一种检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的SERS免疫层析试纸条及其应用

一种检测牛乳过敏原
α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种sers免疫层析试纸条，具体涉及一种检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条及其应用，属于食品安全检测技术领域。


背景技术：

2.牛奶是维生素(维生素a、维生素b6)和矿物质(钙)的摄入来源，是幼儿生长发育所必需的营养物质，对人体骨骼、头发、皮肤和牙齿起着关键作用，是婴儿最先食用的食物之一。然而，牛奶也是儿童早期食物过敏第一个也是最常出现的原因之一。过敏原引起的过敏性疾病有两个显著特点，一是始于婴幼儿期，且对食物的过敏终生不变；二是致敏剂量存在极大的人群差异。因此，有些牛乳过敏患者会因潜在的极少量牛奶而出现过敏反应。食物中的过敏原大都是蛋白质类物质，每100毫升牛乳约含有3克蛋白质，至少包含25种不同的蛋白质，所有这些蛋白质都有可能为过敏原，目前认为α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-la)是牛乳主要过敏原之一。
3.用于检测牛乳过敏原的方法主要包括免疫分析技术、液相色谱技术生物质谱技术、实时pcr、电喷雾电离质谱等，这些方法虽然灵敏度高，但需要较长的检测时间或者昂贵的仪器设备。
4.表面增强拉曼散射(sers)是以金属纳米结构介导的信号增强效应，相比普通拉曼光谱具有更高的分辨率和灵敏度，可实现高达10
–
14倍的单分子拉曼信号增强，且sers的特征拉曼光谱谱带窄，能够在复杂体系的多种干扰下为分析物提供丰富的结构信息。侧向层析免疫技术是一种抗原抗体在层析过程中发生高特异性、高亲和性的免疫反应，通过胶体金等可目测的标记物实现样品检测的技术。胶体金免疫层析技术已经被广泛应用到致病菌、蛋白质、农兽药残留等物质的检测。但是，胶体金试纸条主要通过肉眼观察结果，检测灵敏度不高，以定性和半定量检测为主。
5.因此，可考虑将sers与免疫层析技术结合起来，既具有免疫层析技术检测的即时、快速、简便、高特异性的优点，又克服胶体金需要大量聚集才能显色的缺点，提高检测灵敏度，同时建立检测物浓度与拉曼特征峰强度对应的线性关系，实现目标物α-乳白蛋白的快速高效和精确定量检测。


技术实现要素：

6.本发明针对传统胶体金试纸条检测灵敏度低、不能精确定量的问题，提供一种检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条，通过sers与免疫层析技术结合得到。
7.本发明还提供上述检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条在牛乳过敏原α-乳白蛋白于5
–
10min内定性检测和高灵敏度定量检测中的应用。
8.为实现发明目的，本发明采用的技术方案为：
9.本发明提供的一种检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条，依次包括
底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(nc膜)和吸水垫，所述nc膜上设有检测线(t线)和控制线(c线)，其中：
10.所述t线设置于靠近结合垫一端，其上固定有捕获抗体α-乳白蛋白鼠单抗；
11.所述c线设置于靠近吸附垫一端，其上固定有羊抗兔二抗；
12.所述结合垫上喷有sers探针，所述sers探针由银包金纳米粒子、拉曼信标分子和检测抗体α-乳白蛋白兔多抗偶联结合得到。
13.进一步，所述银包金纳米粒子的粒径为20-40nm，形状为球形，选自不同银壳层厚度的银包金纳米粒子中的一种；和/或所述拉曼信标分子为拉曼信标分子4-巯基苯甲酸(4-mba)。
14.进一步，所述拉曼信标分子与银包金纳米粒子先以共价方式偶联，再偶联到所述检测抗体α-乳白蛋白兔多抗上得到sers探针。
15.本发明还提供上述检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
16.(1)制备银包金纳米粒子；
17.(2)检测抗体α-乳白蛋白兔多抗与银包金纳米粒子、拉曼信标分子结合形成sers探针，喷于结合垫上；
18.(3)捕获抗体α-乳白蛋白鼠单抗划膜于nc膜上的t线处，羊抗兔二抗划膜于nc膜上的c线处；
19.(4)样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫依次层叠贴在所述底板上，切片组装，即得。
20.进一步，所述银包金纳米粒子通过10mm硝酸银溶液还原制备得到，其中所述10mm硝酸银溶液的添加量为1
–
5ml，和/或所述10mm硝酸银溶液的滴加速度为0.1
–
0.3ml/min。
21.进一步，所述sers探针的制备方法包括：将银包金纳米粒子与1mm的拉曼信标分子4-mba混匀后，调节ph值为7.0
–
9.0，于玻璃瓶内磁力搅拌8
–
12h，于6000
–
8000g下离心10
–
20min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针；然后加入检测抗体α-乳白蛋白兔多抗，室温振荡反应2
–
4h，调节ph值为8.0
–
9.0，加入bsa，室温振荡8
–
12h，得到sers探针；
22.其中，所述拉曼探针中银包金纳米粒子与4-mba的体积比为1000
–
2000:1；
23.和/或所述sers探针中所述检测抗体α-乳白蛋白兔多抗的添加量为20
–
60μg/ml拉曼探针溶液；
24.和/或所述sers探针中bsa的添加量为50
–
150μg/ml拉曼探针溶液。
25.进一步，还包括所述拉曼探针与所述检测抗体α-乳白蛋白兔多抗结合形成sers探针后，于6000
–
8000g下离心10
–
20min后去上清，用pbs缓冲液重悬，所述pbs缓冲液中bsa的含量为1％
–
3％；更进一步，海藻糖加入pbs缓冲液重悬后的sers探针，喷于经处理液处理后的结合垫上，其中所述海藻糖的添加量为20
–
40％；
26.和/或所述喷金量为2
–
8μl/cm；
27.和/或所述处理液为含0.5
–
2％bsa和0.5
–
2％pvp的pbs缓冲液；
28.和/或还包括所述处理液处理结合垫后甩干，于37℃干燥0.5
–
2h。
29.进一步，所述捕获抗体α-乳白蛋白鼠单抗的浓度为1
–
4mg/ml，和/或所述羊抗兔二抗的浓度为1
–
4mg/ml，和/或划膜后的nc膜于37℃干燥2
–
5h。
30.进一步，所述样品垫层叠于结合垫1
–
2mm处，和/或所述结合垫层叠于nc膜1
–
2mm
处，和/或所述吸水垫层叠于nc膜1
–
2mm处，和/或所述检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条的宽度为3
–
4mm。
31.本发明还提供上述检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条在牛乳过敏原α-乳白蛋白于5
–
10min内定性检测和高灵敏度定量检测中的应用。
32.进一步，牛乳过敏原α-乳白蛋白的检测方法包括：将待测α-乳白蛋白样品用样品缓冲液稀释滴加到所述检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条的样品垫上，随着层析与结合垫上的sers探针结合，依次流经t线和c线，通过定量仪扫描测试线和激光共聚焦拉曼仪对t线上的点进行光谱扫描进行α-乳白蛋白检测；其中：
33.(1)定性检测：5
–
10min内肉眼观察t线和c线的颜色变化：当t线显色且c线显色，表明检测结果为阳性，说明待测α-乳白蛋白样品中含有α-乳白蛋白；当t线不显色且c线显色，表明检测结果为阴性，说明待测α-乳白蛋白样品中不含有α-乳白蛋白；
34.(2)高灵敏度定量检测：用共聚焦显微拉曼仪扫描t线上785nm处的sers信号，通过拉曼信标分子4-mba特征峰处的拉曼信号强度对α-乳白蛋白进行定量分析。
35.有益效果
36.本发明以sers技术对α-乳白蛋白进行定量分析，sers信号强，指纹信息丰富且稳定，经1
–
3次累积后平滑降噪，可以检测出较高的灵敏度，制备的sers免疫层析试纸条操作简便，高效，价格低廉。
附图说明
37.图1是本发明中一种检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条的技术原理图。
38.图2是一实施例中用不同10mm硝酸银溶液添加量制备银包金纳米粒子的实物图(a)、紫外光谱图(b)和扫描电镜图(c)。
39.图3是一实施例中不同硝酸银溶液添加量制备的银包金纳米粒子对拉曼信标分子4-mba增强效果的拉曼光谱图(a)、在1078cm-1
和1587cm-1处拉曼强度(b)。
40.图4是一实施例中滴加不同浓度的α-乳白蛋白标品时sers免疫层析试纸条的实物图(a)、t线处的拉曼扫描图谱(b)以及在1611cm-1
处拉曼强度的标准曲线图(c)。
具体实施方式
41.为使本发明实施例的目的、技术方案和有点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者生产厂家建议的条件进行。
42.α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-la)是牛乳主要过敏原之一，α-la是一种单体球状钙结合金属蛋白，由123个氨基酸残基构成，占乳清蛋白的25％，分子量约为14.2kda，蛋白结构中四个二硫键和一个高亲和力的钙结合位点，这保证了二级结构的稳定性。此外，α-la的热稳定性和重折叠能力高，具有致密的球形三级结构，其潜在致敏性是由于大量表位的存在，这些表位选择性地结合ige，主要的抗原位点是42
–
49、60
–
80和91
–
96。
43.用于检测牛乳过敏原的方法主要包括免疫分析技术、液相色谱技术生物质谱技术、实时pcr和电喷雾电离质谱等，这些方法虽然灵敏度高，但需要较长的检测时间或者昂
贵的仪器设备。将sers与免疫层析技术结合起来，既具有免疫层析技术检测的即时、快速、简便、高特异性的优点，可以在5
–
10min内显色，又能结合便携拉曼仪器，建立检测物浓度与拉曼特征峰强度对应的线性关系，提高检测灵敏度，可实现目标物α-乳白蛋白的快速高效和精确定量检测。
44.本发明的设计原理是将待测α-乳白蛋白样品滴加到样品垫上，与结合垫上的sers探针上的抗体结合，sers探针中含有拉曼信标分子，到达t线时被捕获抗体捕获发生反应形成双抗体夹心结构，t线显色，多余的sers探针会随缓冲液层析与c线上的羊抗兔二抗结合，c线显色，结果通过比色法和拉曼法来获得。比色法检测是利用定量仪扫描测试线和c线的显色程度。拉曼法检测是利用激光共聚焦拉曼仪器对t线进行拉曼光谱扫描，通过分析拉曼信标分子4-mba特征峰处的峰高，建立检测物浓度与拉曼特征峰强度对应的线性关系，即可分析实际样品。
45.如下将对该技术方案、其实施过程及原理作进一步的解释说明。
46.以下实施例提供一种检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
47.(1)制备可增强拉曼信号的银包金纳米粒子；
48.(2)检测抗体α-乳白蛋白兔多抗与银包金纳米粒子、拉曼信标分子结合形成sers探针，喷于结合垫上；
49.(3)捕获抗体α-乳白蛋白鼠单抗划膜于nc膜上的t线处，羊抗兔二抗划膜于nc膜上的c线处；
50.(4)样品垫、结合垫、nc膜和吸水垫依次层叠贴在底板上，切片组装，即得。
51.在一些实施例中，采用还原法制备银包金纳米粒子。
52.进一步，加入10mm硝酸银溶液的添加量为1
–
5ml。
53.进一步，10mm硝酸银溶液的滴加速度为0.1
–
0.3ml/min。
54.在一些实施例中，制备方法包括：将银包金纳米粒子与1mm的4-mba混匀后，于玻璃瓶内磁力搅拌8
–
12h，于6000
–
8000g下离心10-20min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，加入检测抗体α-乳白蛋白兔多抗，室温振荡反应2
–
4h，加入bsa，室温振荡8
–
12h，得到sers探针。
55.进一步，拉曼探针中银包金纳米粒子与4-mba的体积比为1000
–
2000:1。
56.进一步，sers探针中检测抗体α-乳白蛋白兔多抗的添加量为20
–
60μg/ml拉曼探针溶液。
57.进一步，sers探针中bsa的添加量为50
–
150μg/ml拉曼探针溶液。
58.在一些实施例中，制备方法包括：在拉曼探针与兔多抗结合后，将体系于6000
–
8000g下离心后去上清，用pbs缓冲液重悬，pbs缓冲液中bsa含量为1％
–
3％。
59.在一优选的实施方案中，sers探针的制备方法具体包括：将纳米粒子与拉曼信标分子混合后，离心重悬，并调节ph值为7.0
–
9.0，将拉曼探针与兔多抗结合后，调节ph值至8.0
–
9.0，将sers探针于离心10
–
20min后弃上清，之后用含bsa的pbs缓冲液重悬。
60.在一些实施例中，制备方法包括：将海藻糖加入重悬后的sers探针，喷于经处理液处理后的结合垫上。
61.进一步，海藻糖的添加量为20％
–
40％。
62.进一步，喷金量为2
–
8μl/cm。
63.进一步，结合垫处理液为含0.5
–
2％bsa和0.5
–
2％pvp的pbs缓冲液。
64.进一步，在处理液处理结合垫后，甩干，并于37℃干燥0.5
–
2h。
65.在一些实施例中，制备方法包括：将捕获抗体α-乳白蛋白鼠单抗划膜于nc膜的t线处，羊抗兔二抗划膜于nc膜上的c线处，鼠单抗的浓度为1
–
4mg/ml，羊抗兔二抗的浓度为1
–
4mg/ml。
66.在一优选的实施方案中，划膜后的处理方法具体包括：将划膜后的nc膜于37℃干燥2
–
5h。
67.在一些实施例中，制备方法包括：在底板上将样品垫、结合垫、nc膜、吸水垫依次连接，完成sers免疫层析试纸条组装，样品垫叠加于结合垫上1
–
2mm处，结合垫叠加于nc膜上1
–
2mm处，吸水垫垫叠加于nc膜上1
–
2mm处，切片组装，试纸条宽度为3
–
4mm，于5
–
10min内完成α-乳白蛋白标品和样品的比色法和拉曼法的检测。
68.一优选实施例中，制备检测牛乳过敏原α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条的具体步骤如下：
69.1)银包金纳米粒子的制备
70.向250ml三角瓶中加入100ml 0.01％的氯金酸溶液，恒定搅拌加热至沸，反应温度控制在100
–
110℃；等溶液沸5min后迅速加入1％柠檬酸三钠溶液2ml，继续煮10min，等溶液颜色相对透明后停止反应，冷却至室温，用超纯水补足至100ml；向三角瓶中再次加入100ml超纯水，加热至沸腾，加入3ml 1％柠檬酸钠溶液，用注射泵以0.2ml/min的速度滴加0、1、2、3、4、5ml浓度为10mm的agno3溶液，继续加热搅拌60min，停止加热，冷却至室温，用超纯水定容至200ml，将制得的溶液以8000rpm的速度离心15min后去上清，再用超纯水复溶，保存于4℃。
71.2)sers探针的制备
72.取1ml银包金纳米粒子与10μl浓度为1mm的拉曼信标分子4-mba混匀后，调节ph值为7.0
–
9.0，于玻璃瓶内磁力搅拌12h，于6900g下离心10min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，加入20μgα-乳白蛋白兔多抗，室温振荡反应2h，调节ph值至8.0
–
9.0，加入bsa，室温振荡12h，得到sers探针，于8000g下离心后去上清，用含1％bsa的pbs缓冲液重悬。
73.3)喷金
74.用含0.5％bsa和0.5％pvp的pbs缓冲液作为结合垫处理液浸泡结合垫，甩干，烘干，在重悬后的sers探针中加入20％
–
40％的海藻糖，将此溶液喷于处理后的结合垫上，喷金量为4μl/cm，并于37℃干燥30min。
75.4)划膜
76.将捕获抗体α-乳白蛋白鼠单抗用t线稀释液稀释至浓度2mg/ml，划膜于nc膜的t线处，划膜量为1μl/cm，其中t线稀释液为含3％海藻糖的pbs缓冲液，将羊抗兔二抗用c线稀释液稀释至浓度2mg/ml，划膜于nc膜上的c线处，其中c线稀释液为含3％海藻糖的pbs缓冲液，将划膜后的nc膜于37℃干燥2h。
77.5)组装
78.在pvc底板上将样品垫、结合垫、nc膜、吸水垫依次叠加，样品垫叠加于结合垫上1
–
2mm处，结合垫叠加于nc膜上1
–
2mm处，吸水垫叠加于nc膜上1
–
2mm处，用切片机将其切成宽
度为3mm的试纸条，用卡壳组装，完成sers免疫层析试纸条的制备。
79.本发明实施例的另一个方面还提供由前述方法制备的银包金纳米粒子。
80.进一步，银包金纳米粒子的粒径在20
–
40nm之间，对拉曼信号的增强效果不同。
81.本发明实施例的另一个方面还提供由前述方法制备的α-乳白蛋白sers试纸条在标准品、实际样品检测α-乳白蛋白中的应用。
82.综上，本发明评估不同硝酸银溶液添加量制备的银包金纳米粒子的拉曼增强效果，通过透射电镜和紫外光谱扫描对纳米粒子进行表征。本发明评估α-乳白蛋白sers试纸条在肉眼、比色法、拉曼法三种检测方法下的检测限，以及与β-乳球蛋白、酪蛋白、bsa、卵清蛋白和大豆蛋白的交叉反应情况，制备的α-乳白蛋白sers试纸条在纯牛奶、椰汁、果冻爽、脱敏奶粉等实际样品中具有良好的实用性。
83.以下通过具体实施例进一步详细说明本发明的技术方案。
84.实施例1
85.(1)银包金纳米粒子的制备
86.向250ml三角瓶中加入100ml 0.01％的氯金酸溶液，恒定搅拌加热至沸，反应温度控制在100
–
110℃；等溶液沸5min后迅速加入1％柠檬酸三钠溶液2ml，继续煮10min，等溶液颜色相对透明后停止反应，冷却至室温，用超纯水补足至100ml，向三角瓶中再次加入100ml超纯水，加热至沸腾，加入3ml 1％柠檬酸钠溶液，用注射泵以0.2ml/min的速度滴加2ml浓度为10mm的agno3溶液，继续加热搅拌60min，停止加热，冷却至室温，用超纯水定容至200ml，将制得的溶液以8000rpm的速度离心15min后去上清，再用超纯水复溶，保存于4℃。
87.(2)sers探针的制备
88.取1ml银包金纳米粒子与10μl浓度为1mm的拉曼信标分子4-mba混匀后，调节ph值为8.0，于玻璃瓶内磁力搅拌12h，于8000g下离心20min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，加入40μgα-乳白蛋白兔多抗，调节ph值至9.0，室温振荡反应4h，加入bsa，室温振荡8h，即得到sers探针，于6000g下离心后去上清，用含3％bsa的pbs缓冲液重悬。
89.(3)喷金
90.用1％bsa和1％pvp的pbs缓冲液作为结合垫处理液浸泡结合垫，甩干，烘干，在重悬后的sers探针中加入25％的海藻糖，将此溶液喷于处理后的结合垫上，喷金量为4μl/cm，并于37℃干燥2h。
91.(4)划膜
92.将捕获抗体α-乳白蛋白鼠单抗用t线稀释液稀释至浓度2.5mg/ml，划膜于nc膜的t线处，划膜量为1μl/cm，其中t线稀释液为含2％海藻糖的pbs缓冲液，将羊抗兔二抗用c线稀释液稀释至浓度2mg/ml，划膜于nc膜上的c线处，其中c线稀释液为含2％海藻糖的pbs缓冲液，将划膜后的nc膜于37℃干燥3h。
93.(5)组装
94.在pvc底板上将样品垫、结合垫、nc膜、吸水垫依次叠加，样品垫叠加于结合垫上1
–
2mm处，结合垫叠加于nc膜上1
–
2mm处，吸水垫叠加于nc膜上1
–
2mm处，用切片机将其切成宽度为3mm的试纸条，用卡壳组装后完成α-乳白蛋白的sers免疫层析试纸条的制备。
95.实施例2
96.本实施方式与实施例1的不同之处是在银包金纳米粒子的制备过程中用注射泵以
0.2ml/min的速度滴加2ml浓度为10mm的agno3溶液，实施例2中用于制备sers探针的制备方法，按以下步骤进行：
97.取1ml银包金纳米粒子与15μl浓度为1mm的拉曼信标分子4-mba混匀后，调节ph值为7.5，于玻璃瓶内磁力搅拌12h，于6900g下离心15min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，加入20μgα-乳白蛋白兔多抗，调节ph值至9.0，室温振荡反应4h，加入bsa封闭，室温振荡8h，即得到sers探针，于8000g下离心后去上清，用含1％bsa的pbs缓冲液重悬。
98.结合垫处理液为0.5％bsa和0.5％pvp的pbs缓冲液，重悬后的sers探针中加入海藻糖的量为30％，喷金后干燥时间为1h，t线上包被捕获抗体α-乳白蛋白鼠单抗的浓度为2mg/ml，划膜后的nc膜于37℃干燥2h。
99.实施例3
100.本实施方式与实施例2的不同之处是在银包金纳米粒子的制备过程中滴加10mmagno3溶液的量为4ml，实施例3中用于制备sers探针的制备方法，按以下步骤进行：
101.取1ml银包金纳米粒子与20μl浓度为1mm的拉曼信标分子4-mba混匀后，调节ph值为9.0，于玻璃瓶内磁力搅拌8h，于8000g下离心20min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，加入60μgα-乳白蛋白兔多抗，调节ph值至8.5，室温振荡反应4h，加入bsa封闭液，室温振荡10h，即得到sers探针，于8000g下离心后去上清，用含2％bsa的pbs缓冲液重悬。
102.结合垫处理液为1％bsa和1％pvp的pbs缓冲液，重悬后的sers探针中加入海藻糖的量为35％，喷金量为5μl/cm，c线上包被检测抗体羊抗兔二抗的浓度为4mg/ml，划膜后的nc膜于37℃干燥4h。
103.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。