用于电化学方法检测肌酐的电极、试纸及生物传感器

1.本实用新型涉及一种对临床样本进行分析测试用的电极，具体涉及一种用于电化学检测肌酐的电极及基于该电极的试纸。


背景技术：

2.目前，全世界患有肾脏疾病的人，特别是慢性肾脏疾病(ckd)的人，日益增多。2017 年，全球疾病、创伤及危险因素负担(gbd)研究估计全球ckd流行率为9.1％。1990年至 2017年间，全球各年龄段的ckd死亡率增加了41.5％。伴随着高发病率和高死亡率，ckd 给全球经济带来了巨大的负担。因此，定期监测肾功能，避免肾功能损伤发展到不可逆的程度是非常必要的。
3.肌酐是临床工作中最常用的肾功能监测指标。肌酐(2-氨基-1-甲基-5h-咪唑-4-酮)是肌肉和蛋白质代谢产生的磷酸肌酸的化学废代谢物。在人体中，内源性肌酐是由肌肉组织产生的，外源性肌酐主要来自饮食中肉类的代谢。在正常情况下，我们日常生活中的肌酐产生量是相对稳定的，几乎所有的肌酐都是通过肾脏过滤并释放到尿液中的。因此，血清肌酐(scr)水平会保持在稳定的范围内，约为44-106μmol/l。当肾脏功能发生障碍、肌酐排泄能力受损时，肌酐浓度将超过生理范围的上限。在早期阶段，肾病患者不会感到不适，但是scr水平的异常会引起医生的注意。因此，scr水平通常被认为是检测肾功能不全的一个重要的生物标志物。
4.现有技术中，已有一系列定量测定肌酐的方法。传统的方法主要有jaffe反应法和酶法。 jaffe反应快速、经济，但容易受到血清中酮、葡萄糖等干扰性色原的影响，使其有时不准确。因此酶法被认为是更优的方法。使用生物酶的确可以大大提高检测的准确性和效率。尽管酶法比jaffe反应对患者的经济负担更重，但更高的特异性让使用酶法检测肌酐逐渐成为医院临床检测的主流手段。然而，对于不方便到医院但又需要定期检查肾功能的患者来说，现有的这两种肌酐检测方法都是不容易实现的。
5.说到健康状况的日常监测，基于poct的血糖仪无疑给人留下了最深刻的印象。遗憾的是，没有像血糖仪这样的智能设备在世界范围内被广泛接受。生物传感器是一种将生物材料的浓度转化为电信号的电化学检测技术。与传统的测量方法相比，生物传感器具有测量时间短、操作简单、灵敏度高、选择性好等优点。因此，使用生物传感器通过电化学法检测肌酐被认为是一种有前途的肌酐检测替代方法。
6.现有技术中对于电化学法检测肌酐的方法及其所用材料已有一些公开。例如美国雅培护理点公司的i-sata光学和电学检测设备包含了执行电化学检测肌酐的组件，但该设备和组件机构复杂，造价昂贵，不适合普通患者使用，不能满足居家随检的快速、便捷的需求。另外，还有一些现有产品存在抗干扰能力差，检测结果准确度和灵敏度都不高的缺点。
7.由于机体血液成分复杂，肌酐的电化学检测结果很容易受到血液中其他非目标物质的干扰。为了降低这种干扰带来的检测误差，现有技术中有很多测试材料设置了血液过滤装置，目的在于在发生电化学反应前滤去血液中容易产生干扰的非目标物质。但是实践
中发现，现有技术中设置的血液过滤装置不仅使传感器造价高、工艺复杂，而且仍无法有效地避免血液中肌酸对肌酐检测带来的干扰。
8.因此，有必要提供一种结构简单、造价低，同时能够精准定量检测血液肌酐的电化学电极及试纸，使肾病关键指标也能够实现居家自我监测。


技术实现要素：

9.鉴于上述背景，本实用新型的首要目的在于：提供一种电化学法检测肌酐的电极，具有灵敏度高、抗干扰性强、性能稳定、结构简单、体积小、造价低等综合优势。
10.本实用新型的另一个目的在于：提供一种包含本实用新型所述电极的可用电化学法检测肌酐的试纸，可以用于临床或居家的快速、便捷检测。
11.本实用新型的上述目的通过以下技术方案实现：
12.第一个方面，本实用新型提供一种用于电化学法检测肌酐的电极，包括电极材料基础层；所述的电极材料基础层外表面覆有电子介体增强层；所述的电子介体增强层外表面固定有酶反应层，所述的酶反应层含有可与肌酐反应生成过氧化氢的酶组合物。
13.本实用新型所述的电极方案中，所述的电极材料基础层的材料可以是现有的各种可用于氧化还原电极的材料组合物，包括各种含惰性金属材料的组合物(例如铂电极材料、金电极材料或汞电极材料)或者含碳电极材料的组合物，等等。所述的材料组合物中可以含有或不含电子介体成分。
14.本实用新型优选的方案中，所述的电极材料基础层是以碳电极材料为主的组合物，所述的碳电极材料可以选自石墨、碳糊或玻碳中的任意一种；最优选碳糊或石墨。
15.本实用新型进一步优选的方案中，所述的以碳电极材料为主的组合物还含有电子介体，所述的电子介体可以选自普鲁士蓝、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物或铁氰化钾等；最优选普鲁士蓝。
16.第二个方面，本实用新型提供一种可利用电化学法检测肌酐的试纸，所述的试纸包括绝缘底板，所述的绝缘底板表面设有电极组和电路；所述的电极组至少由工作电极、对电极和参比电极组成，所述的工作电极为本实用新型第一个方面所述的用于电化学法检测肌酐的电极；所述的电路包括所述工作电极与对电极之间、以及所述工作电极与参比电极之间形成的回路。
17.本实用新型所述的试纸作为电化学生物传感器的工作原理是：检测时按照常规方法加样后，样本中的肌酐会与固定在工作电极上的酶组合物发生系列反应，肌酐经肌酐酶分解为肌酸，肌酸在肌酸酶和肌氨酸氧化酶作用下生成过氧化氢，过氧化氢被电子介体增强层的电子介体催化还原，电子被传递到所述工作电极的电极材料基础层上，产生还原电流，根据电流响应值与样本中肌酸的浓度关系，可以得知样本的肌酸含量。用本实用新型所述试纸检测肌酐时，检测样本可以是全血、血浆、血清、尿液等等各种形式。
18.本实用新型所述的试纸中，对于所述的绝缘底板的具体材料、规格及形状没有特别的限制。所述的绝缘底板材料优选绝缘纸、塑料、橡胶等具有疏水表面的材料；所述的塑料进一步优选pet、pvc、pe或pp中的任意一种。所述的绝缘底板的规格可以根据需要制造成不同厚度和大小。所述的绝缘底板的形状可以是实际测量时应用场景可接受的任意形状。
19.本实用新型所述的试纸中，所述的电极组中的各电极，具体形状和规格没有特别
的限制，在可以实现有效的电化学法检测的前提下，各电极可以制作成各种可以接受的形状，例如电极横截面可以呈长方形、圆形或其他任意形状。
20.本实用新型所述的试纸中，所述的对电极的材料优选与所述工作电极的电极材料基础层相同；所述的参比电极可以由现有的多种适合作为参比电极的材料制得，优选的参比电极是银-氯化银电极。
21.在本实用新型的一种实施方式中，所述的电极组可以仅由一个工作电极、一个对电极和一个参比电极构成，所述的一个工作电极是本实用新型所述的用于电化学法检测肌酐的电极。该试纸可以作为单独检测一份样本中肌酐含量的电化学传感器，用于简易、便携的肌酐检测设备中，适合于肾病患者的居家自我监测。
22.第三个方面，本实用新型提供一种用于电化学检测肌酐的生物传感器，包括绝缘底板，所述的绝缘底板表面固定连接有电极组、导线和加样腔；所述的加样腔由四周的绝缘材料墙和中间的镂空区构成；所述的电极组主体处于所述镂空区范围内，所述的电极组至少由工作电极、对电极和参比电极组成，所述的工作电极为本实用新型第一个方面所述的用于电化学法检测肌酐的电极；所述的导线包括分别与所述工作电极、对电极和参比电极连接的金属导线，用于将所述的各电极与外设的电位检测设备电连接。
23.使用本实用新型所述的生物传感器检测血液肌酐水平时，将生物传感器的导线与外设的电位检测设备连通，将采集的血样以合适剂量滴加至所述加样腔的镂空区，其四周的绝缘材料墙可以将样品液滴限制在镂空区内与电极充分接触。样本中的肌酐与工作电极上的复合酶反应生成过氧化氢，过氧化氢被所述工作电极上的电子介体增强层的电子介体催化还原，由此将复合酶活性中心的电子转移至电极材料基础层，在工作电极上产生还原电流，电位检测设备通过参比电极测量电位，电流响应值大小在一定范围内与血液肌酐水平相关，从而根据电流检测结果推算得到相应肌酐水平。
24.本实用新型所述的生物传感器中，对于所述的绝缘底板的具体材料、规格及形状没有特别的限制。所述的绝缘底板材料优选绝缘纸、塑料、橡胶等具有疏水表面的材料；所述的塑料进一步优选pet、pvc、pe或pp中的任意一种。所述的绝缘底板的规格可以根据需要制造成不同厚度和大小。所述的绝缘底板的形状可以是实际测量时应用场景可接受的任意形状。
25.本实用新型所述的生物传感器中，所述的电极组中的各电极，具体形状和规格没有特别的限制，在可以实现有效的电化学法检测的前提下，各电极可以制作成各种可以接受的形状，例如电极横截面可以呈长方形、圆形或其他任意形状。所述的对电极的材料优选与所述工作电极的电极材料基础层相同；所述的参比电极可以由现有的多种适合作为参比电极的材料制得，优选的参比电极是银-氯化银电极。
26.本实用新型所述的生物传感器中，所述的导线可以是各种金属导电材料，优选铜导线。
27.本实用新型所述的生物传感器中，所述的加样腔的绝缘材料墙可以选择由多种现有的绝缘材料，优选热熔胶。本实用新型所述的电极及试纸的制备方法如下：
28.制备本实用新型第一个方面所述的电极的方法，包括：
29.1)以含有电子介体的碳浆料形成电极材料基础层并干燥；
30.2)在1)所得的电极材料基础层上表面设置一层电子介体增强层并干燥；例如可以
通过电沉积的方法将电子介体修饰在所述电极材料基础层表面，形成所述的电子介体增强层
31.3)在2)所得的电子介体增强层表面固定酶组合物；例如可以通过戊二醛交联的方式完成；所述的酶组合物是肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶的组合物；得到酶修饰的电极，即所述的用于电化学法检测肌酐的电极。
32.本实用新型优选的制备所述电极的方法中，1)所述的以含有电子介体的碳浆料形成电极材料基础层，是将所述的碳浆料基于预先设计的网版通过丝网印刷打印在可接受的表面形成所述电极材料基础层。
33.制备本实用新型第二个方面所述的可利用电化学法检测肌酐的试纸的方法，包括：
34.以含有电子介体的碳浆料(例如可以是掺杂普鲁士蓝的碳糊)作为工作电极和对电极材料、以银-氯化银浆料为参比电极材料，在绝缘且疏水的底板表面制备工作电极、对电极、参比电极和匹配的电路(例如可以通过丝网印刷方式打印完成)；在制得的所述工作电极表面施加电子介体增强层(例如可以在制得的所述工作电极表面通过电沉积法修饰普鲁士蓝)；然后将肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶组成的酶组合物固定在所述的电子介体增强层表面(例如可以在所述电子介体增强层表面滴加所述酶组合物与戊二醛的混合液，并在0-4℃晾干)；得到可利用电化学法检测肌酐的试纸。
35.实际应用中，使用本实用新型所述的生物传感器进行肌酐的电化学法检测，具体方法如下：
36.使用本实用新型所述的电化学检测肌酐的生物传感器，将所述生物传感器的导线与外设的电位检测设备连通；在所述生物传感器的加样腔内滴加ph值在7.4的缓冲液，然后在缓冲液中滴加待测血浆或全血样本，电位检测设备在-0.1v的工作电压下进行检测，得到响应电流的强度，最终根据肌酐浓度与电流信号的关系曲线推算得到样本中的肌酐浓度。
37.与现有技术相比，本实用新型的电极通过优化内部组成结构，在检测肌酐的三酶组合物与电极电极材料基础之间增设了电子介体增强层，从而显著增强了电子传递效率，使检测时的工作电位降低至-0.1v，从而有效排除了肌酐检测中由肌酸等非目标物带来的干扰，显著提高了本实用新型电极及试纸的抗干扰能力。同时，本实用新型的电极还具有较高的灵敏度和重复测量稳定性。此外，本实用新型的试纸可以用于多种便携、快捷的小型电化学检测设备中，所以，利用本实用新型的试纸能够实现快速、便利的血、尿肌酐的临床检测或居家监测。
附图说明
38.图1是实施例1所述的工作电极结构示意图。
39.图2是实施例2所述的电化学检测肌酐的试纸的结构示意图。
40.图3是实施例3所述的生物传感器结构示意图。
41.图4显示了不同电极材料制备的传感器的灵敏度研究结果。
42.图5显示了实施例3生物传感器检测肌酐溶液的传感器的测量重复性。
43.图6显示了采用实施例3生物传感器检测血浆肌酐浓度与采用传统的jaffe法检测血浆肌酐浓度的检测结果之间的相关性。
具体实施方式
44.以下将以列举实施例的方式详细说明本实用新型的技术方案，但本实用新型的范围不限于所列举的实施例。
45.实施例1
46.一种可用于电化学法检测肌酐的酶电极结构，其结构如图1所示，包括电极材料基础层 1；所述的电极材料基础层1外表面覆有电子介体增强层2；所述的电子介体增强层2外表面固定有酶反应层3，所述的酶反应层3含有可与肌酐反应生成过氧化氢的酶组合物。所述的电极材料基础层1由掺杂普鲁士蓝的碳糊构成；所述的电子介体增强层2是通过电化学沉积修饰在电极材料基础层1上的普鲁士蓝层；所述的酶反应层3中的酶组合物优选由肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶组成。
47.制备所述酶电极的方法如下：
48.1)在pet底板上用掺杂普鲁士蓝的碳糊浆料涂刷形成0.2mm厚度的条形并干燥，得到电极材料基础层1；
49.2)采用电沉积方法在1)得到的电极材料基础层表面持续扫描普鲁士蓝；经干燥得到电极材料基础层表面修饰有普鲁士蓝的电极，修饰在电极材料基础层表面的普鲁士蓝作为电子介体增强层2；
50.3)在2)所得的电子介体增强层2表面通过戊二醛交联方式固定酶组合物，在电子介体增强层2表面形成酶反应层3。
51.实施例2
52.一种可通过电化学法检测肌酐的试纸，其结构如图2所示，包括长方形的pet底板10，所述的pet底板10表面设有电极组和电路；所述的电极组由平行排列的一个长条形工作电极20、一个长条形对电极30和一个长条形参比电极40构成，所述的工作电极20的结构与实施例1所述的电极相同；所述的对电极30的材料由掺杂普鲁士蓝的碳糊构成；所述的参比电极40是银-氯化银电极；所述的电路为连接各电极与外设检测设备的金属导体50。
53.实施例3
54.一种可通过电化学法检测样本肌酐水平的生物传感器，结构如图3所示，包括25mm
ꢀ×
30mm规格的长方形pet绝缘底板10，所述的绝缘底板10表面固定连接有电极组、导线和加样腔；所述的加样腔60由四周的热熔胶墙和中间的镂空区构成；所述的电极组主体处于所述镂空区范围内，所述的电极组由工作电极20、对电极30和参比电极40组成，所述的工作电极20为实施例1所述的电极；每个电极的长度、宽度和厚度分别为20mm、2mm和0.2mm。所述的导线包括分别与所述工作电极20、对电极30和参比电极40连接的铜导线50，用于将所述的每个电极与外设的电位检测设备电连接。所述铜导线50与各电极连接的接头处设有强化连接的固定组件70。
55.本实施例的生物传感器可以通过以下方式制备得到：
56.(1)选择25mm
×
30mm规格的长方形pet材料作为绝缘底板10，并在绝缘底板10上预设好工作电极20、对电极30和参比电极40各自的位置；
57.(2)在(1)所述的绝缘底板10上按照预设位置制作电极，即，用掺杂普鲁士蓝的碳糊涂刷制得工作电极20和对电极30，同时用ag/agcl油墨涂刷得到参比电极40。每个电极的长度、宽度和厚度分别为20mm、2mm和0.2mm，如图3所示，中间为工作电极20，左侧为对电极
30，右侧为参比电极40；涂有电极的绝缘底板置于干燥炉内75℃下干燥30分钟，室温冷却；
58.(3)在(2)得到的冷却后的绝缘底板上，使用银浆在三个电极同一侧的端头上分别连接铜导线50；然后用胶封住所述连接部位形成固定组件70，以保证连接的稳固性。再围绕三个电极另一侧未连接铜导线50的端头用热熔胶围筑起绝原材料墙，形成周围凸起中间有2mm
ꢀ×
8mm镂空区的加样腔60。
59.(4)在(3)得到的加样腔60内的工作电极20表面通过电沉积法修饰一层普鲁士蓝层作为电子介体增强层；
60.(5)在(4)得到的电子介体增强层表面通过戊二醛交联方式固定酶复合物，得到所述的生物传感器。
61.用于检测前，将本实施例所制备的生物传感器从冰箱取出后，在缓冲液中于室温下孵化 1小时。使用本实用新型所述的生物传感器检测血液肌酐水平时，将生物传感器的铜导线50 与外设的电位检测设备连通，将缓冲液和采集的血样先后以合适剂量滴加至所述加样腔60的镂空区，其四周的绝缘材料墙可以将液滴限制在镂空区内与电极充分接触。样本中的肌酐与工作电极20上的酶复合物反应生成过氧化氢，过氧化氢被所述工作电极20上的电子介体增强层的电子介体催化还原，由此将复合酶活性中心的电子转移至电极材料基础层，在工作电极20上产生还原电流，电位检测设备通过参比电极40测量电位，电流响应值大小在一定范围内与血液肌酐水平相关，从而根据电流检测结果推算得到相应肌酐水平。
62.对比例1
63.一种可用于电化学法检测肌酐的生物传感器，其方法大体上与实施例3相同，区别在于：所述的工作电极上未修饰普鲁士蓝层。
64.实验例1
65.本实验研究了实施例3和对比例1的生物传感器的灵敏度。研究结果如图4所示，对比例1的生物传感器检测灵敏度约为1.4μa/mm；实施例3的传感器与对比例1，用普鲁士蓝电沉积层修饰pb碳糊电极后，传感器的灵敏度明显提高到2.2μa/mm左右。该结果表明，本实用新型的电子介体增强层可以使传感器在-0.1v电位下表现出良好的检测性能。
66.实验例2
67.为了研究实施例3的生物传感器的测量稳定性，对同一肌酐溶液连续测量74次。首先将200μl缓冲溶液滴在电极表面，浸没电极组，当缓冲液的电流基线趋于平稳后，在缓冲液中加入41mm肌酐溶液5μl，由此使肌酐的最终浓度为1mm。然后记录1mm肌酐溶液引起的电流反应。以第1次测量的电流响应为100％，后续73次测量的电流响应基于第1次的响应量化，以百分比计。
68.74次检测结果如图5所示，横坐标是测量次数，纵坐标是归一化的响应比例。可以观察到，以第1次检测的电流响应为标准，随后73次检测的电流响应趋于稳定，电流响应在上下 20％的范围内(80-120％)变化。值得注意的是，经过74次测量后，传感器仍然保持了优良的性能，而且与初始信号相比，电流响应并没有减小，而是增加了，这可能是由于酶活性的增加。结果表明，该传感器在连续测量肌酐时具有良好的测量稳定性。
69.实验例3
70.采用本实用新型实施例3的生物传感器检测7组血浆样本中的肌酐水平，每组血浆
样本同时采用传统的jaffe法检测作为对照，两种检测结果及其误差率见下表1：
71.表1
[0072][0073]
如图6所示，本实用新型实施例3的生物传感器检测结果与传统的jaffe法的检测结果之间同样存在高度相关性。证明本实用新型的生物传感器对血浆肌酐水平的检测具有良好的准确性。