用于急诊科诊断感染和脓毒症的早期生物标志物的最佳组合的制作方法

背景技术：

1、最近更新的脓毒症(sepsis)定义强化了脓毒症是一种危及生命的器官功能障碍，由宿主对感染的反应失调引起[1]。由于患者就诊时的临床体征通常是非特异性的，因此已经对脓毒症生物标志物进行了深入研究，目的是改善脓毒症的鉴定并促进早期集束化治疗的实施[2]。在这个非常活跃的研究领域，大多数研究都是在重症监护环境中进行的。然而，大多数脓毒症患者通过急诊科(ed)就诊[3]。因此，ed在早期鉴定脓毒症和感染方面具有关键作用，感染是怀疑脓毒症的先决条件。在许多ed临床情况下观察到炎性谱(profile)，挑战在于在其中鉴定那些真正患有感染的患者。

2、由于病理生理学途径复杂且多模式，目前还没有具有足够的鉴别力以允许正确诊断感染和/或脓毒症的个体生物标志物[4]。“biomarqueurs d’identification précocedu sepsis aux urgences”(bips)研究的目的是在急诊科疑似患有感染或脓毒症的患者中测量一组生物标志物(覆盖数种不同的病理生理途径)，并鉴定可以为诊断细菌感染、病毒感染和脓毒症提供高特异性和敏感性的最佳组合。bips研究的独创性在于，与重症监护室相比，在ed接受疑似脓毒症检查的患者在其病史早期受观察，并且可以在任何潜在地干扰数种感兴趣的生物标志物的治疗干预(如液体复苏、抗生素、血管加压剂)之前提供血液样品。

3、尽管已报道了允许诊断感染或脓毒症的大量生物标志物，但没有一种具有足够的特异性或敏感性以在临床实践中常规使用[4]。当作者一致得出结论认为没有奇效(magic)标志物时，则希望生物标志物的组合可能会更合适[2]。例如，已显示crp(c反应蛋白)和中性粒细胞cd64(分化簇64)的联合[31]或pct(降钙素原)、可溶性trem-1和中性粒细胞cd64的联合[32]具有前景。然而，一项包括29种血浆生物标志物、14种细胞表面生物标志物和10种mrna的大型多中心研究未能发现任何可用于在icu(重症监护室)患者中诊断脓毒症-2的组合[33]。此外，一项分析大量细胞表面生物标志物的研究得出结论，对于在疑似急性感染患者中诊断脓毒症，没有组合具有临床相关的预测有效性[35]。实际上，大多数为了诊断脓毒症而进行的研究是在重症监护室中、在高度炎性的患者中进行的。对于这些患者，感染的发生可能被隐蔽(blind)在炎性生物标志物的风暴和高度改变的细胞表面标志物表达之内。在这种情况下，“脓毒症-3”的新定义对ed收治患者的意义有限，因为它与易于诊断的器官衰竭有关。事实上，感染的存在仍然是需要为这些患者解决的最重要挑战。

技术实现思路

1、很少有研究报告允许辨认细菌感染和病毒感染的组合。oved和同事[41]报告了测量三种血浆标志物(crp、trail(tnf相关细胞凋亡诱导配体)和cxcl10)的意义。虽然基因表达的组合为诊断细菌感染带来了许多积极的研究[46，45]，但只有一项研究表明一组7个基因可以允许稳健地区分细菌感染和病毒感染[44]。

2、已对308名患者进行了单中心前瞻性研究。包括了在血浆中测量的16种不同的生物标志物，以及在单核细胞、中性粒细胞、b淋巴细胞和t淋巴细胞上测量的11种生物标志物。此外，还研究了一种细菌生物标志物(与白细胞相关的内毒素)。对291名患者进行了最终分析，其中148名患有细菌感染，47名患有病毒感染。在细菌感染患者中，70名患有根据2002年定义的脓毒症(以下为“脓毒症-2”)，16名患有根据2016年定义的脓毒症(以下为“脓毒症-3”)。

3、测量了急诊科收治患者时的不同生物标志物，鉴定出血浆和细胞表面生物标志物的四种不同组合与细菌感染和病毒感染以及脓毒症-2和脓毒症-3的良好诊断价值密切相关。有趣地，仅有限量的标志物即足以最终做出具有高敏感性和高特异性的诊断。

4、本发明人已经鉴定了三种标志物的第一组合，其允许以高精度诊断细菌感染。该组合包括测量单核细胞表达的hla-dr(人白细胞抗原dr)水平，中性粒细胞表达的mertk(骨髓-上皮-生殖酪氨酸激酶)水平，以及作为第三生物标志物的血浆金属蛋白酶-8(mmp8)水平。有趣地，该组合允许曲线下面积(auc)为0.934。更准确地，hla-dr(在cd14+单核细胞上的百分比)和mertk(在cd66+中性粒细胞上的百分比)的联合最终得到auc为0.921[0.89-0.95]。添加第三生物标志物(mmp8)进一步提高了auc＝0.934[0.91-0.96]，敏感性为0.865，特异性为0.902。

5、在已被鉴定为未受细菌感染影响的患者中，发明人进一步鉴定了允许诊断患有病毒感染的人的其他三种标志物的组合。该第二组合包括测量中性粒细胞上cd64和cd24表达的水平以及单核细胞上cx3cr1表达的水平。有趣地，该第二组合最终得到auc＝0.97。更准确地，cd64和cx3cr1的联合最终得到auc为0.955[0.92-0.99]。添加中性粒细胞上的第三生物标志物(cd24的平均荧光强度(mfi))最终得到auc为0.97[0.95-0.99]。这三种生物标志物的敏感性为0.936，其特异性为0.875。

6、由于本研究是在脓毒症-3定义可用之前设计的，因此进行了第一分析以鉴定定义脓毒症-2患者的最佳组合。70名患者进入脓毒症-2定义。通过测量单核细胞上的hla-dr表达以及血浆降钙素原(pct)和il-6生物标志物(auc＝0.891)，获得了鉴定患有脓毒症-2的患者的最佳组合。

7、关于分类为脓毒症-3的患者(n＝16)，发明人在本文中表明，通过测量单核细胞上的hla-dr表达和血浆透明质酸(ha)和肌酐(auc＝0.97)可以获得最佳组合。因此，最佳组合是hla-dr与透明质酸和肌酐。

8、该研究是允许在ed诊断细菌感染和病毒感染的非常罕见的研究之一。由于新技术正在迅速发展，如通过微流控技术测量细胞表面生物标志物的表达[50，51]，以及用于实时电化学检测生物标志物的针状微电极[50]，因此细胞表面生物标志物和血浆生物标志物的组合应当不是实现床边诊断的问题。

9、用于血液分析的方法

10、在第一方面，本发明涵盖用于血液分析的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在向患者施用任何液体复苏、抗生素或血管加压剂之前提供来自患者的血液样品。在本发明的上下文内，“在向患者施用任何液体复苏、抗生素或血管加压剂之前”是指患者在提供血液样品之前一个月内未接受任何液体复苏、抗生素或血管加压剂。

11、在一些实施方案中，所述方法包括从血液样品中分离细胞。优选地，所述方法包括如下所述从血液样品中分离单核细胞和/或分离中性粒细胞。在一些实施方案中，所述方法包括用常规装置(如离心)从血液样品中分离血浆。

12、血液和血浆样品将保持在+4℃或-80℃，直至细胞表面标志物评估或生物标志物测量。抽血和流式细胞术分析、血浆采集和冷冻之间的延迟优选为2至8小时。

13、在一些实施方案中，所述方法包括测量单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平。可以通过本领域的常规技术来测量单核细胞上的hla-dr表达，例如，详见下面的定义。

14、在一些实施方案中，所述方法包括测量中性粒细胞上mertk(骨髓-上皮-生殖酪氨酸激酶)表达的水平。可以通过本领域的常规技术来测量中性粒细胞上的mertk水平，例如，详见下面的定义。

15、在一些实施方案中，所述方法包括测量血浆中金属蛋白酶-8(mmp8)的水平。可以通过本领域的常规技术来测量血浆中金属蛋白酶-8(mmp8)的水平，例如，详见下面的定义。

16、在优选的实施方案中，所述方法包括测量单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平，测量中性粒细胞上mertk(骨髓-上皮-生殖酪氨酸激酶)的水平，以及测量血浆中金属蛋白酶-8(mmp8)的水平。

17、在一些实施方案中，所述方法包括测量中性粒细胞上cd64表达的水平。可以通过本领域的常规技术来测量中性粒细胞上cd64的水平，例如，详见下面的定义。

18、在一些实施方案中，所述方法包括测量中性粒细胞上cd24表达的水平。可以通过本领域的常规技术来测量中性粒细胞上cd24的水平，例如，详见下面的定义。

19、在一些实施方案中，所述方法包括测量单核细胞上cx3cr1的表达水平。可以通过本领域的常规技术来测量单核细胞上cx3cr1的水平，例如，详见下面的定义。

20、在优选的实施方案中，所述方法包括测量中性粒细胞上cd64表达的水平，测量中性粒细胞上cd24的水平，以及测量单核细胞上cx3cr1的水平。

21、在一些实施方案中，所述方法包括测量血浆中降钙素原(pct)的水平。可以通过本领域的常规技术来测量血浆中降钙素原的水平，例如，详见下面的定义。

22、在一些实施方案中，所述方法包括测量血浆中il-6的水平。可以通过本领域的常规技术来测量血浆中il-6的水平，例如，详见下面的定义。

23、在优选的实施方案中，所述方法包括测量单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平，测量血浆中降钙素原的水平，以及测量血浆中il-6的水平。

24、在一些实施方案中，所述方法包括测量血浆中透明质酸的水平。可以通过本领域的常规技术来测量血浆中透明质酸的水平，例如，详见下面的定义。

25、在一些实施方案中，所述方法包括测量血浆中肌酐的水平。可以通过本领域的常规技术来测量血浆中肌酐的水平，例如，详见下面的定义。

26、在优选的实施方案中，所述方法包括测量单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平，测量血浆中透明质酸的水平，以及测量血浆中肌酐的水平。

27、在其他优选的实施方案中，所述方法进一步包括如bourgoin等人，2020([48])中提出的那样测量单核细胞上cd169表达的水平，以区分细菌感染和病毒感染。

28、在一些实施方案中，患者患有细菌感染。除了本发明的生物标志物特征之外，可以通过本领域的常规技术来测量细菌感染，例如，通过使用选择性培养来检测特定的细菌生长特性，用elisa来检测特定的细菌抗原，或者用dna检测技术(如pcr)来检测特定的细菌dna。在一些实施方案中，患者不患有细菌感染。

29、在一些实施方案中，患者患有病毒感染。除了本发明的生物标志物特征之外，可以通过本领域的常规技术来测量病毒感染，例如，通过使用elisa来检测特定的病毒抗原，或者用dna/rna检测技术(如pcr)来检测特定的病毒核酸。在一些实施方案中，患者不患有病毒感染。

30、在一些实施方案中，患者患有脓毒症-2。在一些实施方案中，患者患有脓毒症-3。这些分类是熟练技术人员众所周知的([49])。在一些实施方案中，患者不患有脓毒症。

31、在特别优选的实施方案中，如以下定义中所公开的，用包含针对细胞表面标志物的抗体的微流控生物芯片或其他技术装置来测量一个或多个细胞表面标志物。

32、在优选的实施方案中，待检测的生物标志物的组合是：

33、细菌感染：

34、hla-dr+mertk的组合

35、hla-dr+mertk+il-6的组合

36、hla-dr+mertk+白细胞(wbc)的组合

37、hla-dr+mmp8的组合

38、hla-dr+白细胞(wbc)的组合

39、mmp8+mertk的组合

40、最佳组合是hla-dr+mertk+mmp8

41、病毒感染：

42、cd64+cx3cr1的组合

43、cd64+ip10的组合

44、cd64+cd24的组合

45、cx3cr1+cd24的组合

46、最佳组合是cd64+cd24+cx3cr1

47、脓毒症-2：

48、hla-dr+scd14的组合

49、il-6+pct+crp(c反应蛋白)的组合

50、hla-dr+il-6的组合

51、hla-dr+crp(c反应蛋白)的组合

52、hla-dr+pct的组合

53、hla-dr+mmp8的组合

54、hla-dr+mertk的组合

55、pct+il-6的组合

56、最佳组合是hla-dr+pct+il-6

57、脓毒症-3：

58、透明质酸+肌酐的组合

59、透明质酸+hla-dr的组合

60、肌酐+hla-dr的组合

61、最佳组合是hla-dr+透明质酸+肌酐

62、在本发明的方法中，优选使用众所周知的分析技术(如流式细胞术)来评估(测量、或鉴定、或检测)(任何细胞(包括血液和/或血浆细胞，如单核细胞、中性粒细胞)上的)细胞表面受体和/或细胞表面抗原的表达。特别是可以使用快速流式细胞术方案，如[39]和[47]中公开的那些方案，其通过引用并入本文。另一方面，可以使用众所周知的分析技术(如elisa或荧光免疫测定)来评估(测量、或鉴定、或检测)血浆生物标志物的量。

63、生物标志物用于诊断的方法和用途

64、在另一方面，本发明涵盖生物标志物用于诊断的方法和用途。特别是，本发明涵盖以上定义的生物标志物用于诊断到医院(更具体地为其急诊科)就诊的患者的细菌感染、病毒感染、脓毒症-2或脓毒症-3的用途。

65、在优选的实施方案中，所述方法或用途包括测量单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平降低，测量中性粒细胞上mertk(骨髓-上皮-生殖酪氨酸激酶)表达的水平升高，以及测量血浆中金属蛋白酶-8(mmp8)的水平升高。这些倾向可诊断细菌感染。换言之，如果与参考水平相比，患者表现出单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平降低，中性粒细胞上mertk(骨髓-上皮-生殖酪氨酸激酶)表达的水平升高，以及血浆中金属蛋白酶-8(mmp8)的水平升高，则可以说他/她患有细菌感染。相比之下，如果与参考水平相比，患者表现出单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平升高，或中性粒细胞上mertk(骨髓-上皮-生殖酪氨酸激酶)表达的水平降低，或血浆中金属蛋白酶-8(mmp8)的水平降低，则不能断定患者患有细菌感染。

66、在优选的实施方案中，所述方法或用途进一步包括测量中性粒细胞上cd64表达的水平降低，中性粒细胞上cd24表达的水平降低，以及测量单核细胞上cx3cr1表达的水平升高。这些倾向可诊断病毒感染。换言之，对于不患有细菌感染的患者(如通过上述方法所断定的)，如果与参考水平相比，患者表现出中性粒细胞上cd64表达的水平降低，中性粒细胞上cd24表达的水平降低，以及单核细胞上cx3cr1表达的水平升高，则可以说他/她患有病毒感染。相比之下，如果与参考水平相比，患者表现出中性粒细胞上cd64表达的水平升高，或中性粒细胞上cd24表达的水平升高，或单核细胞上cx3cr1表达的水平降低，则不能断定他/她患有病毒感染。

67、可选地，所述方法或用途包括测量单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平降低，测量血浆中降钙素原的水平升高，以及测量血浆中il-6的水平升高。这些倾向可诊断脓毒症-2。换言之，如果与参考水平相比，患者表现出单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平降低，血浆中降钙素原的水平升高，以及血浆中il-6的水平升高，则可以说他/她患有脓毒症-2。相比之下，如果与参考水平相比，患者表现出单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平升高，或血浆中降钙素原的水平降低，或血浆中il-6的水平降低，则不能断定他/她患有脓毒症-2。

68、可选地，所述方法或用途包括测量单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平降低，测量血浆中透明质酸的水平降低，以及测量血浆中肌酐的水平升高。这些倾向可诊断脓毒症-3。换言之，如果与参考水平相比，患者表现出单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平降低，血浆中透明质酸的水平降低，以及血浆中肌酐的水平升高，则可以说他/她患有脓毒症-3。相比之下，如果与参考水平相比，患者表现出单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平升高，或血浆中透明质酸的水平升高，或血浆中肌酐的水平降低，则不能断定他/她患有脓毒症-3。

69、在一方面，本发明涵盖用于诊断细菌感染的方法，所述方法包括：

70、a)提供来自患者的血液样品，优选在向患者施用任何液体复苏、抗生素或血管加压剂之前提供，

71、b)测量所述血液样品中单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平，

72、c)测量所述血液样品中中性粒细胞上mertk(骨髓-上皮-生殖酪氨酸激酶)表达的水平，

73、d)测量所述血液样品的血浆中金属蛋白酶-8(mmp8)的水平，以及

74、e)如果观察到与参考水平相比hla-dr表达的水平降低，mertk表达的水平升高，以及mmp8的水平升高，则诊断患者患有细菌感染。

75、在另一方面，本发明涵盖用于诊断病毒感染的方法，所述方法包括：

76、a)测量血液样品中中性粒细胞上cd64表达的水平，

77、b)测量血液样品中中性粒细胞上cd24表达的水平，以及

78、c)测量血液样品中单核细胞上cx3cr1表达的水平，以及

79、d)如果观察到与参考水平相比cd64表达的水平降低，cd24表达的水平降低，以及cx3cr1表达的水平升高，则诊断患者患有病毒感染。

80、在另一方面，本发明涵盖用于诊断细菌感染或病毒感染的方法，所述方法包括：

81、a)提供来自患者的血液样品，优选在向患者施用任何液体复苏、抗生素或血管加压剂之前提供，

82、b)测量所述血液样品中单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平，

83、c)测量所述血液样品中中性粒细胞上mertk(骨髓-上皮-生殖酪氨酸激酶)表达的水平，

84、d)测量所述血液样品的血浆中金属蛋白酶-8(mmp8)的水平，以及

85、e)如果观察到与参考水平相比hla-dr表达的水平降低，mertk表达的水平升高，以及mmp8的水平升高，则诊断患者患有细菌感染，

86、f)测量血液样品中中性粒细胞上cd64表达的水平，

87、g)测量血液样品中中性粒细胞上cd24表达的水平，以及

88、h)测量血液样品中单核细胞上cx3cr1表达的水平，以及

89、i)如果观察到与参考水平相比cd64表达的水平降低，cd24表达的水平降低，以及cx3cr1表达的水平升高，则诊断患者患有病毒感染。

90、在这些方法中，这些步骤可以按任意顺序进行或同时进行。此外，在该方法中，如果标志物之一没有如本文预期的那样升高/降低，则可以不进行导致诊断一种类型感染的所有步骤。例如，如果样品的单核细胞中hla-dr表达升高，则受试者不患有细菌感染，因此无需进行另外两种测量c)和d)，并且可以快速进行步骤f)或g)或h)。

91、尽管如果一种标志物没有如预期的那样升高/降低，则无需进行本发明的方法中的所有三个步骤，但总是优选通过检查其他标志物来确认结果。

92、在其他优选的实施方案中，所述方法进一步包括如[48]中提出的那样测量单核细胞上cd169表达的水平，以区分细菌感染和病毒感染。

93、这些方法可以对到达医院但对其感染状态一无所知的患者进行，或者对已经用生物标志物hla-dr、mertk和mmp8诊断为不患有细菌感染的患者进行。

94、在另一方面，本发明涵盖用于诊断脓毒症-2的方法，所述方法包括：

95、a)提供来自患者的血液样品，优选在向患者施用任何液体复苏、抗生素或血管加压剂之前提供，

96、b)测量血液样品中单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平，

97、c)测量血液样品的血浆中降钙素原的水平，

98、d)测量血液样品的血浆中il-6的水平，以及

99、e)如果观察到与参考水平相比hla-dr表达的水平降低，降钙素原的水平升高，以及il-6的水平升高，则诊断患者患有脓毒症-2。

100、在另一方面，本发明涵盖用于诊断脓毒症-3的方法，所述方法包括：

101、a)提供来自患者的血液样品，优选在向患者施用任何液体复苏、抗生素或血管加压剂之前提供，

102、b)测量血液样品中单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平，

103、c)测量血液样品的血浆中透明质酸的水平，

104、d)测量血液样品的血浆中肌酐的水平，以及

105、e)如果观察到与参考水平相比hla-dr表达的水平降低，透明质酸的水平降低，以及肌酐的水平升高，则诊断患者患有脓毒症-3。

106、这些诊断脓毒症的方法可以对到达医院但对其感染起源一无所知的疑似感染患者进行，或者对已经用生物标志物hla-dr、mertk和mmp8诊断为患有细菌感染的患者进行，或对如本发明的其他方法所提出的已经用生物标志物cd64、cd24和cx3cr1诊断为患有病毒感染的患者进行。

107、在本发明的方法中，优选使用众所周知的分析技术(如流式细胞术)来评估(测量、或鉴定、或检测)(任何细胞(包括血液和/或血浆细胞，如单核细胞、中性粒细胞)上的)细胞表面受体和/或细胞表面抗原的表达。特别是可以使用快速流式细胞术方案，如[39]和[47]中公开的那些方案，其通过引用并入本文。另一方面，可以使用众所周知的分析技术(如elisa或荧光免疫测定)来评估(测量、或鉴定、或检测)血浆生物标志物的量。

108、本发明的试剂盒

109、本发明还涵盖含有实现本发明的方法的所有必要技术装置的试剂盒。

110、特别是，所述装置是可以轻松检测以下的那些装置：

111、-细胞表面hla-dr表达的水平：在优选的实施方案中，可以使用与hla-dr高亲和力结合的特异性抗体。这些抗体是市售的。

112、-细胞表面mertk表达的水平：在优选的实施方案中，可以使用与mertk高亲和力结合的特异性抗体。这些抗体是市售的。

113、-细胞表面cd64表达的水平：在优选的实施方案中，可以使用与cd64高亲和力结合的特异性抗体。这些抗体是市售的。

114、-细胞表面cd24表达的水平：在优选的实施方案中，可以使用与cd24高亲和力结合的特异性抗体。这些抗体是市售的。

115、-细胞表面cx3cr1表达的水平：在优选的实施方案中，可以使用与cx3cr1高亲和力结合的特异性抗体。这些抗体是市售的。

116、-循环mmp8的水平：在优选的实施方案中，可以使用与mmp8高亲和力结合的特异性抗体。这些抗体是市售的。

117、-循环pct的水平：在优选的实施方案中，可以使用与pct高亲和力结合的特异性抗体。这些抗体是市售的。

118、-循环il-6的水平：在优选的实施方案中，可以使用与il-6高亲和力结合的特异性抗体。这些抗体是市售的。

119、-循环透明质酸的水平：在优选的实施方案中，可以使用与透明质酸高亲和力结合的特异性抗体。这些抗体是市售的。

120、-循环肌酐的水平：在优选的实施方案中，可以使用与肌酐高亲和力结合的特异性抗体。这些抗体是市售的。

121、有利地，用特定的荧光染料或荧光剂标记每种抗体(例如抗hla-dr、抗cd24、抗cd64、抗cx3cr1和其他抗体)(如本文所用：“标记抗体”)，使细胞仪能够鉴定携带由所述抗体识别的抗原的污染物细胞，并因此选择不携带所述抗原的细胞。可以使用的荧光染料是本领域众所周知的。它们包括荧光染料例如pe、apc、pe-cy5、alexa fluor 647、pe-cy-7、percp-cy5.5、alexa fluor 488、pacific blue、fitc、amcyan、apc-cy7、percp和apc-h7。

122、在优选的实施方案中，本发明的试剂盒含有区分病毒感染和细菌感染的所有装置，即特异性检测hla-dr、mertk和mmp8的抗体，或基本上由其组成。另一种优选的试剂盒含有特异性检测cd64、cd24和cx3cr1的抗体，或基本上由其组成。另一种优选的试剂盒含有特异性检测hla-dr、mertk、mmp8、cd64、cd24和cx3cr1的抗体，或基本上由其组成。

123、另一种优选的试剂盒含有区分脓毒症-2和脓毒症-3的所有装置，即特异性检测hla-dr、pct和il-6的抗体。另一种优选的试剂盒含有特异性检测hla-dr、透明质酸和肌酐的抗体，或基本上由其组成。另一种优选的试剂盒含有特异性检测hla-dr、pct、il-6、透明质酸和肌酐的抗体，或基本上由其组成。

124、如上面提出的，另一种优选的试剂盒含有特异性检测hla-dr、mertk、mmp8、cd64、cd24、cx3cr1、pct、il-6、透明质酸和肌酐的抗体，或基本上由其组成，以检测细菌/病毒感染，以及诊断患有脓毒症-2或脓毒-3的受试者。

125、这些试剂盒还可以含有可用于进行合适的分析技术的所有装置，例如细胞膜染色、免疫沉淀、流式细胞术、蛋白质印迹、elisa、elispot、抗体微阵列、免疫组织学、斑点印迹、蛋白质微阵列、或与免疫组织化学偶联的组织微阵列。

126、用于治疗的方法

127、在另外的方面，本发明涵盖用于治疗的方法。在一些实施方案中，所述方法进一步包括分别向已被诊断为患有细菌感染或病毒感染的患者施用抗微生物剂或抗病毒剂。

128、基于使用本文描述的生物标志物所定义的诊断来确定所施用的治疗。

129、具体地，本发明涵盖抗菌剂(如本文所公开的那些)用于治疗患者的用途，与参考水平相比，所述患者表现出单核细胞上hla-dr(人白细胞抗原dr)表达的水平降低，中性粒细胞上mertk(骨髓-上皮-生殖酪氨酸激酶)表达的水平升高，以及血浆中金属蛋白酶-8(mmp8)的水平升高。

130、此外，本发明涵盖抗病毒剂(如本文所公开的那些)用于治疗患者的用途，与参考水平相比，所述患者表现出中性粒细胞上cd64表达的水平降低，中性粒细胞上cd24表达的水平降低，以及单核细胞上cx3cr1表达的水平升高。

131、换言之，本发明涵盖根据本发明的方法的结果来选择疗法的方法(如果用本发明的方法诊断患者患有细菌感染，则疗法将是本领域已知的抗生素；而如果用本发明的方法诊断患者患有病毒感染，则疗法将是本领域已知的抗病毒剂)。

132、抗生素剂可以选自以下一种或多种：阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、妥布霉素(tobramycin)、巴龙霉素(paromomycin)、格尔德霉素(geldanamycin)、除莠霉素(herbimycin)、氯碳头孢(loracarbef)、厄他培南(ertapenem)、多尼培南(doripenem)、亚胺培南/西司他丁(imipenem/cilastatin)、美罗培南(meropenem)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢洛汀(cefalotin)、头孢氨苄(cefalexin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢托仑(cefditoren)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢布烯(ceftibuten)、cenizoxime、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢吡肟(cefepime)、头孢洛林酯(ceftaroline fosamil)、头孢吡普(ceftobiprole)、替考拉宁(teicoplanin)、万古霉素(vancomycin)、特拉万星(telavancin)、克林霉素(clindamycin)、林可霉素(lincomycin)、达托霉素(daptomycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、醋竹桃霉素(troleandomycin)、泰利霉素(telithromycin)、大观霉素(spectinomycin)、螺旋霉素(spiramycin)、氨曲南(aztreonam)、呋喃唑酮(furazolidone)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、阿莫西林(amoxicillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄西林(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、甲氧西林(methicillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素g(penicillin g)、青霉素v(penicillin v)、哌拉西林(piperacillin)、替莫西林(temocillin)、替卡西林(ticarcillin)、阿莫西林/克拉维酸(amoxicillin/clavulanate)、氨苄西林/舒巴坦(ampicillin/sulbactam)，哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam)、替卡西林/克拉维酸(ticarcillin/clavulanate)、杆菌肽(bacitracin)、粘菌素(colistin)、多粘菌素b(polymyxin b)、环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、萘啶酸(nalidixicacid)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、格帕沙星(grepafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、替马沙星(temafloxacin)、磺胺米隆(mafenide)、磺胺柯衣定(sulfonamidochrysoidine)、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺嘧啶银(silver sulfadiazine)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、磺胺二甲异噁唑(sulfanilimide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、磺胺异噁唑(sulfisoxazole)、甲氧苄啶(trimethoprim)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(trimethoprim-sulfamethoxazole)、地美环素(demeclocycline)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、土霉素(oxytetracycline)、四环素(tetracycline)、氯法齐明(clofazimine)、氨苯砜(dapsone)、卷曲霉素(capreomycin)、环丝氨酸(cycloserine)、乙胺丁醇(ethambutol)、乙硫异烟胺(ethionamide)、异烟肼(isoniazid)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、利福平(rifampicin)、利福布汀(rifabutin)、利福喷丁(rifapentine)、链霉素(streptomycin)、胂凡纳明(arsphenamine)、氯霉素(chloramphenicol)、磷霉素(fosfomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、利奈唑胺(linezolid)、甲硝唑(metronidazole)、莫匹罗星(mupirocin)、平板霉素(platensimycin)、奎奴普汀/达福普汀(quinupristin/dalfopristin)、利福昔明(rifaximin)、甲砜霉素(thiamphenicol)、替加环素(tigecycline)、替硝唑(tinidazole)、其药学上可接受的盐、其衍生物及其组合。

133、抗病毒剂可以选自：碘苷(idoxuridine)、三氟尿苷(trifluridine)、普可那利(pleconaril)、利福平(rifampicin)、福米韦生(fomivirsen)、阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛韦(acyclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、伐昔洛韦(valacyclovir)、西多福韦(cidofovir)、泛昔洛韦(famciclovir)、利巴韦林(ribavirin)、金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)、干扰素(interferon)、奥司他韦(oseltamivir)、帕利珠单抗(palivizumab)、金刚乙胺(rimantadine)、扎那米韦(zanamivir)、帕拉米韦(peramivir)、核苷类似物逆转录酶抑制剂(nrti)(如齐多夫定(zidovudine)、去羟肌苷(didanosine)、扎西他滨(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫定(lamivudine)和阿巴卡韦(abacavir))、非核苷逆转录酶抑制剂(nnrti)(如奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)和依法韦伦(efavirenz))、蛋白酶抑制剂(如沙奎那韦(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir))、和其他已知的抗病毒化合物和制剂。

134、定义

135、本发明的方法可以在任何动物上进行，特别是人。因此，如本文所用，术语“受试者”指任何动物(例如猫、狗、马、牛等)，并且还包括人。术语“患者”通常是指人受试者，特别是已被医院ed接受的人受试者。

136、在本方法中，生物样品优选为血液样品、血浆样品。由于单核细胞、中性粒细胞、钙卫蛋白和细胞因子主要存在于血液和血浆中，因此使用血液和/或血浆作为本发明的方法的生物样品是特别有利的。实际上，可以通过完全无害、非侵入性地从受试者采集血液和/或血浆来获得这种血液和/或血浆样品。优选地，通过常用的红细胞裂解程序去除本方法中使用的血液和/或血浆样品中的大多数(如果不是全部)红细胞。对剩余的血细胞即白细胞(例如中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞等)和血小板进行检测。

137、如本文所用，术语“血液样品”或“样品”是指可以含有单核细胞和/或中性粒细胞的任何血液样品，包括但不限于全血(例如未纯化的生血)或血浆。更优选地，生物样品是外周血液样品。实际上，可以通过完全无害且非侵入性地从受试者采集血液来获得这种血液样品。

138、本领域技术人员常用于血液学分析的任何体积对于本方法都将是方便的。例如，血液样品的体积可以是100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1000μl(1ml)。

139、如本文所用，“生物标志物(biomarker或biological marker)”是生物状态、病症、小病、疾病及其形式/阶段的可测量指标。生物标志物可以是这样的物质，检测到它指示特定的疾病状态，例如，抗原或细胞受体(或与其相关的细胞)的存在可能表明感染。它还可以用于优化治疗/疗法，并用于评估从特定疗法获益的可能性或收益(benefice)，并且可以在缩小诊断范围方面发挥作用。

140、在本发明的方法中，尤其可以使用众所周知的分析技术来评估(测量、或鉴定、或检测)(任何细胞(包括血液和/或血浆细胞，如单核细胞、中性粒细胞)上的)细胞表面受体和/或细胞表面抗原的表达，所述分析技术如使用生物素化或其他等效技术的细胞膜染色然后用特异性抗体进行免疫沉淀、流式细胞术、蛋白质印迹、elisa、elispot、抗体微阵列、免疫沉淀、免疫组织学、斑点印迹、蛋白质微阵列、或与免疫组织化学偶联的组织微阵列。其他合适的技术包括fret或bret、使用单个或多个激发波长并应用任何适合的光学方法的单细胞显微镜或组织化学方法，如电化学方法(伏安法和安培法技术)、原子力显微镜法和射频法，例如多极共振光谱法、共聚焦和非共聚焦、检测荧光、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射率以及双折射或折射率(例如表面等离子体共振、椭圆偏振法、共振镜方法、光栅耦合波导法或干涉法)、细胞elisa、放射性同位素、磁共振成像、聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析；hplc-质谱法；液相色谱/质谱/质谱(lc-ms/ms)。例如，当使用流式细胞术时，前向散射和侧向散射信息有助于鉴定其他血细胞中的单核细胞群体。优选地，通过流式细胞术对细胞(包括血液和/或血浆和/或骨髓细胞，如单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和白细胞，如上所定义)进行鉴定、选择、分选、定量(及其任意组合)。

141、如本文所用的术语“参考值”或“参考量”或“参考水平”是指指示受试者关于特定疾病(或小病、或病症)的状态的参数或生物标志物的值(或量、或水平)。可以通过检测数个合适的参考受试者中的参数/生物标志物来对参数或生物标志物的合适参考水平进行定量、确定或测量。可以根据特定的受试者群体调整此类参考水平。参考值或参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；一系列值；平均的值；中值、平均值或与特定对照或基线值相比的值。参考值可以基于个体样品的值，例如从来自受测试受试者的样品中、但是在较早的时间点获得的值。参考水平可以基于大量样品，如来自实足年龄匹配组的受试者群体，或者基于包括或不包括待测样品的样品池。根据上下文，参考水平对应于在来自健康参考受试者的样品上进行定量、或确定、或测量的参数(或生物标志物)的值；或对应于在同一健康参考受试者的不同样品上进行定量、或确定、或测量的参数(或生物标志物)的值(在各个时间间隔采集自同一健康参考受试者的样品上进行定量/确定/测量的值)的平均(平均值)；或对应于在来自健康参考受试者的同一样品上但在各个时间间隔确定/测量的参数/生物标志物的值的平均(平均值)；或对应于在来自数个健康参考受试者(至少两个健康参考受试者)的样品上进行定量/确定/测量的参数/生物标志物的值的平均(或平均值)。

142、可选地，参考水平可以对应于在来自不患有病毒感染或细菌感染的参考受试者的样品上进行定量、或确定、或测量的参数(或生物标志物)的值；或对应于在这种参考受试者的不同样品上进行定量、确定或测量的参数(或生物标志物)的值的平均(平均值)；或对应于在来自这种参考受试者的同一样品上但在各个时间间隔确定/测量的参数/生物标志物的值的平均(平均值)；或对应于在来自不患有病毒感染或细菌感染的数个参考受试者(至少两个参考受试者)的样品上进行定量/确定/测量的参数/生物标志物的值的平均(或平均值)。

143、在本发明中，生物标志物可以是必须在特定血细胞表面检测的特定蛋白质。在这种情况下，对于所述表面生物标志物(hla-dr、mertk、cd64、cd24、cxcr1)，优选通过例如通过流式细胞术测量这些表面蛋白的表达水平“升高”或“降低”，来测量所述表面生物标志物的表达水平“升高”或“降低”。

144、可选地，对于所述表面生物标志物(hla-dr、mertk、cd64、cd24、cxcr1)，可以通过例如通过流式细胞术测量表达高水平的这些表面蛋白的所述特定细胞的量“升高”或“降低”，来测量所述表面生物标志物的表达水平“升高”或“降低”。所述表面蛋白的确切的量并不重要，重要的是将待检测的表达足够量的所述蛋白的细胞数量(因此所述蛋白的表达量“高”)与参考样品中所述蛋白的表达量高的相同细胞的数量进行比较。换言之，不必须测量表面生物标志物的实际定量的“表达水平”，优选测量生物标志物的表达量“高”或“低”的细胞数量。然后将所述细胞数量与参考样品中生物标志物的表达量“高”或“低”的细胞数量进行比较。

145、本文中的术语“单核细胞”是指由骨髓从造血干细胞产生的一类白细胞(占循环白细胞的2至10％，在人外周血中为0.1至1×109/l)。它们在血液中循环，通常在1至7天之间，然后其中大多数迁移至组织中并在此分化，生成具有巨噬细胞表型的所谓“单核细胞衍生细胞”。单核细胞属于血液外周单个核细胞(pbmc)家族。pbmc是免疫系统中对抗感染和适应入侵者的关键组成部分。可以使用ficoll从全血中提取这些细胞，ficoll是一种分离血液层的亲水性多糖，会将血液分离为顶层血浆、然后是一层pbmc、以及多形核细胞(如中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)和红细胞的底层部分。单核细胞的大小和外观变化相当大，但它们显示出共同表达许多标志物，包括细胞表面抗原(或受体)。基于cd14和cd16标志物的表达，可以在人血液中鉴定出三个单核细胞亚群：a)“经典”单核细胞或mo1(如本文所用的“经典单核细胞”)，其特征在于高水平表达cd14细胞表面受体且不表达cd16细胞表面受体(cd14+/cd16-单核细胞或cd14高/cd16低)，b)“非经典”单核细胞或mo3(如本文所用的“非经典单核细胞”)，其显示出低水平的cd14或不表达cd14，另外共表达cd16受体(cd14-/cd16+单核细胞或cd14低/cd16高)，以及c)“中间”单核细胞或mo2(如本文所用的“中间单核细胞”)，其高水平表达cd14且cd16表达水平与mo3单核细胞相同(cd14+/cd16+单核细胞或cd14高/cd16高)([13]，[16]，[17])。

146、容易通过特异性抗原(包括细胞表面抗原，例如cd14或cd16)与形态特征(例如大小、形状、粒度等)的组合来鉴定单核细胞。

147、因此，大多数单核细胞(如经典单核细胞)表达“分化簇cd14”或“cd14”或“cd14分子/抗原”。人cd14的参考氨基酸序列是np_000582.1提及的ncbi序列。许多针对人cd14的抗体可市售获得。cd14在单核细胞表面表达，而在中性粒细胞的表达程度小10倍。

148、“分化簇cd16”或“cd16”或“cd16分子/抗原”是igg的fc部分的低亲和力受体(因此也称为fcγriii)，是一种在单核细胞中表达的糖蛋白，也在nk细胞和中性粒细胞中表达。存在两种亚型(a和b)。在人中，亚型a具有ncbi参考序列np_000560.5，亚型b具有ncbi参考序列np_001231682.1。已经生产了数种针对cd16/fcγriii的亚型a和b的单克隆抗体，并且已在这些蛋白质上定位对应的表位(参见例如[21]，[29]，[40])。针对cd16的抗体可市售获得。

149、单核细胞(包括经典单核细胞)也可以表达hla-dr细胞表面受体。这些单核细胞被称为hla-dr+单核细胞。hla-dr是一种mhc(主要组织相容性复合体)ii类细胞表面受体，由6号染色体区域6p21.31上的人白细胞抗原复合物编码。hla-dr(人白细胞抗原-dr亚型)和肽的复合物的长度通常在9和30个氨基酸之间，构成t细胞受体(tcr)的配体。hla-dr的主要功能是向免疫系统呈递潜在地源自外部的肽抗原，目的是引发或抑制t(辅助)细胞反应，所述反应最终导致产生针对同一肽抗原的抗体。抗原呈递细胞(巨噬细胞、b细胞和树突状细胞)是通常具有dr的细胞。hla-dr是一种αβ异二聚体细胞表面受体，其每个亚基含有两个细胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞质尾区。人hla-drα和β链的参考氨基酸序列可以由ncbi登录号aaa36275.1或aaa59785.1或aaa36302.1(α链)和aaa58651.1或aaa59816.1(β链)表示。

150、“中性粒细胞”也称为“中性白细胞”或“嗜异细胞”，是大多数哺乳动物中最丰富的粒细胞类型和最丰富的(60％至70％)白细胞类型。它们形成了先天免疫系统的重要部分，其功能在不同动物中有所不同。由于其半衰期短，这些特化的先天细胞需要不断由增殖性骨髓前体补充。中性粒细胞经历一个称为趋化性的过程，其允许它们向感染或炎症部位迁移。中性粒细胞具有多种特异性受体，包括补体、细胞因子(如白细胞介素和ifn-γ)、趋化因子、凝集素和其他蛋白质的受体。它们还表达检测并粘附至内皮的受体和调理素的fc受体。中性粒细胞表达的抗原包括但不限于cd10、cd11b、cd15、cd16、cd35、cd64、cd66a、cd66b、cd101、cd111、cd177等。可以通过cd177和/或cd15+cd66b+的表达将它们与其他白细胞区分。

151、如本文所用，“污染物细胞”或“污染物白细胞”是指存在于受试者的生物样品(有利地为血液样品)中并且不是单核细胞和/或中性粒细胞(取决于目标生物标志物)的细胞或白细胞。此类污染物细胞包括嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞(例如t细胞、nk细胞、b细胞)，以及这些细胞类型的前体。

152、在具体的实施方案中，有利地检测基本上纯的单核细胞群体，即没有污染物细胞的单核细胞群体。可以基于特定标志物的表达对剩余的白细胞进行鉴定和反选择。使用抗cd15、抗cd16、抗cd56、抗cd2或抗cd24抗体使得能够检测并因此排除(如有需要)表达cd2、cd56和cd24蛋白的细胞，尤其是cd2+t淋巴细胞、cd2+nk细胞、cd56+nk细胞、cd24+未成熟粒细胞以及cd15+或cd16++粒细胞。

153、对每种污染物细胞类型具有特异性的标志物(包括细胞表面受体/抗原)的存在使得能够在受试者的血液样品中鉴定这些细胞。然后可以从样品中(即物理上)去除或从分析中去除(即通过仅保留与单核细胞群体有关的数据进行分析)鉴定的污染物细胞，以使得研究仅关注单核细胞群体。在这方面，尽管上述任何分析技术都可以用于鉴定所述污染物白细胞，但流式细胞术特别适用于此任务，因为它使得技术人员能够以最小的努力消除污染物并分析单核细胞群体。特别是，可以使用抗体进行流式细胞术(尤其是流式细胞术排除设门)，所述抗体对以下细胞表达的众所周知的抗原具有特异性：粒细胞(cd24、cd15、cd16)、t淋巴细胞(cd2、cd3)、b淋巴细胞(cd24、cd19)、和/或nk细胞(cd2和/或cd56)，以弃去这些污染物细胞并仅保留单核细胞和/或中性粒细胞(取决于目标生物标志物)。因此，使用抗hla-dr、抗cd10、抗cd101、抗cd15、抗cd56、抗cd2或抗cd24抗体使得能够检测并因此排除表达cd2、cd10、cd101、cd15、cd56和cd24蛋白的细胞，尤其是cd2+t淋巴细胞、cd2+nk细胞、cd56+nk细胞、cd24+未成熟粒细胞以及cd15+粒细胞、(如有需要)hla-dr+单核细胞和/或(如有需要)cd10+cd101+细胞。

154、如本文所用，“选择疗法”或“选择治疗”或“选择药物”是指根据检测(观察和/或测量)的受试者的症状(或体征)、和/或根据受试者本人、以及医学领域(优选与疾病最接近的医学领域)的常识，选择(挑选、决定或抉择)对受试者最合适的疗法的过程。选择疗法包括选择最合适的疗法，并且还可以包括选择最合适的施用方式和/或最合适的剂量学。