用于无偏蛋白质组研究的传感器、其制造和使用方法与流程

本发明总体上涉及与用于发现、筛选和/或定量对表型有贡献的蛋白质的全蛋白质组、外显子组或外显子组-密码子序列(cds)区域广泛探询(exome-codon sequence(cds)region wide interrogation)相关的制品和方法。

背景技术：

0、技术背景

1、目前，几个主要挑战阻碍了医学诊断、生物标志物发现和药物发现的领域。挑战之一是缺乏可用于探询从低丰度的蛋白质(例如，存在于患者样品中的)到更丰富的蛋白质的宽动态范围的蛋白质的定量技术。

2、蛋白质组研究领域通常涉及基于分子的路径和生物相互作用的先验知识选择用于探询的蛋白质。所得的蛋白质小组通常受到可被探询的蛋白质数目以及蛋白质组中蛋白质的宽度限制。确定与表型相关的蛋白质的另一个挑战是提供方法和蛋白质小组，其促进野生型蛋白质相对于受影响的蛋白质组探询，以便获得在所研究的条件下可能起作用的宽范围蛋白质之间无偏倚的方法。

3、目前的蛋白质小组选择通常受到所采用的读出技术的限制，其中专用于每种蛋白质的独特传感器的数量不足以覆盖足够宽的动态范围，以允许蛋白质组、外显子组或外显子组-cds宽探询所需的生物标志物的宽度。

4、一种商购可得的方法使用邻近延伸测定，其中允许一对寡核苷酸标记的抗体(“探针”)在均相测定中与样品中存在的靶蛋白成对结合，而不需要洗涤。当两个探针非常接近时，通过依赖于接近度的dna聚合事件形成新颖的pcr靶序列。随后使用标准实时pcr(rt-pcr)检测和定量所得的靶序列。这种方法的局限是动态范围有限，因此可以探询的蛋白质数量有限。

5、此外，科学和医学研究者通常限于选择疾病聚焦的靶标，这通常导致有利于探询有限数量(例如，少于500个)的蛋白质的小组。例如，商购可得的心血管检测板(cardiovascular panel)使得能够进行多重免疫测定(邻近延伸测定),用于分析大约90种心血管疾病(cvd)相关的蛋白质生物标志物。在另一个实例中，多重免疫测定炎症小组可以通过靠近连接测定(proximity ligation assay)进行探询，所述靠近连接测定有助于分析大约90种炎症相关蛋白。

6、在另一种方法中，缀合有抗体的珠粒组以多重夹心免疫测定形式检测分析物。该组中的每个珠粒通过两种寻址染料的独特含量来识别，第三种染料用于通过缀合有生物素的抗体和缀合有链霉抗生物素蛋白的第二步检测器读出分析物的结合。在基于流式细胞仪的专用平台上采集数据。然而，这种方法具有有限的动态范围，限制了可被探询的标记，因此不便于真正的全蛋白质组探询。例如，示例性测定包含50重珠粒试剂盒，其允许分析50种人细胞因子和趋化因子。

7、尽管到目前为止已经做出了努力，但是仍然需要新的方法来以无偏倚方式在蛋白质组、外显子组或外显子组-cds中探询大量的高丰度和低丰度蛋白质，所述方法可用于鉴定给定表型的新生物标志物。

技术实现思路

1、本发明部分基于用于以无偏倚方式探询跨基因组编码的大量蛋白质(例如，高丰度和低丰度蛋白质)的方法的发展。该方法可以与传感器和读出技术结合使用，以促进无偏倚蛋白质组分析。

2、一个方面，本公开提供了确定蛋白质小组的方法，所述蛋白质小组包括选自研究受试者所属或与之相关的物种的全蛋白编码基因组的一组测试蛋白质。该方法包括：(a)从目的物种的全基因组中剪接蛋白质编码基因(例如，(i)内含子和外显子，(ii)外显子或(iii)编码序列区)，以构建蛋白质编码基因组(例如，分别为(i)蛋白质组、(ii)外显子组或(iii)外显子组-cds)；(b)确定在蛋白质编码基因组(例如，分别为(i)蛋白质组、(ii)外显子组或(iii)外显子组-cds)中基本上均匀间隔的多个标记位置；以及(c)鉴定与蛋白质编码基因组(例如，分别为(i)蛋白质组、(ii)外显子组或(iii)外显子组-cds)中每个标记位置相关的蛋白质，以产生测试蛋白质的组，其中每种蛋白质由包含位于蛋白质编码基因组中每个标记位置附近的单核苷酸多态性(snp)的基因编码。

3、在某些实施方案中，蛋白质编码基因包括外显子和内含子，并且蛋白质编码基因组是蛋白质组。或者，蛋白质编码基因是外显子，蛋白质编码基因组是外显子组。或者，蛋白质编码基因是编码序列(cds)区，蛋白质编码基因组是外显子组-cds。

4、可以设想，任何前述方法可包括一个或多个以下特征。例如，snps可以是同义的snps、非同义的snps或其组合。在蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中，标记位置可以彼此间隔约25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kb或12,000kb。

5、snp可以是蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中最接近标记位置的snp。snp是与生物标志物位置最接近的非同义snp，其中结合部分可以特异性结合由含有所述非同义snp的基因编码的蛋白质。所述snp可以是与标记位置最靠近的同义snp，其中结合部分可以特异性结合由含有同义snp的基因编码的蛋白质。

6、另一方面，本发明提供了确定蛋白质小组的方法，所述蛋白质小组包含选自研究受试者所属或与之相关的物种的全蛋白质编码基因组的一组测试蛋白质。该方法包括：(a)从目的物种的全基因组中剪接蛋白质编码基因(例如，(i)内含子和外显子，(ii)外显子，或(iii)cds)以构建蛋白质编码基因组(例如，分别为(i)蛋白质组，(ii)外显子组或(iii)外显子组-cds)，(b)确定蛋白质编码基因组(例如，分别为(i)蛋白质组，(ii)外显子组或(iii)外显子组-cds)中基本上均匀间隔的多个标记位置；以及(c)鉴定与蛋白质编码基因组(例如，分别为(i)蛋白质组，(ii)外显子组或(iii)外显子组-cds)中每个标记位置相关的蛋白质以产生测试蛋白质的组，其中每种蛋白质是由相关标记所在的基因组区域编码的蛋白质。

7、在某些实施方案中，所述蛋白质编码基因包括外显子和内含子，并且所述蛋白质编码基因组是蛋白质组。或者，所述蛋白质编码基因是外显子，所述蛋白质编码基因组是外显子组。或者，所述蛋白质编码基因是编码序列(cds)区，所述蛋白质编码基因组是外显子组-cds。

8、预期在蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中，标记位置可以彼此间隔约25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kb或12,000kb。

9、另一方面，本公开提供了传感器，用于检测从研究受试者收获的样品中多种蛋白质的存在或定量其量，从而对样品进行无偏倚蛋白质组、外显子组或外显子组-cds关联研究。该传感器包括限定多个可寻址小孔的平板，每个小孔包括设置在其中的载网，其中(i)载网包括多个纳米结构阵列，其中每个纳米结构阵列包括多个纳米结构，以及(ii)每个纳米结构阵列用一种或多种结合部分功能化，用于结合一个测试蛋白质组中的一种或多种蛋白质，以进行无偏倚蛋白质组、外显子组或外显子组-cds关联研究。任选地，所述测试蛋白质的组通过以下方式预先确定：(a)确定研究受试者所属或与之相关的物种的蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中基本上均匀间隔的多个标记位置；以及(b)鉴定与蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中每个标记位置相关的蛋白质，以产生所述测试蛋白质的组，其中每种蛋白质由包含位于外显子组中每个标记位置附近的单核苷酸多态性(snp)的基因编码。

10、可以设想，可以以各种不同的方式配置传感器。例如，snps可以是同义的snps、非同义的snps或其组合。在蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中，标记位置可以彼此间隔约25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kb或12,000kb。

11、传感器可包括至少20种不同的结合部分，用于结合测试蛋白质的组的每个成员。

12、snp可以是蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中最接近标记位置的snp。snp可以是与标记位置最接近的非同义snp，其中结合部分可以特异性结合由含有所述非同义snp的基因编码的蛋白质。snp可以是与标记位置最接近的同义snp，其中结合部分可以特异性结合由含有所述同义snp的基因编码的蛋白质。

13、snp可位于距离相应标记位置不到1,000个碱基的位置。所有snp可位于距离每个相应标记位置不到1,000个碱基的位置。

14、小孔内的所有纳米结构阵列可用结合部分(例如，抗体、纳米抗体、适体或亲和探针)进行功能化，用于结合测试蛋白质的组内的特定蛋白质。小孔内纳米结构阵列的一部分可用结合部分进行功能化，用于结合测试蛋白质的组内的特定蛋白质。

15、每个纳米结构可包括纳米针或基本上由其组成。纳米结构(例如纳米针)可与平面支撑物或柔性衬底中的至少一者整合。

16、在另一方面，本公开提供了生产传感器的方法，所述传感器用于检测从研究受试者收获的样品中多种蛋白质的存在或定量其量，从而对样品进行无偏倚蛋白质组、外显子组或外显子组-cds关联研究。该方法包括：(a)确定研究受试者所属或与之相关的物种的蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中基本上均匀间隔的多个标记位置；(b)鉴定与所述蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中的每个标记位置相关的蛋白质，以产生一个测试蛋白质的组，其中每种蛋白质由包含位于外显子组中每个标记位置附近的单核苷酸多态性(snp)的基因编码；以及(c)用多种不同的结合部分功能化传感器的纳米结构，每种结合部分能够结合测试蛋白质的组中的蛋白质，从而检测测试蛋白质的存在，或定量其量，如果测试蛋白质存在于样品中的话。

17、可以设想，该方法可包括一个或多个以下特征。可以重复步骤(a)-(c)，从而产生一系列传感器，其中用于产生第二传感器的标记位置从用于产生第一传感器的标记位置偏移预定距离。在蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中，标记位置可以彼此间隔25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kb或12,000kb。

18、传感器可以包括至少20种不同的结合部分，用于结合测试蛋白质组。结合部分可以是抗体、纳米抗体、适体或亲和探针。

19、snp可以是同义snp、非同义snp或其组合。根据情况，snp可以是蛋白质编码基因组、外显子组或外显子组-cds中最接近标记位置的snp。snp可以是最接近标记位置的非同义snp，其中结合部分可以特异性结合由含有所述非同义snp的基因编码的蛋白质。或者，snp可以是与标记位置最接近的同义snp，其中结合部分可以特异性结合由含有所述同义snp的基因编码的蛋白质。snp可位于距离相应标记位置不到1,000个碱基的位置。在某些实施方案中，snp可位于距离每个相应标记位置不到1,000个碱基的位置。

20、本公开还提供了通过任何前述方法产生的传感器。传感器可包括用多个不同的结合部分功能化的多个纳米结构，每个结合部分能够结合所述测试蛋白质组中的蛋白质，从而检测测试蛋白质的存在，或者定量测试蛋白质的量，如果测试蛋白质存在于样品中的话。

21、在另一方面，本公开提供了对目的样品进行无偏倚蛋白质组、外显子组或外显子组-cds宽范围关联研究的方法。该方法包括(a)将所述样品的至少一部分施加到本文所述的任何传感器上；(b)检测来自传感器和纳米结构的可检测信号；以及(c)从可检测信号确定样品中测试蛋白质的存在和/或量。

22、预期该方法可以包括一个或多个以下特征。可以用至少一个另外的传感器重复步骤(a)-(c)，以筛选目的样品的蛋白质小组。检测可检测信号的步骤可包括检测至少一部分的所述纳米结构的性质(例如，光学性质)的变化。在施加至传感器之前，可以稀释样品或可以不稀释样品。根据情况，样品可以是体液、组织提取物或细胞上清液。

23、当结合附图考虑时，根据以下各种非限制性实施方案的详细描述，本公开的其它有利方面和新颖特征将变得显而易见。