针对RAS蛋白的靶标接合测定法的制作方法

本文提供了用于鉴定ras结合化合物的系统、方法和化合物，所述ras结合化合物包括kras结合化合物、hras结合化合物和nras结合化合物。具体而言，本文公开了ras结合剂，所述ras结合剂包含ras结合部分和功能元件，并且能用于探测在多个ras结合位点处的靶标接合。

背景技术：

1、ras蛋白调节参与多个细胞过程的大量信号传导级联。ras基因是致癌基因，当该基因发生突变时，可导致正常细胞发生癌变。ras基因包括kras、hras和nras，它们分别编码kras蛋白、hras蛋白和nras蛋白。这些蛋白质将信号从细胞外部传递到细胞核，以指导细胞生长、分裂、成熟和/或分化。ras蛋白是充当分子开关的gtp酶，它通过将gtp转化为gdp来打开和关闭。

2、ras活化性突变是人类癌症中最常见的致癌性改变。ras活化性突变通过干扰gtp至gdp的循环过程来使ras蛋白固定在其活性gtp结合形式，该循环过程继而驱动细胞的赘生性转化。一种常见的kras活化性突变是krasg12c，该突变在非小细胞肺癌中尤为普遍。常见的hras活化性突变是hrasg12s和hrasg12v；hrasg12s突变与克斯提洛(costello)综合征相关，而hrasg12v与膀胱癌相关。nras突变(诸如nrasg12d和nrasq61r)与许多人类肿瘤(诸如黑素瘤)相关。

3、ras蛋白历来被认为是难以成药的。开发ras抑制剂一直是具有挑战性的，部分原因是ras蛋白对gtp底物具有极高的亲和力。例如，gtp以极高的亲和力占据ras蛋白的开关i(si)位点，因此细胞中的竞争性抑制被认为是几乎不可能的。最近发现，kras的致癌性变体(kras g12c)可以通过开关ii(sii)位点处的共价抑制来抑制。目前，在晚期临床试验(参见，例如，https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/nct03600883)中存在共价sii位点抑制剂。最近，人们发现，在si和sii位点之间存在浅结合袋。这个袋称为si/sii位点，可以为可逆抑制提供可能(kessler等人proc.natl.acad.sci.usa 116：158 23-15829(2019))。抑制剂bi-2852与野生型kras和kras突变体中的这个si/ii位点接合，并且可以抑制细胞中的下游kras信号传导事件。

技术实现思路

1、本文提供了用于使用ras结合剂来鉴定ras结合化合物的系统、方法和化合物，所述ras结合剂包含ras结合部分和功能元件。例如，本文提供了用于使用kras结合剂来鉴定kras结合化合物的系统、方法和化合物，所述kras结合剂包含kras结合部分和功能元件。所述kras结合部分结合至所述kras蛋白上的一个位点，但是所述系统和方法可以成功地查询其他kras结合位点处的接合，从而使广泛有用的活细胞靶标接合测定法能够鉴定经由不同机制结合的kras结合化合物(诸如kras抑制剂)。本文还描述了用于使用hras结合剂来鉴定hras结合化合物的系统、方法和化合物，所述hras结合剂包含hras结合部分和功能元件，以及用于使用nras结合剂来鉴定nras结合化合物的系统、方法和化合物，所述nras结合剂包含nras结合部分和功能元件。在一些实施方案中，ras结合剂是kras结合剂、hras结合剂和/或nras结合剂(即，所述结合剂可以结合至kras、hras和nras中的一者或全部)。

2、在一个方面，本文提供了一种鉴定ras结合化合物的方法，所述方法包括：

3、(a)提供包含ras蛋白的样品；以及

4、(b)使所述样品与包含ras结合部分和功能元件的ras结合剂以及候选ras结合化合物接触。

5、在一些实施方案中，本文提供了一种鉴定kras结合化合物的方法，所述方法包括：

6、(a)提供包含kras蛋白的样品；以及

7、(b)使所述样品与包含kras结合部分和功能元件的kras结合剂以及候选kras结合化合物接触。

8、在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)检测或定量所述功能元件。

9、在一些实施方案中，所述kras蛋白是kras变体。在一些实施方案中，所述kras变体是krasg12c、krasg12d、krasg12v、krasq61r、krasq61h、krasq61l或krasg13d。

10、在一些实施方案中，步骤(a)包括表达样品中的所述kras蛋白。

11、在一些实施方案中，本文提供了一种鉴定hras结合化合物的方法，所述方法包括：

12、(a)提供包含hras蛋白的样品；以及

13、(b)使所述样品与包含hras结合部分和功能元件的hras结合剂以及候选hras结合化合物接触。

14、在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)检测或定量所述功能元件。

15、在一些实施方案中，所述hras蛋白是hras变体。在一些实施方案中，所述hras变体是hrasg12s或hrasg12v。

16、在一些实施方案中，步骤(a)包括表达样品中的所述hras蛋白。

17、在一些实施方案中，本文提供了一种鉴定nras结合化合物的方法，所述方法包括：

18、(a)提供包含nras蛋白的样品；以及

19、(b)使所述样品与包含nras结合部分和功能元件的nras结合剂以及候选nras结合化合物接触。

20、在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)检测或定量所述功能元件。

21、在一些实施方案中，所述nras蛋白是nras变体。在一些实施方案中，所述nras变体是nrasg12d或nrasq61r。

22、在一些实施方案中，步骤(a)包括表达样品中的所述nras蛋白。

23、在一些实施方案中，所述ras结合剂是式(i)的化合物：

24、

25、或其盐，其中：

26、a是单环芳基或杂芳基；

27、r1、r2和r3中的一者是基团-接头-b，其中b是功能元件；并且

28、r1、r2和r3中的另外两者独立地选自氢和甲基。

29、在一些实施方案中，a选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。在一些实施方案中，r1是基团-接头-b，并且r2和r3独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，r3是基团-接头-b，并且r1和r2独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，接头具有下式：

30、

31、其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。

32、在一些实施方案中，所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、mri造影剂、spect造影剂和质量标签。在一些实施方案中，所述可检测元件或由此产生的信号通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(mri)、单光子发射计算机断层扫描(spect)或能量转移来检测或定量。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的固体支持物：沉积颗粒、膜、玻璃、管、孔、自组装单层、表面等离子共振芯片和具有电子传导表面的固体支持物。在一些实施方案中，所述沉积颗粒是磁性颗粒。在一些实施方案中，所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(protac)标记来诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述可检测元件是荧光团。

33、在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物结合所述ras蛋白。在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物是ras抑制剂。在一些实施方案中，所述ras结合剂结合至ras开关i/ii位点。在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物结合至所述ras开关i/ii位点或所述ras开关ii位点。

34、在一些实施方案中，所述样品选自细胞、细胞裂解物、体液、组织、生物样品、体外样品、环境样品、无细胞样品和纯化的样品(例如，纯化的蛋白质样品)。

35、在一些实施方案中，所述ras蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体提供。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白是与seq id no：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。在一些实施方案中，所述样品包括第一ras蛋白和第二ras蛋白，所述第一ras蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二ras蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与seq id no：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与seq id no：26具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。

36、在一些实施方案中，所述方法还包括使所述样品与所述生物发光报道蛋白的底物接触。在一些实施方案中，所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪(furimazine)。

37、在一个方面，本文提供了一种系统，所述系统包括：

38、(a)靶标ras蛋白；

39、(b)ras结合剂，所述ras结合剂包含ras结合部分和功能元件；以及

40、(c)候选ras结合化合物。

41、在一些实施方案中，本文提供了一种系统，所述系统包括：

42、(a)靶标kras蛋白；

43、(b)kras结合剂，所述kras结合剂包含kras结合部分和功能元件；以及

44、(c)候选kras结合化合物。

45、在一些实施方案中，所述靶标kras蛋白在所述系统内表达。在一些实施方案中，所述靶标kras蛋白是kras变体。在一些实施方案中，所述kras变体选自krasg12c、krasg12d、krasg12v、krasq61r、krasq61h、krasq61l和krasg13d。

46、在一些实施方案中，本文提供了一种系统，所述系统包括：

47、(a)靶标hras蛋白；

48、(b)hras结合剂，所述hras结合剂包含hras结合部分和功能元件；以及

49、(c)候选hras结合化合物。

50、在一些实施方案中，所述靶标hras蛋白在所述系统内表达。在一些实施方案中，所述hras蛋白是hras变体。在一些实施方案中，所述hras变体是hrasg12s或hrasg12v。

51、在一些实施方案中，本文提供了一种系统，所述系统包括：

52、(a)靶标nras蛋白；

53、(b)nras结合剂，所述nras结合剂包含nras结合部分和功能元件；以及

54、(c)候选nras结合化合物。

55、在一些实施方案中，所述靶标nras蛋白在所述系统内表达。在一些实施方案中，所述nras蛋白是nras变体。在一些实施方案中，所述nras变体是nrasg12d或nrasq61r。

56、在一些实施方案中，所述ras结合剂是式(i)的化合物：

57、

58、或其盐，其中：

59、a是单环芳基或杂芳基；

60、r1、r2和r3中的一者是基团-接头-b，其中b是功能元件；并且

61、r1、r2和r3中的另外两者独立地选自氢和甲基。

62、在一些实施方案中，a选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。在一些实施方案中，r1是基团-接头-b，并且r2和r3独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，r3是基团-接头-b，并且r1和r2独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，接头具有下式：

63、

64、其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。

65、在一些实施方案中，所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、mri造影剂、spect造影剂和质量标签。在一些实施方案中，所述可检测元件或由此产生的信号可通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(mri)、单光子发射计算机断层扫描(spect)或能量转移来检测或定量。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的固体支持物：沉积颗粒、膜、玻璃、管、孔、自组装单层、表面等离子共振芯片和具有电子传导表面的固体支持物。在一些实施方案中，所述沉积颗粒是磁性颗粒。在一些实施方案中，所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(protac)标记来诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述可检测元件是荧光团。

66、在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物结合所述ras蛋白。在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物是ras抑制剂。

67、在一些实施方案中，所述ras结合部分结合至所述ras开关i/ii位点。在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物结合至所述ras开关i/ii位点或所述ras开关ii位点。

68、在一些实施方案中，所述系统包括选自以下的样品：细胞、细胞裂解物、体液、组织、生物样品、体外样品、环境样品、无细胞样品和纯化的样品(例如，纯化的蛋白质样品)。

69、在一些实施方案中，所述靶标ras蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体存在。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白是与seq id no：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。在一些实施方案中，所述靶标ras蛋白包括第一ras蛋白和第二ras蛋白，所述第一ras蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二ras蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与seq id no：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与seq id no：26具有至少70％的序列同一性。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。

70、在一些实施方案中，所述系统还包括所述生物发光报道蛋白的底物。在一些实施方案中，所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪。

71、在一个方面，本文提供了一种ras结合剂，所述ras结合剂包含：

72、(a)ras结合部分；以及

73、(b)功能元件。

74、在一些实施方案中，所述ras结合剂是kras结合剂，所述kras结合剂包含：

75、(a)kras结合部分；以及

76、(b)功能元件。

77、在一些实施方案中，所述ras结合剂是hras结合剂，所述hras结合剂包含：

78、(a)hras结合部分；以及

79、(b)功能元件。

80、在一些实施方案中，所述ras结合剂是nras结合剂，所述nras结合剂包含：

81、(a)nras结合部分；以及

82、(b)功能元件。

83、在一些实施方案中，所述ras结合剂还包含接头，所述接头将所述ras结合部分与所述功能元件连接。

84、在一些实施方案中，所述ras结合剂是式(i)的化合物：

85、

86、或其盐，其中：

87、a是单环芳基或杂芳基；

88、r1、r2和r3中的一者是基团-接头-b，其中b是功能元件；并且

89、r1、r2和r3中的另外两者独立地选自氢和甲基。

90、在一些实施方案中，a选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。在一些实施方案中，r1是基团-接头-b，并且r2和r3独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，r3是基团-接头-b，并且r1和r2独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，接头具有下式：

91、

92、其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。

93、在一些实施方案中，所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、mri造影剂、spect造影剂和质量标签。在一些实施方案中，所述可检测元件是荧光团。在一些实施方案中，所述可检测元件或由此产生的信号通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(mri)、单光子发射计算机断层扫描(spect)或能量转移来检测或定量。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的固体支持物：沉积颗粒、膜、玻璃、管、孔、自组装单层、表面等离子共振芯片和具有电子传导表面的固体支持物。在一些实施方案中，所述沉积颗粒是磁性颗粒。在一些实施方案中，所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(protac)标记来诱导蛋白质降解的部分。

94、在一些实施方案中，所述ras结合部分结合至所述ras开关i/ii位点。

95、在一个方面，本文公开了一种组合物，所述组合物包含本文所述的ras结合剂(例如，包含ras结合部分和功能元件的ras结合剂，诸如式(i)的化合物)。

96、在一些实施方案中，所述组合物还包含ras蛋白。在一些实施方案中，所述ras蛋白选自kras蛋白、hras蛋白和nras蛋白。在一些实施方案中，所述ras蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体存在。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白是与seq id no：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。在一些实施方案中，所述组合物包含第一ras蛋白和第二ras蛋白，所述第一ras蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二ras蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与seq id no：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与seq id no：26具有至少70％的序列同一性。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。

97、在一些实施方案中，所述组合物还包括所述生物发光报道蛋白的底物。在一些实施方案中，所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪。

98、在一些实施方案中，所述组合物还包含候选ras结合化合物。在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物是候选kras结合化合物、候选hras结合化合物或候选nras结合化合物。在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物是ras抑制剂。在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物结合至所述ras开关i/ii位点或所述ras开关ii位点。

99、在一个方面，本文提供了一种用于筛选ras结合化合物的方法，所述方法包括：

100、(a)使样品与候选ras结合化合物接触，所述样品包括：(i)ras蛋白；和(ii)ras结合剂，所述ras结合剂包含ras结合部分和功能元件；以及

101、(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。

102、在一些实施方案中，本文提供了一种用于筛选kras结合化合物的方法，所述方法包括：

103、(a)使样品与候选kras结合化合物接触，所述样品包括：(i)kras蛋白；和(ii)kras结合剂，所述kras结合剂包含kras结合部分和功能元件；以及

104、(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。

105、在一些实施方案中，所述kras蛋白是kras变体。在一些实施方案中，所述kras变体选自krasg12c、krasg12d、krasg12v、krasq61r、krasq61h、krasq61l和krasg13d。

106、在一些实施方案中，本文提供了一种用于筛选hras结合化合物的方法，所述方法包括：

107、(a)使样品与候选hras结合化合物接触，所述样品包括：(i)hras蛋白；和(ii)hras结合剂，所述hras结合剂包含hras结合部分和功能元件；以及

108、(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。

109、在一些实施方案中，所述hras蛋白是hras变体。在一些实施方案中，所述hras变体是hrasg12s或hrasg12v。

110、在一些实施方案中，本文提供了一种用于筛选nras结合化合物的方法，所述方法包括：

111、(a)使样品与候选nras结合化合物接触，所述样品包括：(i)nras蛋白；和(ii)nras结合剂，所述nras结合剂包含nras结合部分和功能元件；以及

112、(b)检测或定量来自所述功能元件的信号。

113、在一些实施方案中，所述nras蛋白是nras变体。在一些实施方案中，所述nras变体是nrasg12d或nrasq61r。

114、在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物结合所述ras蛋白并且可检测地改变来自所述功能元件的信号。

115、在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物是ras抑制剂。在一些实施方案中，所述候选ras结合化合物结合至所述ras开关i/ii位点或所述ras开关ii位点。

116、在一些实施方案中，所述ras结合剂是式(i)的化合物：

117、

118、或其盐，其中：

119、a是单环芳基或杂芳基；

120、r1、r2和r3中的一者是基团-接头-b，其中b是功能元件；并且

121、r1、r2和r3中的另外两者独立地选自氢和甲基。

122、在一些实施方案中，a选自苯基、咪唑、吡咯、吡啶基、噻吩和三唑。在一些实施方案中，r1是基团-接头-b，并且r2和r3独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，r3是基团-接头-b，并且r1和r2独立地选自氢和甲基。在一些实施方案中，接头具有下式：

123、

124、其中m、n和p独立地为0、1、2、3、4、5或6。

125、在一些实施方案中，所述功能元件是可检测元件、亲和元件、捕获元件、固体支持物或诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是选自以下的可检测元件：荧光团、发色团、放射性核素、电子不透明分子、mri造影剂、spect造影剂和质量标签。在一些实施方案中，所述可检测元件或由此产生的信号通过荧光、质谱、光学成像、放射性核素检测、磁共振成像(mri)、单光子发射计算机断层扫描(spect)或能量转移来检测或定量。在一些实施方案中，所述功能元件是诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述功能元件是通过蛋白水解靶向嵌合体(protac)标记来诱导蛋白质降解的部分。在一些实施方案中，所述可检测元件是荧光团。

126、在一些实施方案中，所述ras结合部分结合至所述ras开关i/ii位点。

127、在一些实施方案中，所述ras蛋白作为与生物发光报道蛋白的融合体存在。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白是与seq id no：24具有至少70％的序列同一性的荧光素酶。在一些实施方案中，所述ras蛋白包括第一ras蛋白和第二ras蛋白，所述第一ras蛋白与生物发光报道蛋白的第一亚基融合，所述第二ras蛋白与生物发光报道蛋白的第二亚基融合，其中所述第一亚基和所述第二亚基是互补的。在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的所述第一亚基与seq id no：25具有至少70％的序列同一性，并且所述生物发光报道蛋白的所述第二亚基与seq id no：26具有至少70％的序列同一性。

128、在一些实施方案中，所述生物发光报道蛋白的发射光谱与所述功能元件的激发光谱重叠。

129、在一些实施方案中，所述组合物还包括所述生物发光报道蛋白的底物。在一些实施方案中，所述底物是腔肠素、腔肠素衍生物或呋瑞吗嗪。