固相萃取柱及其应用的制作方法

1.本发明涉及环境污染物化学检测分析技术领域，具体涉及一种固相萃取柱及其应用。


背景技术：

2.多环芳烃(pahs)是化石能源及其他有机物在热裂解和不完全燃烧过程中释放出来的一类化合物的总称。由于其具有高生物活性、持久性、脂溶性等特点，且可通过食物进入人体，对人类的健康造成害，而被列入典型持久性有机污染物(pops)。pahs进入哺乳动物细胞经代谢活化后生成有毒的中间产物，这些产物都将不可逆地损伤细胞的大分子物质(dna、蛋白质、脂质等)，对人体健康产生一定的危害，通常所说的具有显著致畸、致癌、致突变作用的pahs包括萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、屈、苯并[a]蒽、苯并[b] 荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝。
[0003]
环境或生物样品中的多环芳烃含量通常很低，称为痕量物质，其检测通常需要高提取率和高回收率的前处理方法和准确性的定性定量检测方法。对于多环芳烃的分离和检测，传统上采用纸层析和薄层析等技术分离pahs，再联合uv-vis和荧光等进行检测。随着高效液相色谱、气相色谱、质谱等技术日趋成熟，现阶段分离和检测多环芳烃比较常用的方法包括hplc[、gc、lc-ms和gc-ms等。即使采用现代化的分析仪器，对成分比较复杂的生物样品的预处理，现常用的传统和现代方法均存在一些缺陷和不足，比如说操作繁琐、试剂消耗过大以及耗时较长、准确性灵敏度低等，仍不能满足常规监控要求的简便、快捷、高效、准确等要求。


技术实现要素：

[0004]
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种固相萃取柱，显著改善空气、土壤、水、血液(静脉血、脐带血)、尿液等样品中多环芳烃的萃取和净化效果，提高分析的灵敏度。
[0005]
同时，本发明的另一个目的是提供本发明固相萃取柱在提取分离多环芳烃类物质方面的应用，利用超声波快速提取技术对样品进行前处理后，再经过本发明固相萃取柱净化，最后再对多环芳烃进行定性和定量分析，提高检测准确性和灵敏度，可作为潜在的不同样品中多环芳烃标准检测方法。
[0006]
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007]
一种固相萃取柱，由以下填料填装制备而成：hlb、弗洛里西硅土(音译自florisil) 和无水硫酸钠。
[0008]
上述hlb填料是一类强疏水性且具有良好水可浸润性的聚合物吸附剂，以坚硬的聚苯乙烯类分子为基质，例如基质为n-乙烯吡咯烷酮与二乙烯基苯按比例聚合而成。
[0009]
可选的，其中hlb、弗洛里西硅土和无水硫酸钠的质量配比为2：2：1。可选的，所述hlb购自品牌:copure(货号hlb-1-50，50g/瓶，含量≥:100(％)，材质:颗粒状粉末)。
[0010]
可选的，上述固相萃取柱由hlb、弗洛里西硅土和无水硫酸钠依次湿法填充至空柱中制备而成。
[0011]
进一步的，上述固相萃取柱，由以下制备方法制备而成：在内径20mm的一次性空柱中湿法填充法依次加入200mg hlb、200mg弗洛里西硅土、100mg无水硫酸钠，压实后待活化。需要解释的是，在填料种类确定的条件下，本领域技术人员能够基于上述内径和各填料质量及质量配比的限定根据实际的萃取柱尺寸等同调整各填料的质量用量，该调整的质量用量属于基于本发明的技术构思利用本领域的普遍技术常识的等同调整，均在本发明保护范围内。
[0012]
作为优选的，在一些实施例中，上述固相萃取柱的具体制备方法包括于3个10ml离心管中分别称取200mg hlb、200mg弗洛里西硅土、100mg无水硫酸钠作为悬浮介质，每管加入2ml处理过的无水正己烷作分散相后超声处理20分钟，使微粒在介质中高度分散并呈悬浮状，然后在高压下依次把匀浆压入10ml的一次性空柱中，制成具有均匀紧密填充床的固相萃取柱。
[0013]
本发明固相萃取柱，采用hlb、弗洛里西硅土和无水硫酸钠复合填料，结合待净化的样品中包含的16种多环芳烃的化学结构特征，利用不同填料的比表面积、极性、吸附量等填料性质，相互之间发挥协同增效作用，提高对样品中16种多环芳烃的净化回收率，提高检测灵敏度和准确性，为多环芳烃的检测提供标准化的方法。
[0014]
一种多环芳烃检测方法，依次包括采样、预萃取、净化萃取、定量和/或定性检测；其中通过预萃取和净化萃取提取出样本中的多环芳烃，净化萃取为采用上述固相萃取柱进行净化萃取。
[0015]
可选的，所述净化萃取的具体操作步骤包括：用超纯水预淋洗固相萃取柱，再用洗脱液活化萃取柱，然后将预萃取后的样品注入固相萃取柱中，用超纯水淋洗固相萃取柱，并弃去流出的馏分，再用洗脱液洗脱并收集馏分，备用。
[0016]
可选的，所述洗脱液为正己烷和二氯甲烷1：1的混合液；洗脱流速为2ml/min。
[0017]
可选的，所述样本为血液样本；所述预萃取的具体步骤包括在血液样本中加入naoh
‑ꢀ
乙醇水溶液，超声处理后，加入萃取剂，液液萃取后收集有机相，重复上述操作2次，合并有机相，浓缩近干后加入溶剂复溶，备用；所述萃取剂为正己烷与乙醚按照体积比9：1 的混合液。进一步可选的，乙醇水溶液为90％乙醇含量的水溶液；超声处理为在60℃水浴下超声30min；采用摇床的方式液液萃取15min。
[0018]
可选的，所述样本为尿液样本或水质样本；所述预萃取的具体步骤包括在血液样本中加入萃取剂，液液萃取后收集有机相，重复上述操作2次，合并有机相，浓缩近干后加入溶剂复溶，备用；所述萃取剂为正己烷与乙醚按照体积比9：1的混合液。进一步可选的，采用摇床的方式液液萃取15min。
[0019]
可选的，所述样本为空气样本；所述预萃取的具体步骤包括取空气样本采样滤膜，剪碎后放入容器中，加入萃取剂，超声萃取30～60min后，浓缩经干后加入溶剂复溶，备用；
[0020]
或者所述样本为土壤样本；所述预萃取的具体步骤包括取土壤样本加入容器中，加入萃取剂，依次涡旋提取1min和超声提取15min后，离心取上清液，再重复上述操作2次，合并提取液，浓缩近干后加入溶剂复溶，备用；其中萃取剂为正己烷与乙醚9：1的混合液。
[0021]
可选的，上述复溶用溶剂为正己烷。
[0022]
可选的，本发明的一些实施例中采用高效液相色谱进行定性和定量检测，应当可以理解的是也可以采用液相色谱-质谱联用仪、气相色谱-质谱联用仪进行定性和定量检测。
[0023]
进一步可选的，液相色谱条件为：色谱柱：supelcosil pah，250mm
×
4.6mm，5μm；流动相为水和乙腈；流动相流量为1.5ml/min；柱温为30℃；梯度洗脱程序设定为：65％乙腈+35％水，保持27min，以5％乙腈/min的增量至100％乙腈，直至出峰完毕。
[0024]
本发明根据16种具有显著致畸、致癌、致突变作用的pahs的化合物特征和不同环境样品、血液样品等样品特点，建立了能够处理不同环境样品和生物样品的16种多环芳烃的检测方法，尤其是样品中多环芳烃的提取和净化处理方法。以正己烷/乙醚为提取剂，采用超声提取方式，简化了提取过程，提高了检测效率；hlb、弗洛里西硅土、无水硫酸钠复合固相萃取柱的应用，能够适用于各种环境样品、生物样品，净化了成分中的杂质，同时保证了较高的回收率。本发明方法方便、快捷、灵敏度高，适用于不同样品中pahs的含量分析，为开展pahs检测研究工作提供了良好方法基础。
附图说明
[0025]
附图1为试验例1中不同萃取剂的提取效率对比图；
[0026]
附图2为试验例2中不同固相萃取柱净化回收率对比图。
具体实施方式
[0027]
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下面所述填料hlb均购自品牌:copure(货号hlb-1-50，50g/瓶，含量≥:100(％)，材质:颗粒状粉末)，弗洛里西硅土均指市售的florisil硅酸镁吸附剂。
[0028]
实施例1
[0029]
本实施例提供一种固相萃取柱，由hlb、弗洛里西硅土和无水硫酸钠作为复合填料制备而成：
[0030]
其具体制备方法为：
[0031]
于3个10ml离心管中分别称取200mg聚苯乙烯二乙烯基苯吡咯烷酮hlb、200mg弗洛里西硅土、100mg无水硫酸钠作为悬浮介质，每管加入2ml处理过的无水正己烷作分散相后超声处理20分钟，使微粒在介质中高度分散并呈悬浮状，然后在高压下依次把聚苯乙烯二乙烯基苯吡咯烷酮hlb、弗洛里西硅土和无水硫酸钠匀浆压入10ml柱管中，制成具有均匀紧密填充床的固相萃取柱。
[0032]
实施例2
[0033]
本实施例提供一种多环芳烃检测用标准溶液，其配制方法包括：用正己烷/丙酮(1∶1) 混合溶液将16种pahs配制成浓度为10mg/l的混合标准储备液，于-20℃下，保存使用时，用乙腈逐级稀释成如表1的混合标准工作溶液。制备标准系列溶液时选用了0.0、0.05、0.1、 0.5、1.0、2.0、5.0μg/ml七个浓度，绘制标准曲线的线性相关系数均≥0.999。
[0034]
表1 16种pahs混标工作溶液基本信息表
[0035][0036][0037]
实施例3
[0038]
本实施例提供一种血液样品中多环芳烃检测方法，具体操作步骤包括：
[0039]
1、样品前处理：
[0040]
1)提取：取2ml血液于15ml离心管中，加入4m l0.4mol/lnaoh-乙醇水溶液(乙醇：水＝9：1)，置60℃下水浴超声30min后取出，向离心管中加入3ml萃取剂(体积比9：1 的正己烷/乙醚)(10％乙醚)混匀，置于摇床上液-液萃取15min；用带塞的离心管收集上层有机相，分别用3ml正己烷/乙醚(10％乙醚)重复上述实验2次(每次10min))并把收集到的有机相注入到第1次收集到的离心管中；混合后的有机相经旋转蒸发仪浓缩近干后，加入1ml正己烷，置冰箱保存；
[0041]
2)净化：用超纯水预淋洗实施例1提供的固相萃取柱(500mg，6ml)，再用10ml正己烷和二氯甲烷混合液(正己烷：二氯甲烷＝1:1)活化，然后把步骤1)提取处理后的所得的样品注入到固相萃取柱中，上样，调节压力调节器，使得流速不超过2ml/min；用10ml 超纯水淋洗吸附柱，最后用15ml混合液(正己烷：二氯甲烷)＝1:1)洗脱。把得到的提取液浓缩至1ml；高纯氮气下缓缓吹干，最后加入定量内标和回收率内标，用乙腈定容至500 μl待测；
[0042]
2、定性定量检测：
[0043]
样品前处理后的待测样采用高效液相色谱进行定性和定量检测，采用实施例2提供的标准溶液绘制浓度标准曲线，计算样品中检测到的多环芳烃的浓度含量；其中液相色
谱条件为：色谱柱:supelcosil pah，250mm
×
4.6mm，5μm；流动相为水和乙腈；流动相流量为1.5ml/min；柱温为30℃；梯度洗脱程序设定为：65％乙腈+35％水，保持27min，以 5％乙腈/min的增量至100％乙腈，直至出峰完毕。
[0044]
实施例4
[0045]
本实施例提供一种空气样品中多环芳烃检测方法，具体操作步骤包括：
[0046]
1、样品前处理：
[0047]
1)提取：取直径为90mm的采样滤膜约四分之一片，剪碎后放入10ml圆底比色管中，并向管中加入2.5ml萃取剂(体积比9：1的正己烷/乙醚)，封盖后水浴中超声30～60分钟后，待净化；
[0048]
2)净化：用超纯水预淋洗实施例1提供的固相萃取柱(500mg，6ml)，再用10ml正己烷和二氯甲烷混合液(正己烷：二氯甲烷)＝1:1)活化，然后把步骤1)提取处理后的所得的样品注入到固相萃取柱中，上样，调节压力调节器，使得流量不超过2ml/min；用10ml 超纯水淋洗吸附柱，最后用15ml混合液(正己烷：二氯甲烷)＝1:1)洗脱。把得到的提取液浓缩至1ml；高纯氮气下缓缓吹干，最后加入定量内标和回收率内标，用乙腈定容至500 μl待测；
[0049]
2、定性定量检测：
[0050]
样品前处理后的待测样采用高效液相色谱进行定性和定量检测，采用实施例2提供的标准溶液绘制浓度标准曲线，计算样品中检测到的多环芳烃的浓度含量；其中液相色谱条件为：色谱柱:supelcosil pah，250mm
×
4.6mm，5μm；流动相为水和乙腈；流动相流量为1.5ml/min；柱温为30℃；梯度洗脱程序设定为：65％乙腈+35％水，保持27min，以 5％乙腈/min的增量至100％乙腈，直至出峰完毕。
[0051]
实施例5
[0052]
本实施例提供一种土壤样品中多环芳烃检测方法，具体操作步骤包括：
[0053]
1、样品前处理：
[0054]
1)提取：取土壤样品10g(烘干，均质成粉末状)，加入到50ml离心管中，加入25ml 正己烷/乙醚(10％乙醚)，涡旋提取1min，超声15min；4000rpm离心6分钟，倾倒上清液到250ml圆底烧瓶中，再依次加15ml萃取剂(体积比9：1的正己烷/乙醚)，重复上述操作2次，合并提取液，旋蒸浓缩近干后，加入2ml正己烷溶解后待净化；
[0055]
2)净化：用超纯水预淋洗实施例1提供的固相萃取柱(500mg，6ml)，再用10ml正己烷和二氯甲烷混合液(正己烷：二氯甲烷)＝1:1)活化，然后把步骤1)提取处理后的所得的样品注入到固相萃取柱中，上样，调节压力调节器，使得流量不超过2ml/min；用10ml 超纯水淋洗吸附柱，最后用15ml混合液(正己烷：二氯甲烷)＝1:1)洗脱。把得到的提取液浓缩至1ml；高纯氮气下缓缓吹干，最后加入定量内标和回收率内标，用乙腈定容至500 μl待测；
[0056]
2、定性定量检测：
[0057]
样品前处理后的待测样采用高效液相色谱进行定性和定量检测，采用实施例2提供的标准溶液绘制浓度标准曲线，计算样品中检测到的多环芳烃的浓度含量；其中液相色谱条件为：色谱柱:supelcosil pah，250mm
×
4.6mm，5μm；流动相为水和乙腈；流动相流量为1.5ml/min；柱温为30℃；梯度洗脱程序设定为：65％乙腈+35％水，保持27min，以 5％乙腈/min的增量至100％乙腈，直至出峰完毕。
[0058]
实施例6
[0059]
本实施例提供一种尿液样品中多环芳烃检测方法，具体操作步骤包括：
[0060]
1、样品前处理：
[0061]
1)提取：取尿液样品10ml，加入到50ml离心管中，加入15ml萃取剂(体积比9： 1的正己烷/乙醚)，振摇5min，静置分层，收集有机相，放入250ml接收瓶中，重复萃取两遍，合并有机相，放置30min，旋蒸浓缩近干后，加入2ml正己烷溶解后待净化；
[0062]
2)净化：用超纯水预淋洗实施例1提供的固相萃取柱(500mg，6ml)，再用10ml正己烷和二氯甲烷混合液(正己烷：二氯甲烷)＝1:1)活化，然后把步骤1)提取处理后的所得的样品注入到固相萃取柱中，上样，调节压力调节器，使得流量不超过2ml/min；用10ml 超纯水淋洗吸附柱，最后用15ml混合液(正己烷：二氯甲烷)＝1:1)洗脱。把得到的提取液浓缩至1ml；高纯氮气下缓缓吹干，最后加入定量内标和回收率内标，用乙腈定容至500 μl待测；
[0063]
2、定性定量检测：
[0064]
样品前处理后的待测样采用高效液相色谱进行定性和定量检测，采用实施例2提供的标准溶液绘制浓度标准曲线，计算样品中检测到的多环芳烃的浓度含量；其中液相色谱条件为：色谱柱:supelcosil pah，250mm
×
4.6mm，5μm；流动相为水和乙腈；流动相流量为1.5ml/min；柱温为30℃；梯度洗脱程序设定为：65％乙腈+35％水，保持27min，以 5％乙腈/min的增量至100％乙腈，直至出峰完毕。
[0065]
实施例7
[0066]
本实施例提供一种水质样品中多环芳烃检测方法，具体操作步骤包括：
[0067]
1、样品前处理：
[0068]
1)提取：取水样品1l，加入到2l分液漏斗中，加入30gnacl溶解后，加入50ml萃取剂(体积比9：1的正己烷/乙醚)，振摇5min，静置分层，收集有机相，放入250ml接收瓶中，重复萃取两遍，合并有机相，放置30min，提取液旋蒸浓缩近干后，加入2ml正己烷溶解后待净化；
[0069]
2)净化：用超纯水预淋洗实施例1提供的固相萃取柱(500mg，6ml)，再用10ml正己烷和二氯甲烷混合液(正己烷：二氯甲烷)＝1:1)活化，然后把步骤1)提取处理后的所得的样品注入到固相萃取柱中，上样，调节压力调节器，使得流量不超过2ml/min；用10ml 超纯水淋洗吸附柱，最后用15ml混合液(正己烷：二氯甲烷)＝1:1)洗脱。把得到的提取液浓缩至1ml；高纯氮气下缓缓吹干，最后加入定量内标和回收率内标，用乙腈定容至500 μl待测；
[0070]
2、定性定量检测：
[0071]
样品前处理后的待测样采用高效液相色谱进行定性和定量检测，采用实施例2提供的标准溶液绘制浓度标准曲线，计算样品中检测到的多环芳烃的浓度含量；其中液相色谱条件为：色谱柱:supelcosil pah，250mm
×
4.6mm，5μm；流动相为水和乙腈；流动相流量为1.5ml/min；柱温为30℃；梯度洗脱程序设定为：65％乙腈+35％水，保持27min，以 5％乙腈/min的增量至100％乙腈，直至出峰完毕。
[0072]
上述实施例样品中多环芳烃定性和定量检测过程中标准样品检测和标准曲线绘制如下：
[0073]
线性范围和检出限：
[0074]
配制浓度为0.0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0μg/ml的系列标准溶液，优化仪器条件，开始进行分析。以各组分的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，测得16种pahs标准曲线的线性方程(表2)。各组分在线性范围内线性关系良好，相关系数达到0.9999。
[0075]
表2 16种pahs的线性范围、线性方程、相关系数
[0076][0077][0078]
效果对比平行试验1
[0079]
试验方法：
[0080]
1、实验样品制备：取空白的空气采样用滤膜，在滤膜上滴加实施例2提供的标准品溶液，准备a、b、c、d四组平行试验样品；
[0081]
2、数据检测：对萃取剂，a组采用乙腈作为萃取剂、b组采用正己烷作为萃取剂、c 组采用甲醇作为萃取剂、d组采用体积比9：1的正己烷/乙醚作为萃取剂，其他完全参照实施例4提供的检测方法及参数，对各组实验样品进行检测，并根据检测数据计算各组提取效率＝实际检测样品浓度/加标样品浓度。
[0082]
本试验中对比了乙腈、正己烷、甲醇、体积比9：1的正己烷/乙醚四种萃取剂的提取效果，如图1所示(图中编号1-16所指pah的具体名称依次如前面表1所列)，结果表明，以体积比9：1的正己烷/乙醚作为萃取剂对16种pahs均有较好的提取效率，且平行性较好，显著优于其他三种提取剂。
[0083]
效果平行对比试验2
[0084]
试验方法：
[0085]
1、实验样品制备：取空白的空气采样用滤膜，在滤膜上滴加实施例2提供的标准品溶液，准备a、b、c、d四组平行试验样品，每组设置未净化空白对照组；
[0086]
2、数据检测：a组样品采用本发明实施例1的固相萃取柱进行净化处理，b组样品采用 bond elut env进行净化处理、c组样品采用弗洛里西硅土进行净化处理、d组样品采用hlb 进行净化处理，其中每组采用的固相萃取柱的直径大小、填料总重量均相同，其他步骤按照实施例4提供的检测方法对各组实验样品进行检测，并根据检测数据计算各组净化回收率＝(实际检测样品浓度-样品本底浓度)/加标样品浓度，其中样品本底浓度为不进行净
化处理的样品检测浓度。
[0087]
本试验考察了本发明提供的hlb-弗洛里西硅土-无水硫酸钠复合固相萃取柱，bondelut env，弗罗里硅土，hlb四种固相萃取小柱对样品的净化效果，如图2所示(对1-16 每号pah，试验所用固相萃取柱，在图上从左到右依次为hlb、弗罗里硅土、bond elut env、本发明hlb-弗洛里西硅土-无水硫酸钠复合柱)，结果显示，本发明hlb-弗洛里西硅土
‑ꢀ
无水硫酸钠复合固相萃取柱净化，产生协同增效作用，各目标物的回收率都能达到90％以上，净化方法更加简便，消耗试剂量少，实验重复性好，同时能达到较好的回收效果。
[0088]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。