的操作。
121.步骤二，连接电源，使冷冻样品台开始工作，在4min内温度可以降低至
‑
20℃，15min激光剥蚀冷冻样品台温度达到稳定，稳定时，温度为
‑
26.0℃(采用外接测温装置进行测温)。
122.步骤三，立即将有单细胞的阵列板放入到激光剥蚀冷冻样品台的载物托板上，使其温度稳定；
123.单细胞阵列的制备方法：使用磷酸缓冲溶液将细胞悬浮液稀释至106cells/ml，使用血球计数板对细胞悬浮液中的细胞进行计数进行验证。注入阵列板中，使一个细胞进入到一个坑道中，然后使用磷酸缓冲溶液轻轻冲洗阵列板上端，使多余细胞被冲洗掉。马上使用液氮冷冻，快速放置于冷冻样品台上；
124.步骤四，将激光剥蚀冷冻样品台放置于激光剥蚀池中，用螺栓拧紧，冲刷操作以保
证剥蚀池内的杂气被冲刷干净；冲刷完成后，调整为在线模式，调整气流量为50ml/min，总气流为700ml；
125.步骤五，设置激光剥蚀参数，能量强度(fluence)：5j/cm2；重复频率(rep rate)：50hz；光斑尺寸(spot size)：50μm；线扫描线数(the number of circles):500；
126.步骤六，设置等离子体质谱中相关元素的参数，扫描参数(sweep)调整为1，停留时间(dwelltime)调整为50ms，元素选择为所检测的元素，构建检测方法。
127.步骤七，剥蚀检测，获得冷冻条件下的单细胞剥蚀检测，根据成像分析各个元素在生物组织中的分布情况。
128.对比例
129.一种用于低温下生物样品剥蚀成像的冷冻装置，同实施例1，不同之处在于：
130.在激光剥蚀常温样品台中央设置有透光孔，光直接从下方照射到生物样品上，可以使视野更加清晰明亮，从而实现生物样品的精准聚焦，如图5(a)。本实用新型实施例1中未设置透光孔，聚焦的功能是依靠导热泥来实现的，通过导热泥对光的强反射能力，使剥蚀池内视野更加明亮，从而获得了精准的聚焦效果，同时使用导热泥也可以获得更加均匀的制冷效果，其视野聚焦效果图见图5(b)。