用于诊断帕金森病的生物标志物R1及其应用的制作方法

用于诊断帕金森病的生物标志物r1及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于诊断帕金森病的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.帕金森病（parkinson's disease，pd）是一种中老年人常见的神经多系统变性疾病，65岁以上发病率为1.7%，目前约有200万帕金森病患者，每年新增患者约10万，其症状表现为起步缓慢、走路拖步、手抖、表情呆滞、说话吃力、腰痛、全身乏力、肌无力、流口水、颈椎痛等症状，严重者生活不能自理，甚至出现如肺炎、泌尿系统感染等可能会威胁到生命的并发症。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺（dopamine，da）能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体多巴胺含量显著性减少而致病。目前导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与帕金森病多巴胺能神经元的变性死亡过程。帕金森病由于发病隐匿，早期不易被发现，加上大众对早期帕金森病认知较低，目前因帕金森病就诊率也低，即使确诊，但很多已经是中晚期了。同时，帕金森病是目前为数不多的经治疗症状可改善的神经变性疾病，越早诊断，越早治疗，症状改善效果越好，患者及家庭获益越多。因此，早期筛查是有效治疗帕金森病至关重要的手段。
3.临床上诊断帕金森病主要依赖患者的症状，尤其是运动症状，如静止性震颤、肌强直、运动迟缓以及姿势步态障碍等，因这类特征性表现也可出现在其他神经变性疾病中，所以会对帕金森病的诊断产生干扰。而常规血、脑脊液检查多为无异常，脑电子计算机断层扫描（computed tomography，ct）及磁共振成像（magnetic resonance imaging，mri）检查一般也无特征性改变。目前有研究表明，采用正电子发射断层扫描（positron emission tomography，pet）或单光子发射计算机断层成像（single photon emission computerized tomography，spect）与特定的放射性核素检测，如18氟-左旋多巴（18f-fluorodopa）等，可获得有关多巴胺受体的密度及亲和力的信息，并发现帕金森病患者脑内多巴胺代谢功能明显降低，以此能够有效判别出帕金森病。然而这类设备造价昂贵，对操作人员要求较高，因此尚未广泛用于临床实践中。
4.代谢组学是一种新兴的组学技术，在生物学研究中发挥着越来越重要的作用，因为它能够揭示机体细胞代谢的独特化学指纹特征。代谢组学作为一种无偏的小分子代谢物研究方法，为发现更多的帕金森病的生物标志物提供了希望。越来越多的证据表明神经系统疾病，伴随着胆汁酸，脂肪酸和氨基酸的紊乱。并且这些结果证明代谢紊乱可能预示着帕金森病的发生。
5.如何寻找一种易于检测的生物标志物，来预测和诊断帕金森病是亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提供诊断帕金森病的生物标志物在检测试剂中的
应用。
7.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：生物标志物灵芝酸x结合神经酰胺(d18:1/24:0) 和/或吡喃花青素a在制备诊断帕金森病的检测试剂中的应用。
8.如上所述的生物标志物，优选地，还包括牛磺酸、神经酰胺(d18:0/24:1)、1-a,24r,25-三羟基维生素d2或羊毛甾烯四醇c。
9.灵芝酸x结合神经酰胺(d18:1/24:0) 和/或吡喃花青素a在制备诊断帕金森病的试剂中的应用，其是将灵芝酸x结合神经酰胺(d18:1/24:0)在制备诊断帕金森病的试剂中的应用，其是将灵芝酸x结合神经酰胺(d18:1/24:0)，与吡喃花青素a或牛磺酸中的任一种来判断是否存在帕金森病的风险；或是将灵芝酸x结合吡喃花青素a，与牛磺酸、1-a,24r,25-三羟基维生素d2或羊毛甾烯四醇c中的任一种来判断是否存在帕金森病的风险。
10.如上所述的应用，优选地，灵芝酸x的含量记为r1，神经酰胺(d18:1/24:0)的含量记为r2，吡喃花青素a的含量记为r3，根据公式tc=-0.5875-3.666
×
10-2
×
r1+2.611
×
10-3
×
r2-1.571
×
10-2
×
r3计算tc值，若tc≥0.605，则判定为帕金森病；若tc＜0.605，则为正常。
11.如上所述的应用，优选地，灵芝酸x的含量记为r1，神经酰胺(d18:1/24:0)的含量记为r2，神经酰胺(d18:0/24:1)的含量记为r5，根据公式tc=-10.10-2.646
×
10-2
×
r1+6.752
×
10-4
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r2-1.070
×
10-4
×
r5计算tc值，若tc≥0.789，则判定为帕金森病；若tc＜0.789，则为正常。
12.如上所述的应用，优选地，灵芝酸x的含量记为r1，吡喃花青素a的含量记为r3，牛磺酸的含量记为r4，根据公式tc=3.7270438
ꢀ‑
6.9837
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10-3
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r1-6.877
×
10-4
×
r3+7.090
×
10-4
×
r4计算tc值，若tc≥0.152，则判定为帕金森病；若tc＜0.152，则为正常。
13.如上所述的应用，优选地，灵芝酸x的含量记为r1，吡喃花青素a的含量记为r3，1-a,24r,25-三羟基维生素d2的含量记为r6，根据公式tc=11.9362010-5.8935
×
10-3
×
r1-8.764
×
10-4
×
r3-3.550
×
10-4
×
r6计算tc值，若tc≥0.079，则判定为帕金森病；若tc＜0.079，则为正常。
14.如上所述的应用，优选地，灵芝酸x的含量记为r1，吡喃花青素a的含量记为r3，羊毛甾烯四醇c的含量记为r7，根据公式tc=8.8840774-5.2368
×
10-3
×
r1-7.956
×
10-4
×
r3-9.411
×
10-4
×
r7计算tc值，若tc≥0.329，则判定为帕金森病；若tc＜0.329，则为正常。
15.本发明的有益效果在于：本发明提供了新型生物标志物灵芝酸x及判别帕金森病的模型，可用于早期发现、诊断和预测帕金森病的检测试剂盒应用。
16.本发明提供的用于诊断帕金森病的生物标志物为包括灵芝酸x和神经酰胺(d18:1/24:0)、吡喃花青素a、牛磺酸、神经酰胺(d18:0/24:1)、1-a,24r,25-三羟基维生素d2或羊毛甾烯四醇c中的任意两项结合，根据检测灵芝酸x的含量，结合神经酰胺(d18:1/24:0)、吡喃花青素a、牛磺酸、神经酰胺(d18:0/24:1)、1-a,24r,25-三羟基维生素d2或羊毛甾烯四醇c中的任两项在血液中的含量，根据tc值预测患帕金森病的风险，有助于诊断是否存在帕金森病的倾向，可用于提前预防。
附图说明
17.图1为正离子模式下vip＞1的样本；图2为负离子模式下vip＞1的样本；图3为正离子模式下(o)pls-da的得分图；图4为负离子模式下(o)pls-da的得分图；图5 为正离子模式下s-plot图；图6 为负离子模式下s-plot图；图7为基于逻辑回归模型的roc曲线（变量为r1+r2+r3）；图8 为基于逻辑回归模型的roc曲线（变量为r1+r2+r5）；图9 为基于逻辑回归模型的roc曲线（变量为r1+r3+r4）；图10为基于逻辑回归模型的roc曲线（变量为r1+r3+r6）；图11为基于逻辑回归模型的roc曲线（变量为r1+r3+r7）。
具体实施方式
18.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
19.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明中所用试剂均为分析纯或以上规格。
20.实施例11. 模型建立样本群102 人（内部人群）对照人群52人：男女比例：1：1，年龄范围：45以上；符合国际广泛应用的英国帕金森协会脑库临床诊断标准，诊断无帕金森综合征。
21.患者人群50人：男女比例：1：1，年龄范围：45以上；符合国际广泛应用的英国帕金森协会脑库临床诊断标准，确诊为帕金森综合征。
22.2.所用实验仪器及试剂(1)冷冻离心机：d3024r，scilogex公司，美国；(2)漩涡振荡器：mx-s，scilogex公司，美国；(3)高分辨质谱仪：esi-qtof/ms， xevo g2-s q-tof，厂家：waters， manchester，uk；(4)超高效液相色谱：uplc，acquity uplc i-class系统；厂家：waters，manchester， uk；(5)数据采集软件：masslynx4.1，厂家：waters；(6)分析鉴定软件：progenesis qi，厂家：waters。
23.试剂：异丙醇、乙腈、甲酸、甲酸氨、亮氨酸脑啡肽、甲酸钠，厂家均为fisher。
24.3.实验方法1）样品处理收集的上述人群的血清样本在冰上解冻，200μl的血清用600μl的预冷异丙醇萃取，用漩涡振荡器涡流1min，室温孵育10min，然后将萃取混合物在-20
◦
c下储存过夜，在冷
冻离心机进行4000r离心20min后，将上清液转移到新的离心管，用体积比为2：1：1的异丙醇/乙腈/水的混合物稀释至1：10。样品在lc-ms分析前保存在-80℃冰箱中。此外，还将每个萃取混合物的10μl组合在一起制备混合血清样品。
25.2）脂质组学的超高效液相色谱-质谱联用方法样品用acquity uplc连接到带有esi的xevo-g2xs高分辨飞行时间 (qtof)质谱仪进行分析。采用cquity uplc beh c18色谱柱(2.1
×
10 0 mm，1.7μm，waters)，流动相中a相是10 mm甲酸铵-0.1%甲酸的乙腈溶液（配置方法：称取甲酸铵0.63 g，甲酸10 g，用乙腈-水溶液（乙腈：水为60：40，v/v）溶解并定容至1000ml）；b相是10 mm甲酸铵-0.1%甲酸-异丙醇-乙腈溶液(配置方法：称取甲酸铵0.63 g，甲酸10 g，用异丙醇-乙腈溶液（异丙醇：乙腈为90：10，v/v）溶解并定容至1000ml)。在大规模研究之前，进行了包括10分钟、15分钟和20分钟洗脱期的中试实验，以评估流动相组成和流速对脂质保留时间的潜在影响。在pim中，丰富的脂质前体离子和碎片以相同的顺序分离，具有相似的峰形和离子强度。此外，具有10分钟洗脱期的混合qc样品，也表现出与测试样品相似的前体和碎片的基峰强度。流动相流速为0.4ml/min。该柱最初用40%b洗脱，然后在2分钟内线性梯度到43%b，然后在0.1min内将b的百分比增加到50%。在接下来的3.9分钟内，梯度进一步增加到54%b，然后b的量0.1分钟内增加到70%。在梯度的最后部分，b的量在1.9分钟内增加到99%。最后，溶液b在0.1分钟内返回到40%，并且在下一次进样之前将色谱柱平衡1.9分钟。每次进样量为5μl，用xevo-g2xs型qtof质谱仪检测正负两种模式下的脂质，采集范围为 m/z50~1200年，采集时间为0.2s/次。离子源温度为120℃，去溶温度为600℃，气体流量为1000l/h，以氮气为流动气体。毛细管电压为2.0kv(+)/锥体电压为1.5kv(-)，锥体电压为30v。以亮氨酸脑啡肽进行标准质量测定，用甲酸钠溶液进行校正。样品被随机排序。每10个样本注入一个qc样本并进行分析，以调查数据的重复性。
26.4. 结果分析（1）利用多元统计学寻找血清差异物质使用progenesis qi将质谱数据转化为可供统计的数据形式，正交偏最小二乘判别分析（opls-da）结合了正交信号矫正（osc）和 pls-da（偏最小而成判别分析） 方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。如图1 、图2vip值为pls-da第一主成分的变量重要性投影，通常以vip》1为代谢组学常用评判标准，作为差异代谢物筛选的标准之一；图3、图4为帕金森病组和对照组两个分组中的第一主成分和第二主成分通过降维的方式所得的得分图，横坐标表示组间差异，纵坐标表示组内差异，且两组结果分离较好。图5、图6为s-plot图，横坐标表示主成分与代谢物的协相关系数，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，同时满足p《0.05，vip》1的条件下，正离子模式有144个差异物，负离子模式有70个差异物。
27.（2）约登（youden）指数分析为了进一步缩小范围，将vip阈值提高到2，同时体现正常和患者之间的倍数差异在0.5倍以下，或者增加1.5倍以上，p值小于0.01，最终得到以下13个化合物，化合物具体见表1。
28.然后对他们进行约登指数计算，用来反映单个指标对整体的诊断和预测效果，单个代谢物预测帕金森病的曲线下面积（auc）、特异性和敏感度结果如表1。
29.表1帕金森病相关代谢物的约登指数分析
编号化合物名称中文名称auc值敏感性特异性r1ganodericacidx灵芝酸x0.9360.8080.896r2ceramide(d18:1/24:0)神经酰胺(d18:1/24:0)0.6820.6120.885r3pyranocyanina吡喃花青素a0.9120.9230.776r4taurine牛磺酸0.6180.5070.981r5cer(d18:0/24:1)神经酰胺(d18:0/24:1)0.8760.9390.731r61-a,24r,25-trihydroxyvitamind21-a，24r，25-三羟基维生素d20.7760.7310.755r7fasciculolc羊毛甾烯四醇c0.7600.7120.816r8ganoderiolc灵芝醇c0.8680.7880.836r9oleamide油酰胺0.7850.5380.910r10lysopc(22:6)溶血磷脂酰胆碱(22:6)0.5980.4180.885r11gamma-glutamylserineγ-谷氨酰丝氨酸0.7650.8080.627r12ginsenoynel人参炔l0.8340.6540.866r13avenoleicacid燕麦酸0.7990.9040.582
表1列出来单个代谢物预测帕金森病的曲线下面积（auc）、敏感度和特异性，相关参数显示以上13种脂质中，r1（灵芝酸x）和r3（吡喃花青素a）的预测能力最好，其auc值分别为0.936和0.912。
30.5. 内部人群七折交叉验证结果为提高种变量化合物的生物诊断效果，需要根据上述生物标志物找出适合的模型进行行下一步的分析。
31.将内部人群随机分为7份，选择1份为验证集，其他为训练集，如此反复七次，考察最佳的变量组合。将其次的结果，包括auc，敏感度，特异性都取平均值，并进行统计学显著性计算，结果如下表2。
32.表2组合逻辑回归auc敏感性特异性r1+r2+r30.99111r1+r2+r50.97411r1+r3+r40.9711r1+r3+r60.97311r1+r3+r70.98111组合之间，auc值并没有显著性p《0.05差异。
33.基于上述建立逻辑回归模型a、b、c、d、e如下："模型a" 变量为上述r1+r2+r3，按公式为tc=-0.5875-3.666
×
10-2
×
r1+2.611
×
10-3
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r2-1.571
×
10-2
×
r3，公式中r1为灵芝酸x的含量，r2为神经酰胺(d18:1/24:0) 的含量，r3为吡喃花青素a的含量，根据计算获得的tc值预测帕金森病的风险：若tc≥0.605，则判定为帕金森病；若tc＜0.605，则为正常。
34."模型b"变量为r1+r2+r5，按公式为tc=-10.10-2.646
×
10-2
×
r1+6.752
×
10-4
×
r2-1.070
×
10-4
×
r5计算tc值，公式中r1为灵芝酸x的含量，r2为神经酰胺(d18:1/24:0) 的含量，r5为神经酰胺(d18:0/24:1)的含量，根据tc值预测帕金森病的风险：若tc≥0.789，则判定为帕金森病；若tc＜0.789，则为正常。
35."模型c"变量为r1+r3+r4，按公式为tc=3.7270438-6.9837
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10-3
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r1-6.877
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10
‑4×
r3+7.090
×
10-4
×
r4计算tc值，公式中r1为灵芝酸x的含量，r3为吡喃花青素a的含量，r4为牛磺酸的含量，根据tc值预测帕金森病的风险：若tc≥0.152，则判定为帕金森病；若tc＜0.152，则为正常。
36."模型d"变量为r1+r3+r6，按公式tc=11.9362010-5.8935
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10-3
×
r1-8.764
×
10-4
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r3-3.550
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10-4
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r6来计算tc值，公式中r1为灵芝酸x的含量，r3为吡喃花青素a的含量，r6为1-a,24r,25-三羟基维生素d2的含量，根据tc值预测帕金森病的风险：若tc≥0.079，则判定为帕金森病；若tc＜0.079，则为正常。
37."模型e"变量为r1+r3+r7，按公式tc=8.8840774-5.2368
×
10-3
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r1-7.956
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10-4
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r3-9.411
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10-4
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r7来计算tc值，公式中r1为灵芝酸x的含量，r3为吡喃花青素a的含量，r7为羊毛甾烯四醇c的含量，根据tc值预测帕金森病的风险：若tc≥0.329，则判定为帕金森病；若tc＜0.329，则为正常。
38.实施例2模型验证样本群体76人（外部人群）对实施例1中建立的逻辑回归模型进行验证，其中，对照人群28人：男女比例：1：1，年龄范围：45以上；符合国际广泛应用的英国帕金森协会脑库临床诊断标准，诊断无帕金森综合征。
39.患者人群48人：男女比例：1：1，年龄范围：45以上；符合国际广泛应用的英国帕金森协会脑库临床诊断标准，确诊为帕金森综合征。
40.按实施例1中的方法测得r1、r2、r3、r4、r5、r6 、r7的含量，以验证实施例1中模型结果的准确性，并绘制相应的roc曲线图，结果如下："模型a" 变量为r1+r2+r3，roc曲线图结果如图7所示，sensitivity （敏感性）=1，specificity （特异性）=1，accuracy （准确度）=1。
41."模型b" 变量为r1+r2+r5，roc曲线图结果如图8所示，sensitivity （敏感性）=1，specificity （特异性）=1，accuracy（准确度） =1。
42."模型c" 变量为r1+r3+r4，roc曲线图结果如图9所示，sensitivity （敏感性）=1，specificity （特异性）=1，accuracy（准确度） =1。
43."模型d" 变量为r1+r3+r6，roc曲线图结果如图10所示，sensitivity （敏感性）=1，specificity （特异性）=1，accuracy（准确度） =1。
44."模型e" 变量为r1+r3+r7，roc曲线图结果如图10所示，sensitivity （敏感性）=1，specificity （特异性）=1，accuracy（准确度） =1。
45.数据显示：上述五种化合物组合，1. 灵芝酸x、神经酰胺(d18:1/24:0)与吡喃花青素a； 2. 灵芝酸x、吡喃花青素a与牛磺酸；3. 灵芝酸x、吡喃花青素a与神经酰胺(d18:0/24:1)；4. 灵芝酸x、吡喃花青素a与1-a,24r,25-三羟基维生素d2；以及5. 灵芝酸x、吡喃花青素a与羊毛甾烯四醇c，都表现出非常高的诊断能力，未来都能进行临床试剂盒的应用。
46.通过对样本信息的对比分析可知：以上13种生物标记物，与正常组相比，编号为r1、r3、r6、r7、r8、r9、r13、r11和r12的化合物在帕金森病组均呈下降趋势，编号为r2、r4、r5和r10的化合物则相反。由此可见，采用上述方法处理患者血清样本并进行检测，所测得数据代入上述模型中，利用逻辑回归模型判断患帕金森病组的风险。