多毛细管电泳装置的制作方法

本公开涉及多毛细管电泳装置。

背景技术：

1、广泛使用如下的毛细管电泳装置：在单个或多个毛细管中填充电解质溶液或含有高分子凝胶或聚合物的电解质溶液等电泳分离介质，进行电泳分析。分析对象从低分子到蛋白质、核酸等高分子范围广泛。另外，在测量模式中，有将灯光照射到各毛细管的吸光点，检测分析对象通过吸光点时产生的灯光的吸收的模式，或者将激光照射到各毛细管的发光点，检测分析对象通过发光点时产生的荧光或散射光的模式等多个。以下，以dna分析用毛细管电泳装置为例进行详细说明。

2、在dna分析用毛细管电泳装置中，通过向在同一平面上排列e根(e为1以上的整数)毛细管的部位一并照射激光束，形成在直线上排列的e个发光点。用g种(g为1以上的整数)荧光体标记的dna片段通过电泳而通过发光点时，通过激光束照射激发荧光体，发出荧光。由于这些g种荧光体具有相互不同的荧光光谱，因此通过对荧光进行分光测量，能够确定通过发光点的荧光体的种类。即，在dna分析用毛细管电泳装置中，对从排列在直线上的e个发光点发出的荧光进行分光测量，进而测量其时间变化。为了实现该目的，在dna分析用毛细管电泳装置中具备以下那样的多色检测光学系统。从e个发光点发出的荧光一并被第一照相机透镜准直，在通过长通滤光片(long pass filter)激光波长的光被截止之后，通过透射型衍射光栅进行波长分散，通过第二照相机透镜在图像传感器上成像。作为图像传感器，可以使用ccd、cmos或其他种类的器件。在此，波长分散的方向是与各毛细管的长轴平行的方向、即与各发光点所排列的方向垂直的方向。因此，在图像传感器上，来自各发光点的荧光的波长分散像相互不混合而相互平行地排列。因此，能够独立地对来自各发光点的荧光进行分光测量。另外，以图像传感器的像素的二维格子状排列的一方的轴与波长分散方向平行、另一方的轴与发光点的排列方向平行的方式配置图像传感器。其结果，沿着各波长分散像的像素排列的强度分布赋予荧光光谱。通过以恒定的曝光时间进行基于图像传感器的e个波长分散像的一并拍摄，并以恒定的时间间隔连续地进行该一并拍摄，能够一边对来自e个发光点的荧光进行分光分析，一边分析它们的时间序列变化。

3、将各波长分散像分割为f个波段(以下称为区间(bin))，对由属于各个区间的多个像素接收到的荧光强度进行累计。将这样进行累计称为合并(binning)。这被称为f色检测。各波段的波长宽度可以为1nm、10nm、100nm，可以任意设定。另外，在f个波段中，各波段波长宽度也可以不同。通常，为了一边识别g种荧光体一边进行定量，需要f≥g。针对时间序列的各时刻，对f色检测结果实施颜色转换，能够取得g种荧光体各自的单独的荧光强度、即g种荧光体各自的浓度。在本公开中，将与各荧光体的浓度成比例的荧光强度、即各荧光体各自的单独的荧光强度简称为浓度。

4、对于发光点p(e)(e＝1，2，…，e)，分别在区间w(f)(f＝1，2，…，f)中检测荧光体d(g)(g＝1，2，…，g)的发光荧光。在任意时刻，将发光点p(e)处的荧光体d(g)的浓度设为z(g)，将在关于发光点p(e)的区间w(f)中累计的信号强度设为x(f)。在此，将以信号强度x(f)为要素的f行1列的向量设为x，将以浓度z(g)为要素的g行1列的向量设为z，将以y(f)(g)为要素的f行g列的矩阵设为y，下式(1)～式(4)成立。式(1)～式(4)是(f)和(g)的关系式，但不是(e)的关系式，而是针对各发光点p(e)分别独立地成立。在f＝1的单色检测的情况下，通过f≥g，g＝1，x、y、z都不是向量和矩阵。

5、[数式1]

6、x＝y×z     (1)

7、[数式2]

8、

9、[数式3]

10、

11、[数式4]

12、

13、在此，f行g列的矩阵y的元素y(f)(g)表示由于光谱串扰而在区间w(f)中检测出荧光体d(g)的发光荧光的信号强度比率。通过使任意一种荧光体d(g0)单独进行荧光发光，能够决定矩阵y的1列要素y(f)(g0)(f＝1，2，…，f)。在此，严格地控制荧光体d(g0)的浓度通常是困难的，因此，如果将1列要素y(f)(g0)标准化，则是便利的。例如，可以将f个要素中的最大的要素设为1，用相对于最大值的比率来表示其他要素。或者，可以以f个要素的合计为1的方式决定各要素的比率。即，可以成为下述式(5)。

14、[数式5]

15、

16、然后，通过对g种荧光体d(g)全部单独进行上述工序，能够决定矩阵y的全部列。矩阵y仅由荧光体d(g)以及不同的区间w(f)的特性决定，在电泳分析的过程中不变化。另外，只要固定光学系统、荧光体d(g)、区间w(f)等条件，对于不同的电泳分析，矩阵y也保持恒定。因此，关于各发光点，各时刻的荧光体d(g)的浓度z(g)根据各时刻的区间w(f)的信号强度x(f)，通过下面的式(6)求出。

17、[数式6]

18、z＝y-×x     (6)

19、在此，y-是g行f列的y的一般逆矩阵，通过y-＝(yt×y)-1×yt)来求出。在矩阵y为f＝g的正方矩阵的情况下，y-与逆矩阵y-1相等。将式(6)的运算称为颜色转换或光谱串扰消除。式(1)是表示未知的g种荧光体的浓度与已知的f色荧光强度的关系的联立方程式，式(6)相当于求出其解。因此，一般而言，如上所述，需要f≥g的条件。假设f＜g，则无法唯一地求出解(即，由于可能存在多个解)，因此无法如式(6)那样执行颜色转换。

20、也可以使用不使用波长分散的多色检测光学系统。例如，在专利文献1中，从e个发光点发出的荧光分别被e个透镜单独准直，通过长通滤光片激光波长的光被截止之后，通过f个分色镜阵列分割成f个波段的光束，在图像传感器上成像。在此，分割的方向是与各毛细管的长轴平行的方向、即与各发光点所排列的方向垂直的方向。因此，在图像传感器上，e×f个的多色分割像相互不混合而二维状地排列。因此，能够独立地对来自各发光点的荧光进行分光测量。另外，以图像传感器的像素的二维格子状排列的一方的轴与分割方向平行、另一方的轴与发光点排列方向平行的方式配置图像传感器。通过以恒定的曝光时间进行基于图像传感器的e×f个的分割像的一并拍摄，并以恒定的时间间隔连续进行该一并拍摄，能够一边对来自e个发光点的荧光进行分光分析，一边分析它们的时间序列变化。对各发光点的f个分割像的每一个受光的多个像素的荧光强度进行累计。与基于波长分散的多色检测光学系统同样地，将累计的像素区域称为区间，将这样的累计称为合并。在此，也可以存在各分割像中的不包含在任意的区间中的区域。其他也与基于波长分散的多色检测光学系统相同，式(1)～式(6)也同样成立。以下，对使用基于波长分散的多色检测光学系统的情况进行研究，但对于使用了不使用如上所述的波长分散的多色检测光学系统的情况也能够同样地进行研究。

21、如上所述，区间w(f)的信号强度x(f)是对构成区间w(f)的各个像素的信号强度进行累计(合并)而得到的。将构成区间w(f)的像素数设为bm(f)。bm(f)是1以上的整数。这里，在将构成区间w(f)的像素j的信号强度设为q(j)(j＝1，2，…，bm(f))时，区间w(f)的信号强度x(f)由下述式(7)表示。

22、[数式7]

23、

24、在此的累计法(合并方法)中有硬合并(hard binning)和软合并(soft binning)。其中，式(7)在两个合并方法中是共通的。硬合并是如下方法：在图像传感器上对在bm(f)个像素中蓄积的电荷进行合计后，转换为电压，进行ad转换，由此得到信号强度x(f)。另一方面，软合并是如下的方法：通过在电路上或计算机上对bm(f)个像素的信号值进行合计而得到信号强度x(f)。例如，软合并是如下的方法：通过将在图像传感器上蓄积于各像素的电荷转换为电压，将ad转换而得到的数字数据在计算机上进行累计而得到信号强度x(f)。如后所述，也能够将硬合并与软合并组合而得到信号强度x(f)。通常，已知与软合并相比，在硬合并中，能够减少读出噪声，能够提高灵敏度，因此适用于高灵敏度测量。特别是在测量微弱光时，硬合并是极其有利的方法。另外，与软合并相比，在硬合并中，能够缩短读出区间w(f)的信号强度x(f)的时间，因此适用于高速拍摄。另一方面，已知与软合并相比，在硬合并中，来自发光点的发光量的饱和水平降低，因此动态范围缩小。因此，通过将硬合并切换为软合并，能够扩大动态范围，但同时存在检测灵敏度降低的课题。在目前市售的dna分析用毛细管电泳装置中，灵敏度比动态范围更重要，因此不是通过软合并，而是通过硬合并来求出信号强度x(f)。然而，近年来，在dna分析用毛细管电泳装置中，要求兼顾灵敏度和动态范围。为了实现这一点，如以下所示，开发了各种现有技术。

25、在专利文献2中，不是如上述那样使基于图像传感器的拍摄中的曝光时间恒定，而是交替地反复长的曝光时间和短的曝光时间。在来自发光点的发光量恒定的条件下，在长曝光时间，图像传感器接收更多的荧光，因此灵敏度提高。相反，在短曝光时间内，由于接收更少的荧光，因此灵敏度降低，但来自发光点的发光量的饱和水平增大。即，长曝光时间作为高灵敏度模式发挥功能，短曝光时间作为低灵敏度模式发挥功能。在来自发光点的发光量小的情况下，在低灵敏度模式下无法检测发光荧光，但在高灵敏度模式下能够良好地测量发光荧光。另一方面，在来自发光点的发光量大的情况下，在高灵敏度模式下发光荧光超过饱和水平，因此无法良好地测量发光荧光，但在低灵敏度模式下能够良好地测量发光荧光。因此，通过组合高灵敏度模式和低灵敏度模式，与单一模式(例如，高灵敏度模式和低灵敏度模式中的任一模式)的情况不同，能够兼顾高灵敏度和高动态范围。

26、在专利文献3中，在上述多色检测光学系统中加入非对称的像分割元件，使来自各发光点的发光荧光分为强荧光强度的波长分散像(以下称为强分割像)和弱荧光强度的波长分散像(以下称为弱分割像)而成像，并同时测量这些波长分散像。对双方的波长分散像设定上述的区间。在来自发光点的发光量恒定的条件下，在强分割像中，图像传感器的对应的区间接收更多的荧光，因此灵敏度提高。相反，在弱分割像中，由于接收更少的荧光，因此灵敏度降低，但来自发光点的发光量的饱和水平增大。即，强分割像作为高灵敏度模式发挥功能，弱分割像作为低灵敏度模式发挥功能。在来自发光点的发光量小的情况下，在低灵敏度模式下无法检测发光荧光，但在高灵敏度模式下能够良好地测量发光荧光。另一方面，在来自发光点的发光量大的情况下，在高灵敏度模式下发光荧光超过饱和水平，因此无法良好地测量发光荧光，但在低灵敏度模式下能够良好地测量发光荧光。因此，通过组合高灵敏度模式和低灵敏度模式，与单一模式(例如，高灵敏度模式和低灵敏度模式中的任一模式)的情况不同，能够兼顾高灵敏度和高动态范围。

27、在专利文献4中，不是如上述那样仅通过硬合并来取得区间w(f)的信号强度x(f)，而是适当切换硬合并和软合并来取得区间w(f)的信号强度x(f)。基于上述的硬合并与软合并的特性，硬合并作为高灵敏度模式发挥功能，软合并作为低灵敏度模式发挥功能。在来自发光点的发光量小的情况下，在低灵敏度模式下无法检测发光荧光，但在高灵敏度模式下能够良好地测量发光荧光。另一方面，在来自发光点的发光量大的情况下，在高灵敏度模式下发光荧光超过饱和水平，因此无法良好地测量发光荧光，但在低灵敏度模式下能够良好地测量发光荧光。因此，通过组合高灵敏度模式和低灵敏度模式，与单一模式(例如，高灵敏度模式和低灵敏度模式中的任一模式)的情况不同，能够兼顾高灵敏度和高动态范围。

28、在专利文献5中，不是如上述那样固定区间w(f)而是使区间w(f)适当变化。具体而言，在f个信号强度x(f)(f＝1，2，…，f)均未超过饱和水平的情况下，与上述同样地设定区间w(f)(f＝1，2，…，f)(以下，称为全部硬合并)，在任意一个信号强度超过饱和水平的情况下，将对应的区间w(f)置换为零而使其无效化(以下，称为部分硬合并)。例如，在区间w(f0)超过饱和水平的情况下，将式(3)的矩阵y的f0行的要素y(f0)(g)(g＝1，2，…，g)全部设为零。在来自发光点的发光量恒定的条件下，在全部硬合并中，由于区间整体接收更多的荧光，因此灵敏度提高。相反，在部分硬合并中，由于区间整体接收更少的荧光，因此灵敏度降低，但来自发光点的发光量的饱和水平增大。即，全部硬合并作为高灵敏度模式发挥功能，部分硬合并作为低灵敏度模式发挥功能。在来自发光点的发光量小的情况下，在低灵敏度模式下无法检测发光荧光，但在高灵敏度模式下能够良好地测量发光荧光。另一方面，在来自发光点的发光量大的情况下，在高灵敏度模式下发光荧光超过饱和水平，因此无法良好地测量发光荧光，但在低灵敏度模式下能够良好地测量发光荧光。因此，通过组合高灵敏度模式和低灵敏度模式，与单一模式(例如，高灵敏度模式和低灵敏度模式中的任一模式)的情况不同，能够兼顾高灵敏度和高动态范围。

29、以上所示的专利文献2～专利文献5均通过组合高灵敏度模式和低灵敏度模式，在维持高灵敏度的同时实现高动态范围。在两种模式的组合方式中，虽然存在交替地切换模式、或者根据测量出的信号适当地切换模式或同时实施两种模式等差异，但基本的特征是共通的。另外，该方法不仅在dna分析用毛细管电泳装置中有效，而且在使用单个或多个毛细管进行电泳、利用图像传感器或线传感器分别识别多种荧光体所发出的荧光、多种散射体所散射的散射光或多种吸收体所吸收的吸光的同时进行测量的分析方法及分析装置的整体中都是有效的。

30、另一方面，在大量的用于智能手机的数码相机等市售的数码相机中，通过组合高灵敏度模式和低灵敏度模式，能够在维持高灵敏度的同时实现高动态范围。通常，被称为hdr(high dynamic range，高动态范围)拍摄。典型地，与专利文献2同样地，在高灵敏度模式下以长曝光时间进行拍摄，在低灵敏度模式下以短曝光时间进行拍摄，通过将这些图像组合来合成高动态范围的图像。

31、现有技术文献

32、专利文献

33、专利文献1：日本专利第6820907号

34、专利文献2：日本专利第4823522号

35、专利文献3：日本专利第6286028号

36、专利文献4：日本专利第6093274号

37、专利文献5：美国专利第10902593号

技术实现思路

1、发明所要解决的课题

2、专利文献2～专利文献5所示的通过组合高灵敏度模式和低灵敏度模式来兼顾高灵敏度和高动态范围的方法在测量对象为单一的荧光体(g＝1)的情况下发挥功能。或者，在即使测量对象为多个荧光体(g≥2)但不需要识别它们的情况下，本方法也发挥功能。但是，如以下所示，通过本发明人等的详细研究而明确了在测量对象为多个荧光体(g≥2)并识别它们进行分析的情况下，不发挥功能。

3、作为最简单的例子，设想以下情况。e＝1，将1根毛细管作为测量对象。f＝2，用两个区间w(1)和区间w(2)测量从毛细管上的发光点发出的荧光的波长分散像，进行2色检测。g＝2，测量对象为荧光体d(1)和荧光体d(2)。由于荧光体d(1)和荧光体d(2)的荧光光谱的不同，荧光体d(1)的发光荧光在区间w(1)和区间w(2)中被测量为3：2，荧光体d(2)的发光荧光在区间w(1)和区间w(2)中被测量为2：3。在高灵敏度模式下，能够测量区间w(1)的荧光强度和区间w(2)的荧光强度分别为10～100的范围，在低灵敏度模式下，能够测量区间w(1)的荧光强度和区间w(2)的荧光强度分别为100～1000的范围。低灵敏度模式通过将高灵敏度模式的曝光时间设为1/10倍来实现。在此，荧光强度均为任意单位。但是，为了使高灵敏度模式下的测量结果与低灵敏度模式下的测量结果一致，将低灵敏度模式下的测量信号在计算机上设为10倍。此时，高灵敏度模式和低灵敏度模式各自的动态范围不过是1位(10～100和100～1000)，但通过组合这些模式，能够期待在维持灵敏度(检测下限＝10)的同时将动态范围扩大到2位(10～1000)。

4、首先，在荧光体d(1)的发光荧光强度为50、荧光体d(2)的发光荧光强度为0时，在高灵敏度模式下，区间w(1)的测量荧光强度为30，区间w(2)的测量荧光强度为20，在低灵敏度模式下，区间w(1)的测量荧光强度为0，区间w(2)的测量荧光强度为0。此时，通过实施颜色转换，荧光体d(1)在高灵敏度模式下被测量为发光荧光强度50，但在低灵敏度模式下由于是检测下限以下所以不被测量(被测量为发光荧光强度0)。当然，荧光体d(2)的发光荧光在任一模式下都不被测量(被测量为发光荧光强度0)。

5、接着，在荧光体d(1)的发光荧光强度为500、荧光体d(2)的发光荧光强度为0时，在高灵敏度模式下，区间w(1)和区间w(2)的测量荧光强度均为饱和，在低灵敏度模式下，区间w(1)的测量荧光强度为300，区间w(2)的测量荧光强度为200。此时，荧光体d(1)在高灵敏度模式下由于区间w(1)与区间w(2)饱和而无法测量(发光荧光强度不明)，但通过实施颜色转换，在低灵敏度模式下测量为发光荧光强度500。荧光体d(2)在高灵敏度模式下由于区间w(1)与区间w(2)饱和而无法测量(发光荧光强度不明)，在低灵敏度模式下不被测量(测量为发光荧光强度0)。

6、与此相对，在荧光体d(1)的发光荧光强度为500、荧光体d(2)的发光荧光强度为50时，在高灵敏度模式下，区间w(1)和区间w(2)的测量荧光强度均为饱和，在低灵敏度模式下，区间w(1)的测量荧光强度为300，区间w(2)的测量荧光强度为200。此时，荧光体d(1)在高灵敏度模式下由于区间w(1)与区间w(2)饱和而无法测量(发光荧光强度不明)，但通过实施颜色转换，在低灵敏度模式下测量为发光荧光强度500。荧光体d(2)在高灵敏度模式下由于区间w(1)与区间w(2)饱和而无法测量(发光荧光强度不明)，在低灵敏度模式下不被测量(测量为发光荧光强度0)。

7、如上所述，在荧光体d(1)的发光荧光强度为500时，在荧光体d(2)的发光荧光强度为0的情况和50的情况下成为相同的测量结果，无法识别两者。通常，在荧光体d(1)的发光荧光强度为100～1000时，若荧光体d(2)的发光荧光强度为10～100，则无法测量荧光体d(2)。同样地，在荧光体d(2)的发光荧光强度为100～1000时，若荧光体d(1)的发光荧光强度为10～100，则无法测量荧光体d(1)。即，在测量对象仅为荧光体d(1)或荧光体d(2)中的任一方的情况下，能够测量发光荧光强度10～1000，但在测量对象为荧光体d(1)和荧光体d(2)的情况下，只能测量发光荧光强度100～1000(或发光荧光强度10～100)。因此，通过组合专利文献2～专利文献5所示的高灵敏度模式和低灵敏度模式，兼顾高灵敏度和高动态范围的方法在测量对象为单一的荧光体(g＝1)的情况下发挥功能，但在测量对象为多个荧光体(g≥2)并识别它们进行分析的情况下不发挥功能。

8、另一方面，在搭载于智能手机的数码相机的hdr的情况下，多种多样的发光体、吸光体及散射体成为测量对象，因此能够成为g≥2的状态。但是，通常不会识别并分析这些测量对象。例如，在用数码相机拍摄容纳有黄色的车的风景的情况下，识别为黄色的光入射到图像传感器上的车的像的位置的像素，车的颜色为黄色。但是，不会分解该黄色的光来自怎样的发光体、吸收体、散射体的组合并测量各自的构成比率。例如，不会识别黄色光是合成红色光和绿色光而得的光还是纯粹的黄色光。即，在搭载于数码相机的hdr的情况下，虽然能够成为g≥2的状态，但由于不识别并分析多个测量对象，因此动态范围的扩大不会受到阻碍。

9、因此，在本公开中，提出在以dna分析用毛细管电泳装置为首，使用单个或多个毛细管进行电泳，通过图像传感器或线传感器分别识别多种荧光体所发出的荧光、多种散射体所散射的散射光或多种吸收体所吸收的吸光并进行测量的分析方法和分析装置中，兼顾高灵敏度和高动态范围的方法。提出不是如专利文献2～专利文献5那样组合高灵敏度模式和低灵敏度模式的方法，而是以单一模式实现的方法。

10、用于解决课题的手段

11、具体而言，在本公开的多毛细管电泳装置中，将通过填充于毛细管的电泳分离介质的组成、样品的组成、激光束的波长以及强度、多色检测光学系统的构成、曝光时间、区间的设定、图像传感器的种类以及温度等的控制而测量的噪声的组成设定为预先决定的条件，使构成区间w(f)的像素数bm(f)以及区间w(f)所包含的软合并的像素数bs(f)分别收敛在预先确定的最佳范围内，由此能够兼顾高灵敏度和高动态范围。

12、根据本说明书的描述、附图，明确了与本公开相关联的进一步的特征。另外，本公开的方式通过要素、多种要素的组合以及以后的详细记述和附加的技术方案的方式来实现。本说明书的记述只不过是典型的例示，在任何意义上并不限定本公开的技术方案或应用例。

13、发明效果

14、根据本公开，在以dna分析用毛细管电泳装置为首，使用单个或多个毛细管进行电泳，通过图像传感器或线传感器分别识别多种荧光体所发出的荧光、多种散射体所散射的散射光或多种吸收体所吸收的吸光并进行测量的分析方法及分析装置中，能够兼顾高灵敏度和高动态范围。由此，能够在不进行浓度调整的情况下对广泛的浓度范围的样品进行分析。或者，能够对包含浓度大不相同的多个成分的样品进行分析。

15、上述以外的课题、结构以及效果通过以下的实施方式的说明而明确。