一种细胞因子联合检测用试纸条、制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种细胞因子联合检测用试纸条、制备方法及其应用。


背景技术：

2.细胞因子主要包括淋巴细胞刺激因子il-1β、t细胞生长因子il-2、白细胞介素6il-6、白细胞介素-8il-8和白介素10il-10，每种细胞因子均对细胞活动具有极大的影响，在进行疾病检测时，需要对这几个细胞因子参数进行检测。
3.目前，在对各种细胞因子进行检测的过程中，通常是针对每种细胞因子进行检测，采用单一项目检测试纸对标志物进行检测，无法同时进行测试，因此亟待找到一种可以同时实现多项细胞因子标志物进行测试的试纸。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种细胞因子联合检测用试纸条、制备方法及其应用，从而解决现有技术中存在的前述问题。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种细胞因子联合检测用试纸条，包括支撑板、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水垫和样品垫，其中，所述支撑板为长条结构，位于最底部，在所述支撑板上方依次设置所述样品垫、所述玻璃纤维素膜、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫；所述硝酸纤维素膜上依次设置有il-1β、il-8、il-2、il-6、il-10检测线和质控线；所述玻璃硝酸纤维素膜包含有量子点标记的il-1β抗体、量子点标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体和量子点标记的鸡igy。
7.优选的，所述样品垫的顶端压住所述玻璃纤维素膜的底端并与之粘贴，所述玻璃纤维素膜的顶端压住所述硝酸纤维素膜的底端并与之粘贴，所述硝酸纤维素膜的顶端被所述吸水滤纸的底端压住并与之粘贴。
8.优选的，所述il-1β、il-8、il-2、il-6、il-10检测线和质控线间隔4-6mm。
9.本发明的另一个目的在于提供一种细胞因子联合检测用试纸条的制备方法，包括以下步骤：
10.s1，制备量子点标记的il-1β抗体：采用mes缓冲液稀释量子点微球颗粒，加入羧甲基纤维素钠和活化剂，活化10-20min后，加入终止剂后反应10-20min；按照il-1β抗体与量子点微球质量比为1：20的比例加入抗体，经混匀和离心处理后得到量子点标记的il-1β抗体；
11.s2，制备量子点标记的il-8抗体、il-2抗体、il-6、il-10和鸡igy抗体:按照步骤s1中同样的方法分别制备量子点标记的il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和鸡igy抗体；
12.s3，制备包含有抗体混合物的玻璃纤维素膜：将量子点标记的il-1β抗体、量子点
标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体和量子点标记的鸡igy抗体按质量比1：1：1：1：1：1混合后，喷涂于玻璃纤维素膜上，干燥后即得量子点标记的il-1β抗体、量子点标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体、量子点标记的鸡igy抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；
13.s4，制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，按一定的间隔依次划分检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线，然后分别取il-1β抗体、il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和羊抗鸡igy，分别喷涂到对应的检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线上，干燥后即得硝酸纤维素膜；
14.s5，组装试纸条：在塑料板上放置步骤s4制备的硝酸纤维素膜,将步骤s3制备的玻璃纤维素膜压在所述硝酸纤维素膜靠近检测线的一端，然后在玻璃纤维素的一端放置样品垫，硝酸纤维素膜的另一端放置吸水垫，干燥后即完成试纸条的组装过程。
15.优选的，步骤s1中，量子点微球颗粒与mes缓冲液的体积比为1：10；活化剂采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；终止剂采用β巯基乙醇和赖氨酸。
16.更进一步的，采用mes缓冲液稀释量子点微球颗粒，加入羧甲基纤维素钠和活化剂，活化10-20min后，加入终止剂后反应10-20min具体为：取0.02m，ph＝5.5～6.5的mes缓冲液100ul,混合加入10ul浓度100mg/ml的量子点微球颗粒，然后加入羧甲基纤维素钠100mg，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化10-20min后，加入β巯基乙醇，终浓度为5mm，加入赖氨酸，终浓度为10mm，反应10-20min。
17.优选的，步骤s1中，所述经混匀和离心处理后得到量子点标记的il-1β抗体具体包括：混匀3-3.5h后，8000-15000rpm离心15-30min，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1-1.5h，之后8000-15000rpm离心15-30min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的il-1β抗体。
18.优选的，步骤s4中分别取il-1β、il-8、il-2、il-6、il-10和羊抗鸡igy，分别喷涂到对应的检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线上，具体包括：分别取浓度均为1mg/ml的il-1β、il-8、il-2、il-6、il-10和羊抗鸡igy，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维膜的检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线上。
19.优选的，步骤s5中，组装过程中，所述吸水垫长度为40-45mm，所述吸水垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1-2mm；所述玻璃纤维素膜的长度为6-8mm，所述玻璃纤维素膜与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1-2mm；所述样品垫的长度为40-50mm，所述样品垫与所述玻璃纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1-2mm。
20.优选的，步骤s3、s4和s5中的干燥过程均采用37℃干燥3-5h。
21.本发明的最后一个目的在于提供细胞因子检测用试纸条在细胞因子检测试剂盒中的应用。
22.本发明的有益效果是：
23.本发明公开了一种细胞因子检测用试纸条、制备方法及其应用，该试纸条以羧甲基纤维素钠系统进行量子点标记，将量子点标记的il-1β抗体、量子点标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体混合物包被在玻璃纤维素膜上，作为检测探针，利用竞争法原理结合量子点的荧光特性实现了采用荧光免疫
层析的方法，同时对细胞因子，包括il-1β、il-8、il-2、il-6、il-10进行快速、特异、简便、灵敏的联合检测。
附图说明
24.图1是实施例1中提供的细胞因子检测用试纸条结构示意图；
25.1是样品垫，2是支撑板，3是玻璃纤维素膜，4是硝酸纤维素膜，5是吸水垫，6是il-1β检测线，7是il-8检测线，8是il-2检测线，9是il-6检测线，10是il-10检测线，11是质控线。
具体实施方式
26.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
27.实施例1
28.本实施例提供了一种细胞因子联合检测用试纸条，该试纸条结构如图1所示，包括支撑板、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水垫和样品垫，其中，所述支撑板为长条结构，位于最底部，在所述支撑板上方依次设置所述样品垫、所述玻璃纤维素膜、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫；所述硝酸纤维素膜上依次设置有il-1β、il-8、il-2、il-6、il-10检测线和质控线；所述玻璃硝酸纤维素膜包含有量子点标记的il-1β抗体、量子点标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体混合物和量子点标记的igy。
29.本实施例中的试纸条的结构中，所述样品垫的顶端压住所述玻璃纤维素膜的底端并与之粘贴，所述玻璃纤维素膜的顶端压住所述硝酸纤维素膜的底端并与之粘贴，所述硝酸纤维素膜的顶端被所述吸水滤纸的底端压住并与之粘贴。硝酸纤维素膜上设置检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线，分别对应il-1β、il-8、il-2、il-6、il-10检测线和质控线，每个检测线分别间隔4-6mm，可根据实际的试纸条长度进行设置。
30.实施例2
31.本实施例提供了一种细胞因子联合检测用试纸条的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
32.s1，制备量子点标记的il-1β抗体：取0.02m，ph＝6.1的mes缓冲液100ul,混合加入到10ul浓度为100mg/ml的量子点微球颗粒中，然后加入羧甲基纤维素钠100mg，加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化15min后，加入β巯基乙醇，终浓度为5mm，加入赖氨酸，终浓度为10mm，反应15min。
33.按照il-1β抗体与量子点微球质量比为1：20的比例在量子点微球颗粒中加入il-1β抗体，混匀3h后，8000rpm离心20min，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1h，之后8000rpm离心20min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的il-1β抗体；
34.s2，制备量子点标记的il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和鸡igy抗体：按照步骤s1中同样的方法分别制备量子点标记的il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和鸡igy抗体；
35.s3，制备包含有抗体混合物的玻璃纤维素膜：将量子点标记的il-1β抗体、量子点
标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体和量子点标记的鸡igy抗体按质量比1：1：1：1：1：1混合后，喷涂于玻璃纤维素膜上，干燥后即得量子点标记的il-1β抗体、量子点标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体、量子点标记的鸡igy抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；
36.s4,制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔6mm依次划分检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线，然后分别取il-1β抗体、il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和羊抗鸡igy，分别喷涂到对应的检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线上，干燥后即得硝酸纤维素膜；
37.s5，组装试纸条：在塑料板上放置步骤s4制备的硝酸纤维素膜,将步骤s3制备的玻璃纤维素膜压在所述硝酸纤维素膜靠近检测线的一端，然后在玻璃纤维素的一端放置样品垫，硝酸纤维素膜的另一端放置吸水垫，干燥后即完成试纸条的组装过程。
38.其中，组装过程中，采用的所述吸水垫长度为45mm，所述吸水垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1mm；所述玻璃纤维素膜的长度为6mm，所述玻璃纤维素膜与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1mm；所述样品垫的长度为25mm，所述样品垫与所述玻璃纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1mm。
39.实施例3
40.本实施例提供了一种细胞因子联合检测用试纸条的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
41.s1，制备量子点标记的il-1β抗体：取0.02m，ph＝6.5的mes缓冲液100ul,混合加入到10ul浓度为100mg/ml的量子点微球颗粒中，然后加入羧甲基纤维素钠100mg，加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化15min后，加入β巯基乙醇，终浓度为5mm，加入赖氨酸，终浓度为10mm，反应15min。
42.按照il-1β抗体与量子点微球质量比为1：20的比例在量子点微球颗粒中加入il-1β抗体，混匀3h后，15000rpm离心10min，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1h，之后15000rpm离心10min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的il-1β抗体；
43.s2，制备量子点标记的il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和鸡igy抗体:按照步骤s1中同样的方法分别制备量子点标记的il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和鸡igy抗体；
44.s3，制备包含有抗体混合物的玻璃纤维素膜：将量子点标记的il-1β抗体、量子点标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体和量子点标记的鸡igy抗体按质量比1：1：1：1：1：1混合后，喷涂于玻璃纤维素膜上，37℃干燥4h，即得量子点标记的il-1β抗体、量子点标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体和量子点标记的鸡igy抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；
45.s4,制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔4mm依次划分检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线，然后分别取il-1β抗体、il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和羊抗鸡igy，分别喷涂到对应的检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线上，干燥后即得硝酸纤维素膜；
46.s5，组装试纸条：在塑料板上放置步骤s4制备的硝酸纤维素膜,将步骤s3制备的玻璃纤维素膜压在所述硝酸纤维素膜靠近检测线的一端，然后在玻璃纤维素的一端放置样品垫，硝酸纤维素膜的另一端放置吸水垫，干燥后即完成试纸条的组装过程。
47.其中，组装过程中，采用的所述吸水垫长度为40mm，所述吸水垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为2mm；所述玻璃纤维素膜的长度为8mm，所述玻璃纤维素膜与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为2mm；所述样品垫的长度为27mm，所述样品垫与所述玻璃纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为2mm。
48.实施例4
49.本实施例提供了一种细胞因子检测用试纸条的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
50.s1，制备量子点标记的il-1β抗体：取0.02m，ph＝5.5的mes缓冲液100ul,混合加入到10ul浓度为100mg/ml的量子点微球颗粒中，然后加入羧甲基纤维素钠100mg，加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化10min后，加入β巯基乙醇，终浓度为5mm，加入赖氨酸，终浓度为10mm，反应10min。
51.按照il-1β抗体与量子点微球质量比为1：20的比例在量子点微球颗粒中加入il-1β抗体，混匀3.5h后，10000rpm离心20min，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1.5h，之后10000rpm离心20min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的il-1β抗体；
52.s2，制备量子点标记的il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和鸡igy抗体：按照步骤s1中同样的方法分别制备量子点标记的il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和鸡igy抗体；
53.s3，制备包含有抗体混合物的玻璃纤维素膜：量子点标记的il-1β抗体、量子点标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体混合物和量子点标记的鸡igy抗体按质量比1：1：1：1：1：1混合后，喷涂于玻璃纤维素膜上，干燥后即得量子点标记的il-1β抗体、量子点标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体混合物、量子点标记的鸡igy抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；
54.s4,制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔5mm依次划分检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线，然后分别取il-1β抗体、il-8抗体、il-2抗体、il-6抗体、il-10抗体和羊抗鸡igy抗体，分别喷涂到对应的检测线5、检测线4、检测线3、检测线2、检测线1和质控线上，干燥后即得硝酸纤维素膜；
55.s5，组装试纸条：在塑料板上放置步骤s4制备的硝酸纤维素膜,将步骤s3制备的玻璃纤维素膜压在所述硝酸纤维素膜靠近检测线的一端，然后在玻璃纤维素的一端放置样品垫，硝酸纤维素膜的另一端放置吸水垫，37℃下干燥5h后即完成试纸条的组装过程。
56.其中，组装过程中，采用的所述吸水垫长度为42mm，所述吸水垫与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.5mm；所述玻璃纤维素膜的长度为7mm，所述玻璃纤维素膜与所述硝酸纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.5mm；所述样品垫的长度为26mm，所述样品垫与所述玻璃纤维素膜重叠粘贴在一起的重叠长度为1.5mm。
57.实施例5
58.本实施例提供一种细胞因子检测试剂盒，该试剂盒中包括实施例1中提供的细胞
因子联合检测用试纸条，使用该试剂盒，能够同时测试il-1β、il-8、il-2、il-6和il-10。
59.首先将il-1β、il-8、il-2、il-6和il-10溶解为多个梯度的标准品溶液，并同时配制空白溶液。分别取标准品和待测样品滴入试纸条样品槽中，将显色完成的试纸条放入荧光免疫层析读数仪中，读取并记录t/c线的发光值，绘制il-1β、il-8、il-2、il-6和il-10监测标准曲线；将待测样品的t/c值带入标准曲线中，得到il-1β、il-8、il-2、il-6和il-10浓度结果。
60.为了对比测试结果，本技术将实施例1中得到的试剂盒进行测试，得到的数据如下表所示：
61.62.63.[0064][0065]
通过采用本发明公开的上述技术方案，得到了如下有益的效果：
[0066]
本发明公开了一种细胞因子联合检测用试纸条、制备方法及其应用，该试纸条以羧甲基纤维素钠系统进行量子点标记的il-1β抗体、量子点标记的il-8抗体、量子点标记的il-6抗体、量子点标记的il-2抗体、量子点标记的il-10抗体混合物包被在玻璃纤维素膜上，作为检测探针，利用双抗体夹心法原理结合量子点的荧光特性实现了采用荧光免疫层析的方法，同时对il-1β、il-8、il-2、il-6、il-10进行快速、特异、简便、灵敏的联合检测。
[0067]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。